Summary
Descrevemos um método simples e eficiente para isolar células do epitélio pigmentado da retina (EPR) de olhos de cobaias pigmentadas jovens. Este procedimento permite o acompanhamento de estudos de biologia molecular do EPR isolado, incluindo análises de expressão gênica.
Abstract
Este protocolo descreve o isolamento de células do epitélio pigmentado da retina (EPR) dos olhos de cobaias pigmentadas jovens para potencial aplicação em estudos de biologia molecular, incluindo análises de expressão gênica. No contexto da regulação do crescimento ocular e miopia, o EPR provavelmente desempenha um papel como um relé celular para sinais modulatórios de crescimento, uma vez que está localizado entre a retina e as duas paredes do olho, como a coroide e a esclera. Embora protocolos para isolar o PSE tenham sido desenvolvidos tanto para pintos quanto para camundongos, esses protocolos provaram não ser diretamente traduzíveis para a cobaia, que se tornou um modelo importante e amplamente utilizado de miopia em mamíferos. Neste estudo, ferramentas de biologia molecular foram usadas para examinar a expressão de genes específicos para confirmar que as amostras estavam livres de contaminação dos tecidos adjacentes. O valor desse protocolo já foi demonstrado em um estudo de RNA-Seq de PSE de cobaias pigmentadas jovens expostas ao desfoco óptico indutor de miopia. Além da regulação do crescimento ocular, esse protocolo tem outras aplicações potenciais em estudos de doenças retinianas, incluindo maculopatia míope, uma das principais causas de cegueira em miopes, na qual o EPR tem sido implicado. A principal vantagem desta técnica é que é relativamente simples e, uma vez aperfeiçoada, produz amostras de EPR de alta qualidade adequadas para estudos de biologia molecular, incluindo análise de RNA.
Introduction
O EPR compreende uma única monocamada de células pigmentadas localizada entre a retina neural e a coroide vascular, e o EPR tem papéis bem reconhecidos no desenvolvimento e manutenção da função normal da retina, incluindo a fototransdução 1,2. Mais recentemente, foi atribuído à PSE um papel fundamental adicional na regulação do crescimento ocular3 e, portanto, no desenvolvimento da miopia4. Essa atribuição baseia-se na localização crítica da PSE, interposta entre a retina e a coroide, e na aceitação agora ampla de que o crescimento ocular e, portanto, os erros refrativos são reguladoslocalmente5. Acredita-se que a PSE desempenhe um papel fundamental como relé de sinal, ligando a retina, fonte presumida de sinais modulatórios de crescimento, à coroide e esclera, os dois alvos dos sinais retransmitidos 6,7,8.
O aumento do comprimento axial que caracteriza a maioria das miopias não pode ser considerado benigno, com alterações fisiopatológicas envolvendo retina, coroide e/ou esclera representando consequências inevitáveis e agora bem reconhecidas doalongamento ocular excessivo7,9. Nesse contexto, o EPR talvez seja o mais vulnerável, pois, sendo um tecido não mitótico, só é capaz de acomodar a câmara vítrea em expansão pelo estiramento e afinamento de células individuais. Embora seu papel em patologias relacionadas à miopia, como a degeneração macular míope, ainda não seja totalmente compreendido, o EPR tem sido implicado na patogênese de uma série de outras doenças retinianas, incluindo a atrofia geográfica, uma das principais causas de cegueira, que está associada a anormalidades documentadas na retina, PSE e coroide10,11, 12º.
O isolamento bem-sucedido de células de EPR, livres de contaminação de tecidos oculares adjacentes, potencialmente abre muitas oportunidades de pesquisa para obter novos insights sobre os mecanismos subjacentes a uma variedade de doenças oculares/retinianas. Entretanto, o isolamento da PSE tem se mostrado desafiador, com muitos estudos publicados fazendo uso da combinação retina/PSE ou PSE/coroide por esse motivo13,14,15. Estudos envolvendo o sucesso do isolamento do EPR de qualidade adequada para estudos de biologia molecular têm sido limitados a olhos de pintinhos e camundongos16,17. Por exemplo, o método simultâneo de isolamento de PSE e estabilização de RNA (SRIRS) descrito por Wang et al.18. Isolar células RPE em camundongos não parece funcionar bem em olhos de cobaias. O protocolo aqui descrito representa um refinamento de uma abordagem que foi inicialmente prototipada com olhos de musaranho por um dos autores (M.F.) e provou produzir amostras de EPR de alta qualidade, apropriadas para análises de RNA e outras análises de biologia molecular, a partir de olhos de cobaias pigmentadasjovens19.
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Protocol
Todos os cuidados e tratamentos com animais utilizados neste estudo estão em conformidade com a Declaração ARVO para o Uso de Animais em Pesquisa Oftalmológica e da Visão. Os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Califórnia, Berkeley.
1. Enucleação do olho da cobaia
- Eutanásia de uma cobaia com uma injeção intracardíaca de pentobarbital sódico administrada sob anestesia (isoflurano a 5% em oxigênio).
- Enuclear os olhos com o auxílio de pinça e tesoura e transferi-los imediatamente para uma placa de Petri de 10 cm com solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS) para lavagem. Transfira os olhos para uma solução de PBS fresca.
NOTA: Recomenda-se uma placa de 6 poços contendo 4 mL de solução por poço.
2. Isolamento da taça ocular posterior e do complexo PSE/coroide/esclera
- Com o auxílio de um microscópio dissecante, utilizar uma agulha 18G para fazer uma pequena incisão inicial na esclera, aproximadamente 1,0 mm atrás do limite limbal (isto é, entre a córnea e a esclera) (Figura 1A); Em seguida, use tesoura para remover o segmento anterior, incluindo córnea, íris, corpo ciliar e cristalino.
- Em seguida, trabalhando com a taça do segmento ocular posterior restante, desprenda a retina do complexo PSE/coroide/esclera; usar pinça para primeiro agarrar e, em seguida, puxar suavemente a zônula de Zinn e, em seguida, descascar progressivamente a retina sem fragmentação (Figura 1B).
NOTA: A retina não deve ser captada diretamente para evitar fragmentação retiniana e isolamento incompleto do tecido retiniano. O uso de um microscópio é essencial para esta etapa de dissecção.
3. Isolamento da PSE da coroide
- Após a remoção completa da retina, mergulhe o copo ocular posterior restante, que inclui o EPR, a coroide e a esclera, no reagente de armazenamento de tecido por 5 min (consulte a Tabela de Materiais).
OBS: Utilizar uma placa de 12 poços com poços identificados, cada um preenchido com 2 mL do reagente de armazenamento de tecido. - Transfira o copo para outro poço preenchido com 4 mL de PBS por 10 s antes de movê-lo para um terceiro poço preenchido com 2 mL de PBS.
- Anexe uma agulha de 30 G a uma seringa de 1 mL preenchida com PBS para a etapa final de isolamento do EPR. Empurre suavemente a seringa para criar uma corrente de jato de PBS; primeiro, direcione essa corrente para o EPR para fazer um pequeno rasgo ou furo nele e, em seguida, direcione o fluxo de PBS para a abertura criada para separar o EPR como uma folha da coroide (Figura 1C).
Observação : O descolamento do RPE como uma folha produz a maior amostra de RPE. Novamente, o uso de um microscópio é essencial para essa etapa. - Após o descolamento do EPR da coroide (Figura 1D), colete o tecido do EPR em uma seringa de 1 mL sem agulha e, em seguida, transfira a amostra coletada para um tubo de 1,5 mL.
- Centrifugar o tubo de 1,5 mL com o EPR coletado a 8.000 × g por 1 min para obter um pellet de EPR (Figura 2A).
- Eliminar a solução PBS e substituí-la por 350 ml de tampão de lise, conforme incluído nos kits de isolamento de ARN (ver Tabela de Materiais); pipeta 20x para misturar e, assim, preservar a qualidade da amostra. Para armazenamento e conservação a longo prazo, transfira as amostras para um congelador de -80 °C.
NOTA: O tampão de lise é um componente proprietário do kit de isolamento de RNA para lise de células e tecidos antes do isolamento de RNA e isolamento simultâneo de RNA/DNA/proteína. Para inativar as RNAses no lisado, certifique-se de adicionar β-mercaptoetanol ao tampão de lise (10 μL de β-mercaptoetanol por 1 mL de tampão de lise).
4. Extração de RPE-RNA
- Use um kit de isolamento de RNA (consulte a Tabela de Materiais) para isolar e coletar o RNA das amostras de EPR seguindo as instruções fornecidas pelo fabricante. Avaliar a qualidade da amostra por eletroforese.
NOTA: O protocolo descrito produziu um produto de boa qualidade (ou seja, número de integridade de RNA [RIN] acima de 8,0).
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Representative Results
A análise das amostras de EPR coletadas pelo protocolo acima mostrou RNA bem preservado (RIN >8,0, Figura 2B), com 240,2 ng ± 35,1 ng por olho (n = 8, NanoDrop, Figura 2B). Para avaliar melhor a qualidade das amostras isoladas de EPR, particularmente a ausência de contaminantes coroidais e esclerais, examinamos a expressão de genes representativos para cada um destes últimos tecidos nas amostras deEPR19. As amostras de EPR demonstraram uma expressão significativamente maior de Rpe65 (um gene específico de EPR) em comparação com os níveis de expressão de Rpe65 na coroide e esclera (Tabela 1 e Figura 2C). Em contraste, as amostras de EPR apresentaram expressão mínima de Col1a1, o gene específico da esclera da coroide selecionado (Figura 2D).
Figura 1: Procedimento para coleta das folhas de EPR . (A) Olho de cobaia de 2 semanas com a primeira incisão. (B) O segmento anterior (córnea, íris e lente), vítreo e retina são então separados da taça ocular posterior (PSE, coroide e esclera). (C) Uma corrente de jato de PBS, fornecida através de uma agulha de 30 G, é usada para separar o EPR (D) como uma folha (setas pretas) da coroide. O procedimento desde a primeira incisão até a coleta da PSE leva de 5 a 7 min. Abreviação: PSE = epitélio pigmentado da retina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Procedimento para avaliação da qualidade das amostras isoladas de EPR. (A) Imagem representativa de uma amostra de EPR em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL após ser girada. (B) Produção representativa do bioanalisador para o RNA extraído das amostras de EPR coletadas. (C,D) Os níveis de expressão gênica de Rpe65, um gene específico para EPR, e Col1a1, que não é ou é minimamente expresso no EPR, medido por RT-qPCR nas amostras de EPR, coroide e escleral de n = 3 animais não tratados; Ambos os conjuntos de dados foram normalizados para β-actina. ** P < 0,01; P < 0,001. Esse valor foi modificado de Goto et al.19. Abreviações: PSE = epitélio pigmentado da retina; β-actina = beta-actina; Col1a1 = colágeno tipo I cadeia alfa-1; Rpe65 = isomerohidrolase retinóide; RT-qPCR = reação em cadeia da polimerase quantitativa com transcrição reversa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Gene | Primer Avançado (5' a 3') | Primer reverso (5' a 3') | ||||
| Col1a1 | GCCTCAGGCAAGACAGTCATT | GCTAACGGTAAAGCCGAATTCC | ||||
| RPE65 | GCCCTTCTGCACAAGTTTGAC | CAGTGCGGATGAACCTTCTGT | ||||
| β-actina | GGCCGAGCGGGAAATT | CCAGGGCAACATAGCATAGCTT | ||||
Tabela 1: Sequências de nucleotídeos dos primers utilizados para amplificação por PCR na análise da qualidade da amostra. Abreviações: β-actina = Beta-actina; Col1a1 = colágeno tipo I cadeia alfa 1; Rpe65 = isomerohidrolase retinóide.
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Discussion
Neste artigo, descrevemos um método de isolamento do EPR, apropriado para análises da expressão do gene do EPR, dos olhos de cobaias jovens e pigmentadas. O mérito deste protocolo é que ele produz amostras de EPR de alta qualidade que são relativamente livres de contaminação, com RNA adequadamente preservado para análises específicas de RNA e, ainda assim, é relativamente simples e eficiente. Enquanto no exemplo fornecido aqui, as amostras de EPR foram coletadas dos olhos de uma cobaia jovem (2 semanas de idade), o protocolo também foi usado com sucesso para coletar amostras de EPR de animais mais velhos (adultos jovens).
Para pesquisadores com experiência prévia mínima com cirurgia ou dissecção ocular, as etapas 2.1 e 2.2 do protocolo podem ser desafiadoras. O detalhe crítico do passo 2.1 é a localização da incisão inicial na esclera, que deve ser colocada com precisão 1,0 mm atrás do limbo para que a íris e a lente sejam removidas juntamente com a córnea ao desprender o segmento anterior. Se, em vez disso, a íris permanecer aderida ao segmento ocular posterior, é difícil encontrar a zônula de Zinn, que é fundamental para descolar a retina com sucesso na próxima etapa. Como observado no protocolo, para o sucesso do descolamento da retina, também é fundamental que a retina não seja agarrada diretamente com a pinça para evitar sua fragmentação. A retina da cobaia parece mais frágil que a de camundongos, provavelmente por sua naturezaavascular20. Idealmente, a taça ocular posterior isolada, composta pelo EPR, coroide e esclera, deve ser imersa em reagente de armazenamento tecidual dentro de 5 min após a enucleação ocular para garantir a preservação adequada do RNA na amostra de EPR coletada.
O método SRIRS, que foi desenvolvido com o propósito específico de coletar amostras de alta qualidade de EPR dos olhos de camundongos, parece ter alcançado esse objetivo para olhos de camundongos; relata-se que é eficiente e eficaz18. Essa técnica também tem sido utilizada com sucesso na coleta de PSE de olhos humanos saudáveis de doadores21. No entanto, com base na experiência dos autores, este método SRIRS não é adequado para coletar PSE dos olhos da cobaia, musaranho e gambá, embora as razões subjacentes para isso não sejam claras. Ao relatar a técnica aqui descrita para isolar e coletar PSE dos olhos de cobaias jovens, esperamos abordar uma importante necessidade não atendida no campo de pesquisa em miopia.
Quanto às limitações do protocolo descrito, a principal delas é a necessidade de um período de treinamento prático para garantir a coleta eficiente das amostras, pois o tempo para o preenchimento é fundamental, além da pureza das amostras de PSE coletadas. Pesquisadores que não têm experiência com microdissecção ou cirurgia ocular serão os que mais precisarão de treinamento. Embora vários métodos de isolamento de EPR tenham sido relatados22,23, o método descrito aqui não é adequado para culturas de células de EPR ou análises de proteínas devido ao uso de um reagente estabilizador de RNA.
A EPR tem sido reconhecida por desempenhar papéis críticos não apenas na manutenção da saúde e função da retina, mas também em doenças relacionadas. O fato de que o EPR agora também é reconhecido por desempenhar um papel fundamental na regulação do crescimento ocular e no desenvolvimento da miopia ampliou consideravelmente o escopo das questões de pesquisa, para as quais a capacidade de coletar amostras de EPR de alta qualidade dos olhos de cobaias, como descrito aqui, ou de outros mamíferos usados como modelos animais pode ser a chave para fornecer novos insights. Tais estudos também podem oferecer novos insights sobre as complicações patológicas da miopia, incluindo maculopatia míope, para a qual se pode esperar que os números de prevalência aumentem em paralelo com os valores de prevalência de miopia per se.
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Disclosures
Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este estudo é apoiado pela Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência Bolsas de Pesquisa no Exterior (S.G.), um bolsista de pós-doutorado de Loris e David Rich (S.G.), e uma bolsa do Instituto Nacional de Olhos dos Institutos Nacionais de Saúde (R01EY012392; C.F.W.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Syringe with Slip Tip | Bd Vacutainer Labware Medical | 22-253-260 | |
| 2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | |
| 6 Well Tissue Culture Plate with Lid, Flat Bottom, Sterile | pectrum Chemical Mfg. Corp | 970-95008 | |
| 12 Well Tissue Culture Plate with Lid, Individual, Sterile | Thomas Scientific LLC | 1198D72 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | automated electrophoresis to check RNA quality | ||
| Balanced Salt Solutions | Gibco | 10010031 | |
| Bonn Micro Forceps, Straight Smooth, 0.3 mm Tip, 7 cm | Fine Science Tools, Inc. | 11083-07 | |
| Dumont forceps no. 5 | ROBOZ | RS-5045 | |
| Hypodermic disposable needles | Exelint International, Co. | 26419 | |
| Hypodermic disposable needles | Exelint International, Co. | 26437 | |
| MiniSpin Microcentrifuges | Eppendorf | 540108 | Max. Speed: 8,000 g |
| RNAlater Stabilization Solution | Invitrogen | AM7020 | tissue storage reagent |
| RNeasy Mini kits | Qiagen | 74104 | RNA isolation kit |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools, Inc. | 91500-09 |
References
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