免疫蛍光アッセイ による 患者由来卵巣がんオルガノイド中のDNA損傷修復タンパク質の可視化(英語)
Summary
本プロトコルは、患者由来卵巣癌オルガノイドにおけるDNA損傷修復タンパク質を評価するための方法を記載する。ここには、包括的なめっきおよび染色方法、および詳細で客観的な定量手順が含まれています。
Abstract
免疫蛍光法は、標的抗原を高い感度と特異性で可視化するために最も広く使用されている技術の1つであり、タンパク質、糖鎖、および低分子の正確な同定と局在を可能にします。この技術は2次元(2D)細胞培養では十分に確立されていますが、3次元(3D)細胞モデルでの使用についてはあまり知られていません。卵巣がんオルガノイドは、腫瘍細胞のクローン不均一性、腫瘍微小環境、細胞間および細胞マトリックス相互作用を再現する3D腫瘍モデルです。したがって、それらは、薬剤感受性および機能的バイオマーカーの評価において細胞株よりも優れている。したがって、原発性卵巣癌オルガノイドで免疫蛍光を利用する能力は、この癌の生物学を理解する上で非常に有益です。現在の研究では、高悪性度の漿液性患者由来の卵巣癌オルガノイド(PDO)中のDNA損傷修復タンパク質を検出するための免疫蛍光法について説明しています。PDOを電離放射線にさらした後、無傷のオルガノイドに対して免疫蛍光法を行い、核タンパク質を病巣として評価します。画像は、共焦点顕微鏡上のzスタックイメージングを使用して収集され、自動焦点計数ソフトウェアを使用して分析されます。記載された方法は、DNA損傷修復タンパク質の時間的および特別な動員の分析、ならびにこれらのタンパク質と細胞周期マーカーとの共局在を可能にする。
Introduction
卵巣がんは、婦人科の悪性腫瘍による主要な死因です。患者の大多数はカルボプラチンなどのDNA損傷薬で治療されており、相同組換え修復(HRR)欠損腫瘍の患者には、ポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼ(PARP)阻害剤を投与することができます1,2。しかし、ほとんどの患者はこれらの治療法に対する耐性を発達させ、診断から5年以内に死亡します。DNA損傷応答(DDR)の調節不全は、卵巣癌の発症、および化学療法とPARP阻害剤耐性の両方に関連しています3。したがって、DDRの研究は、卵巣癌の病態生理学、潜在的なバイオマーカー、および新しい標的療法を理解する上で不可欠です。
DDRを評価する現在の方法は、免疫蛍光(IF)を利用しており、これにより、DNA損傷タンパク質およびヌクレオチド類似体の正確な同定および局在化が可能になる。DNAに二本鎖切断(DSB)があると、ヒストンタンパク質H2AXは急速にリン酸化され、DNA損傷修復タンパク質が集まる焦点を形成します4。このリン酸化は、IFを利用して容易に同定することができる。実際、ɣ-H2AXアッセイは、DSB 5,6,7,8,9の誘導を確認するために一般的に採用されています。DNA損傷の増加は、プラチナ感受性およびDNA損傷剤の有効性と関連しており10、11、12、およびɣ-H2AXは、他の癌治療における化学療法応答に関連するバイオマーカーとして提案されている13。DSBでは、HRRに堪能な細胞が一連のイベントを実行し、BRCA1およびBRCA2がRAD51をリクルートして複製タンパク質A(RPA)を置き換え、DNAに結合します。HRR修復は、DNAテンプレートを使用してDSBを忠実に修復します。しかし、腫瘍がHRRを欠損している場合、それらは非相同末端結合(NHEJ)などの代替修復経路に依存する。NHEJはエラーを起こしやすいことが知られており、細胞に高い突然変異負荷を生じさせ、53BP1を正の調節因子として使用する14。これらのDNA損傷タンパク質は、いずれもIFを用いて病巣として正確に同定することができる。IFは、タンパク質の染色に加えて、フォーク保護と一本鎖DNAギャップ形成の研究にも使用できます。安定したフォークを有する能力は白金応答と相関しており、そして最近、ギャップアッセイはPARP阻害剤に対する応答を予測する可能性を示している6、15、16、17。したがって、ゲノムへの導入後のヌクレオチド類似体に対する染色は、DDRを研究する別の方法である。
今日まで、卵巣癌におけるDDRの評価は、in vivo腫瘍のクローン不均一性、微小環境、または構造を再現しない均質な2D細胞株に大きく限定されていました18,19。最近の研究では、DDRメカニズム6などの複雑な生物学的プロセスの研究において、オルガノイドが2D細胞株よりも優れていることが示唆されています。本手法では、PDO中のRAD51、ɣ-H2AX、53BP1、RPA、およびゲミニンを評価します。これらの方法は、インタクトなオルガノイドを評価し、in vivo腫瘍微小環境により類似した環境でのDDRメカニズムの研究を可能にします。共焦点顕微鏡および自動病巣カウントとともに、この方法論は卵巣癌のDDR経路を理解し、患者の治療計画をパーソナライズするのに役立ちます。
Protocol
Representative Results
Discussion
DNA損傷応答は、卵巣癌の発症と化学療法抵抗性の両方に不可欠な役割を果たします。したがって、DNA修復メカニズムを完全に理解することが不可欠です。ここでは、DNA損傷修復タンパク質を3Dのインタクトオルガノイドで研究するための方法論を紹介します。DNA損傷、相同組換え、非相同末端結合、および複製ストレスを評価するために、ホールマーク抗体を利用して再現性のある信頼性の?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
このプロトコルを確立する際のパベル・ロバチェフスキー博士の指導に感謝しています。また、セントルイスのワシントン大学医学部の産婦人科および婦人科腫瘍学部門、ワシントン大学の学部長の奨学生プログラム、婦人科腫瘍学グループ財団、および生殖科学者開発プログラムにも感謝しますこのプロジェクトを支援してくださったこと。
Materials
| 1x phosphate buffered saline with calcium and magnesium (PBS++) | Sigma | 14-040-133 | |
| 1x phosphate buffered saline without calcium and magnesium (PBS) | Fisher Scientific | ICN1860454 | |
| Ant-53BP1 Antibody | BD Biosciences | 612522 | diluted to 1:500 in staining buffer |
| Ant-Geminin Antibody | Abcam | ab104306 | diluted to 1:200 in staining buffer |
| Anti-Geminin Antibody | ProteinTech | 10802-1-AP | diluted to 1:400 in staining buffer |
| Anti-RAD51 Antibody | Abcam | ab133534 | diluted to 1:1000 in staining buffer |
| Anti-yH2AX Antibody | Millipore-Sigma | 05-636 | diluted to 1:500 in staining buffer |
| Ant-phospho-RPA32 (S4/S8) Antibody | Bethyl Laboratories | A300-245A-M | diluted to 1:200 in staining buffer |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1605 100 | |
| Centrifuge; Sorvall St 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004240 | |
| Confocal Microscope, Leica SP5 confocal system DMI4000 | Leica | 389584 | |
| Conical Tubes, 15 mL | Corning | 14-959-53A | |
| Countess 3 FL Automated Cell Counter (Cell Counting Machine) | Thermo Scientific | AMQAF2000 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Scientific | C10228 | |
| Cover Slip | LA Colors | Any clear nail polish will suffice | |
| Cultrex RGF Basement Membrane Extract, Type 2 | R&D Systems | 3533-010-02 | Could probably use Matrigel or other BME Matrix |
| DAPI | Thermo Scientific | R37606 | NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent, Diluted in 1x PBS |
| Glycine | Fisher Scientific | NC0756056 | |
| JCountPro | JCountPro | For access to the software, Email: jcountpro@gmail.com | |
| Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 07-000-243 | |
| Nail Polish | StatLab | SL102450 | |
| Parafomraldehyde (PFA), 2% | Electron Microscopy Sciences | 157-4 | Dilute to 4% PFA in PBS++ to obtain 2% PFA |
| Permeabilization Buffer | Made in Lab | 0.2% X-100 Triton in PBS++ | |
| Pipette | Rainin | 17014382 | |
| Pipette Tips | Rainin | 17014967 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Scientific | P36930 | |
| Staining Buffer | Made in Lab | 0.5% BSA, 0.15% Glycine, 0.1% X-100 Triton in PBS++ | |
| Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System | Thermo Scientific | 12-565-8 | |
| Triton X-100 | Sigma-Alderich | 11332481001 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Scientific | 15250061 | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604013 | animal origin-free, recombinant enzyme |
| X-RAD 320 Biological Irradiator | Precision X-Ray Irradiation | X-RAD320 |
References
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