İmmünofloresan Tahlilleri ile Hasta Kaynaklı Yumurtalık Kanseri Organoidlerinde DNA Hasar Onarım Proteinlerinin Görselleştirilmesi
Summary
Bu protokol, hasta kaynaklı yumurtalık kanseri organoidlerinde DNA hasarı onarım proteinlerini değerlendirme yöntemlerini açıklamaktadır. Burada kapsamlı kaplama ve boyama yöntemlerinin yanı sıra ayrıntılı, objektif niceleme prosedürleri de bulunmaktadır.
Abstract
İmmünofloresan, proteinlerin, glikanların ve küçük moleküllerin doğru tanımlanmasına ve lokalizasyonuna olanak sağlayan, yüksek duyarlılık ve özgüllüğe sahip hedef antijenleri görselleştirmek için en yaygın kullanılan tekniklerden biridir. Bu teknik iki boyutlu (2D) hücre kültüründe iyi kurulmuş olsa da, üç boyutlu (3D) hücre modellerinde kullanımı hakkında daha az şey bilinmektedir. Yumurtalık kanseri organoidleri, tümör hücresi klonal heterojenliğini, tümör mikroçevresini ve hücre-hücre ve hücre-matris etkileşimlerini özetleyen 3D tümör modelleridir. Bu nedenle, ilaç duyarlılığının ve fonksiyonel biyobelirteçlerin değerlendirilmesinde hücre hatlarından üstündürler. Bu nedenle, primer yumurtalık kanseri organoidlerinde immünofloresan kullanma yeteneği, bu kanserin biyolojisini anlamada son derece faydalıdır. Bu çalışmada, yüksek dereceli seröz hasta kaynaklı yumurtalık kanseri organoidlerinde (PDO’lar) DNA hasarı onarım proteinlerini tespit etmek için immünofloresan tekniği açıklanmaktadır. PDO’ları iyonlaştırıcı radyasyona maruz bıraktıktan sonra, nükleer proteinleri odak olarak değerlendirmek için sağlam organoidler üzerinde immünofloresan yapılır. Görüntüler konfokal mikroskopide z-yığın görüntüleme kullanılarak toplanır ve otomatik odak sayım yazılımı kullanılarak analiz edilir. Tarif edilen yöntemler, DNA hasar onarım proteinlerinin zamansal ve özel olarak işe alınmasının analizine ve bu proteinlerin hücre döngüsü belirteçleri ile kolokalizasyonuna izin verir.
Introduction
Yumurtalık kanseri jinekolojik maligniteye bağlı ölümlerin önde gelen nedenidir. Hastaların çoğunluğu karboplatin gibi DNA’ya zarar veren ilaçlarla tedavi edilir ve homolog rekombinasyon onarımı (HRR) eksikliği olan tümörleri olanlara poli (ADP-riboz) polimeraz (PARP) inhibitörleriverilebilir 1,2. Bununla birlikte, çoğu hasta bu tedavilere direnç geliştirir ve tanıdan sonraki 5 yıl içinde ölür. DNA hasar yanıtının (DDR) düzensizliği, yumurtalık kanseri gelişimi ve hem kemoterapi hem de PARP inhibitörü direnci ile ilişkilendirilmiştir3. Bu nedenle, DDR’nin incelenmesi, yumurtalık kanserinin patofizyolojisini, potansiyel biyobelirteçleri ve yeni hedefe yönelik tedavileri anlamada zorunludur.
DDR’yi değerlendirmek için mevcut yöntemler, DNA hasar proteinlerinin ve nükleotid analoglarının doğru tanımlanmasına ve lokalizasyonuna izin verdiği için immünofloresan (IF) kullanır. DNA’da çift sarmallı bir kırılma (DSB) olduğunda, histon proteini H2AX hızla fosforile edilir ve DNA hasarı onarım proteinlerinin4’ü bir araya getirdiği bir odak oluşturur. Bu fosforilasyon, IF kullanılarak kolayca tanımlanabilir; Aslında, ɣ-H2AX testi, bir DSB 5,6,7,8,9’un indüksiyonunu doğrulamak için yaygın olarak kullanılmıştır. Artmış DNA hasarı, DNA’ya zarar veren ajanların platin duyarlılığı ve etkinliği ile ilişkilendirilmiştir 10,11,12 ve ɣ-H2AX, diğer kanser tedavilerinde kemoterapi yanıtı ile ilişkili bir biyobelirteç olarak önerilmiştir13. Bir DSB üzerine, HRR’de yetkin bir hücre, BRCA1 ve BRCA2’nin replikasyon proteini A’nın (RPA) yerini alması ve DNA’ya bağlanması için RAD51’i işe almasına yol açan bir dizi olay gerçekleştirir. HRR onarımı, DSB’yi sadık bir şekilde onarmak için bir DNA şablonu kullanır. Bununla birlikte, tümörler HRR’de eksik olduğunda, homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) gibi alternatif onarım yollarına güvenirler. NHEJ’nin hataya eğilimli olduğu bilinmektedir ve hücre üzerinde yüksek mutasyonel bir yük oluşturur, bu da 53BP1’i pozitif bir düzenleyici14 olarak kullanır. Bu DNA hasarı proteinlerinin hepsi IF kullanılarak odaklar olarak doğru bir şekilde tanımlanabilir. Proteinler için boyamaya ek olarak, IF çatal korumasını ve tek sarmallı DNA boşluğu oluşumunu incelemek için kullanılabilir. Stabil çatallara sahip olma yeteneği platin yanıtı ile ilişkilendirilmiştir ve son zamanlarda, boşluk testleri PARP inhibitörlerine 6,15,16,17 yanıtını tahmin etme potansiyelini göstermiştir. Bu nedenle, genoma girdikten sonra nükleotid analogları için boyama, DDR’yi incelemenin başka bir yoludur.
Bugüne kadar, yumurtalık kanserinde DDR’nin değerlendirilmesi büyük ölçüde klonal heterojenliği, mikroçevreyi veya in vivo tümörlerin mimarisini özetlemeyen homojen 2D hücre hatları ile sınırlandırılmıştır18,19. Son zamanlarda yapılan araştırmalar, organoidlerin DDRmekanizmaları 6 gibi karmaşık biyolojik süreçleri incelemede 2D hücre hatlarından daha üstün olduğunu göstermektedir. Mevcut metodoloji PDO’larda RAD51, ɣ-H2AX, 53BP1, RPA ve geminin’i değerlendirmektedir. Bu yöntemler bozulmamış organoidi değerlendirir ve DDR mekanizmalarının in vivo tümör mikroçevresine daha benzer bir ortamda incelenmesine izin verir. Konfokal mikroskopi ve otomatik odak sayımı ile birlikte, bu metodoloji yumurtalık kanserinde DDR yolunun anlaşılmasına ve hastalar için tedavi planlarının kişiselleştirilmesine yardımcı olabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
DNA hasarı yanıtı hem yumurtalık kanseri gelişiminde hem de kemoterapi direncinde ayrılmaz bir rol oynar. Bu nedenle, DNA onarım mekanizmalarının tam olarak anlaşılması zorunludur. Burada, DNA hasarı onarım proteinlerini 3D, bozulmamış organoidlerde incelemek için bir metodoloji sunulmaktadır. DNA hasarını, homolog rekombinasyonu, homolog olmayan uç birleştirmeyi ve replikasyon stresini değerlendirmek için ayırt edici antikorlar kullanılarak tekrarlanabilir, güvenilir bir protokol geliştirilmi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu protokolün oluşturulmasında Pavel Lobachevsky, PhD’nin rehberliği için minnettarız. Ayrıca, St. Louis’in Kadın Hastalıkları ve Doğum Bölümü ve Jinekolojik Onkoloji Bölümü’ndeki Washington Üniversitesi Tıp Fakültesi’ne, Washington Üniversitesi Dekan’ın Akademik Programına, Jinekolojik Onkoloji Grubu Vakfı’na ve Üreme Bilim İnsanı Geliştirme Programı’na bu projeye verdikleri destek için teşekkür ederiz.
Materials
| 1x phosphate buffered saline with calcium and magnesium (PBS++) | Sigma | 14-040-133 | |
| 1x phosphate buffered saline without calcium and magnesium (PBS) | Fisher Scientific | ICN1860454 | |
| Ant-53BP1 Antibody | BD Biosciences | 612522 | diluted to 1:500 in staining buffer |
| Ant-Geminin Antibody | Abcam | ab104306 | diluted to 1:200 in staining buffer |
| Anti-Geminin Antibody | ProteinTech | 10802-1-AP | diluted to 1:400 in staining buffer |
| Anti-RAD51 Antibody | Abcam | ab133534 | diluted to 1:1000 in staining buffer |
| Anti-yH2AX Antibody | Millipore-Sigma | 05-636 | diluted to 1:500 in staining buffer |
| Ant-phospho-RPA32 (S4/S8) Antibody | Bethyl Laboratories | A300-245A-M | diluted to 1:200 in staining buffer |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1605 100 | |
| Centrifuge; Sorvall St 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004240 | |
| Confocal Microscope, Leica SP5 confocal system DMI4000 | Leica | 389584 | |
| Conical Tubes, 15 mL | Corning | 14-959-53A | |
| Countess 3 FL Automated Cell Counter (Cell Counting Machine) | Thermo Scientific | AMQAF2000 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Scientific | C10228 | |
| Cover Slip | LA Colors | Any clear nail polish will suffice | |
| Cultrex RGF Basement Membrane Extract, Type 2 | R&D Systems | 3533-010-02 | Could probably use Matrigel or other BME Matrix |
| DAPI | Thermo Scientific | R37606 | NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent, Diluted in 1x PBS |
| Glycine | Fisher Scientific | NC0756056 | |
| JCountPro | JCountPro | For access to the software, Email: jcountpro@gmail.com | |
| Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 07-000-243 | |
| Nail Polish | StatLab | SL102450 | |
| Parafomraldehyde (PFA), 2% | Electron Microscopy Sciences | 157-4 | Dilute to 4% PFA in PBS++ to obtain 2% PFA |
| Permeabilization Buffer | Made in Lab | 0.2% X-100 Triton in PBS++ | |
| Pipette | Rainin | 17014382 | |
| Pipette Tips | Rainin | 17014967 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Scientific | P36930 | |
| Staining Buffer | Made in Lab | 0.5% BSA, 0.15% Glycine, 0.1% X-100 Triton in PBS++ | |
| Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System | Thermo Scientific | 12-565-8 | |
| Triton X-100 | Sigma-Alderich | 11332481001 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Scientific | 15250061 | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604013 | animal origin-free, recombinant enzyme |
| X-RAD 320 Biological Irradiator | Precision X-Ray Irradiation | X-RAD320 |
References
- Lheureux, S., Gourley, C., Vergote, I., Oza, A. M. Epithelial ovarian cancer. Lancet Oncology. 393 (10177), 1240-1253 (2019).
- Tew, W. P., et al. PARP inhibitors in the management of ovarian cancer: ASCO guideline. Journal of Clinical Oncology. 38 (30), 3468-3493 (2020).
- Tomasova, K., et al. DNA repair and ovarian carcinogenesis: impact on risk, prognosis and therapy outcome. Cancers. 12 (7), 1713 (2020).
- Mukhopadhyay, A., et al. Development of a functional assay for homologous recombination status in primary cultures of epithelial ovarian tumor and correlation with sensitivity to poly(ADP-Ribose) polymerase inhibitors. Clinical Cancer Research. 16 (8), 2344-2351 (2010).
- Graeser, M., et al. A marker of homologous recombination predicts pathologic complete response to neoadjuvant chemotherapy in primary breast cancer. Clinical Cancer Research. 16 (24), 6159-6168 (2010).
- Hill, S. J., et al. Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids. Cancer Discovery. 8 (11), 1404-1421 (2018).
- Naipal, K. A. T., et al. Functional ex vivo assay to select homologous recombination-deficient breast tumors for PARP inhibitor treatment. Clinical Cancer Research. 20 (18), 4816-4826 (2014).
- Tumiati, M., et al. A functional homologous recombination assay predicts primary chemotherapy response and long-term survival in ovarian cancer patients. Clinical Cancer Research. 24 (18), 4482-4493 (2018).
- Mukhopadhyay, A., et al. Clinicopathological features of homologous recombination-deficient epithelial ovarian cancers: sensitivity to PARP inhibitors, platinum, and survival. 암 연구학. 72 (22), 5675-5682 (2012).
- Johnson, S. W., Laub, P. B., Beesley, J. S., Ozols, R. F., Hamilton, T. C. Increased platinum-DNA damage tolerance is associated with cisplatin resistance and cross-resistance to various chemotherapeutic agents in unrelated human ovarian cancer cell lines. 암 연구학. 57 (5), 850-856 (1997).
- Stefanou, D. T., et al. Aberrant DNA damage response pathways may predict the outcome of platinum chemotherapy in ovarian cancer. PLoS One. 10 (2), 0117654 (2015).
- Helleday, T., Petermann, E., Lundin, C., Hodgson, B., Sharma, R. A. DNA repair pathways as targets for cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 8 (3), 193-204 (2008).
- Ivashkevich, A., Redon, C. E., Nakamura, A. J., Martin, R. F., Martin, O. A. Use of the γ-H2AX assay to monitor DNA damage and repair in translational cancer research. Cancer Letters. 327 (1-2), 123-133 (2012).
- Fuh, K., et al. Homologous recombination deficiency real-time clinical assays, ready or not. Gynecologic Oncology. 159 (3), 877-886 (2020).
- Cong, K., et al. Replication gaps are a key determinant of PARP inhibitor synthetic lethality with BRCA deficiency. Molecular Cell. 81 (15), 3128-3144 (2021).
- Lee, E. K., Matulonis, U. A. PARP inhibitor resistance mechanisms and implications for post-progression combination therapies. Cancers. 12 (8), 2054 (2020).
- Panzarino, N. J., et al. Replication gaps underlie BRCA deficiency and therapy response. 암 연구학. 81 (5), 1388-1397 (2021).
- Yee, C., Dickson, K. A., Muntasir, M. N., Ma, Y., Marsh, D. J. Three-dimensional modelling of ovarian cancer: from cell lines to organoids for discovery and personalized medicine. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 836984 (2022).
- Regan, J. L. Immunofluorescence staining of colorectal cancer patient-derived organoids. Methods Cell Biology. 171, 163-171 (2022).
- Graham, O., et al. Generation and culturing of high-grade serous ovarian cancer patient derived organoids. Journal of Visualized Experiments. (191), (2023).
- Jakl, L., et al. Validation of JCountPro software for efficient assessment of ionizing radiation-induced foci in human lymphocytes. International Journal of Radiation Biology. 92 (12), 766-773 (2016).
- Mullen, M. M., et al. GAS6/AXL inhibition enhances ovarian cancer sensitivity to chemotherapy and PARP inhibition through increased DNA damage and enhanced replication stress. Molecular Cancer Research. 20 (2), 265-279 (2022).
- van Ineveld, R. L., Ariese, H. C. R., Wehrens, E. J., Dekkers, J. F., Rios, A. C. Single-cell resolution three-dimensional imaging of intact organoids. Journal of Visualized Experiments. (160), e60709 (2020).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
- O’Rourke, K. P., Dow, L. E., Lowe, S. W. Immunofluorescent staining of mouse intestinal stem cells. Bio Protocols. 6 (4), 1732 (2016).
- Nwani, N. G., Sima, L. E., Nieves-Neira, W., Matei, D. Targeting the microenvironment in high grade serous ovarian cancer. Cancers. 10 (8), 266 (2018).
- Ghoneum, A., et al. Exploring the clinical value of tumor microenvironment in platinum-resistant ovarian cancer. Seminars in Cancer Biology. 77, 83-98 (2021).
- Yang, Y., Yang, Y., Yang, J., Zhao, X., Wei, X. Tumor microenvironment in ovarian cancer: function and therapeutic strategy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 758 (2020).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Cybulla, E., Vindigni, A. Leveraging the replication stress response to optimize cancer therapy. Nature Reviews. , (2022).
