Visualización de proteínas de reparación del daño del ADN en organoides de cáncer de ovario derivados de pacientes a través de ensayos de inmunofluorescencia
Summary
El presente protocolo describe métodos para evaluar las proteínas de reparación del daño del ADN en organoides de cáncer de ovario derivados de pacientes. Aquí se incluyen métodos integrales de recubrimiento y tinción, así como procedimientos de cuantificación detallados y objetivos.
Abstract
La inmunofluorescencia es una de las técnicas más utilizadas para visualizar antígenos diana con alta sensibilidad y especificidad, lo que permite la identificación y localización precisa de proteínas, glicanos y moléculas pequeñas. Si bien esta técnica está bien establecida en el cultivo celular bidimensional (2D), se sabe menos sobre su uso en modelos celulares tridimensionales (3D). Los organoides del cáncer de ovario son modelos tumorales 3D que recapitulan la heterogeneidad clonal de las células tumorales, el microambiente tumoral y las interacciones célula-célula y célula-matriz. Por lo tanto, son superiores a las líneas celulares para la evaluación de la sensibilidad a los medicamentos y los biomarcadores funcionales. Por lo tanto, la capacidad de utilizar la inmunofluorescencia en organoides primarios de cáncer de ovario es extremadamente beneficiosa para comprender la biología de este cáncer. El estudio actual describe la técnica de inmunofluorescencia para detectar proteínas de reparación del daño del ADN en organoides de cáncer de ovario (DOP) serosos de alto grado derivados de pacientes. Después de exponer los PDO a la radiación ionizante, la inmunofluorescencia se realiza en organoides intactos para evaluar las proteínas nucleares como focos. Las imágenes se recopilan utilizando imágenes z-stack en microscopía confocal y se analizan utilizando un software automatizado de conteo de focos. Los métodos descritos permiten el análisis del reclutamiento temporal y especial de proteínas de reparación del daño del ADN y la colocalización de estas proteínas con marcadores del ciclo celular.
Introduction
El cáncer de ovario es la principal causa de muerte por neoplasia maligna ginecológica. La mayoría de los pacientes son tratados con fármacos que dañan el ADN, como el carboplatino, y aquellos con tumores deficientes en reparación por recombinación homóloga (HRR) pueden recibir inhibidores de la poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) 1,2. Sin embargo, la mayoría de los pacientes desarrollan resistencia a estas terapias y mueren dentro de los 5 años posteriores al diagnóstico. La desregulación de la respuesta al daño del ADN (DDR) se ha asociado con el desarrollo de cáncer de ovario y resistencia tanto a la quimioterapia como a los inhibidores de PARP3. Por lo tanto, el estudio de la DDR es imprescindible para comprender la fisiopatología del cáncer de ovario, los posibles biomarcadores y las nuevas terapias dirigidas.
Los métodos actuales para evaluar la DDR utilizan inmunofluorescencia (IF), ya que esto permite la identificación y localización precisas de proteínas de daño al ADN y análogos de nucleótidos. Una vez que hay una ruptura de doble cadena (DSB) en el ADN, la proteína histona H2AX se fosforila rápidamente, formando un foco donde las proteínas de reparación del daño del ADN se congregan4. Esta fosforilación se puede identificar fácilmente utilizando IF; de hecho, el ensayo ɣ-H2AX se ha empleado comúnmente para confirmar la inducción de un DSB 5,6,7,8,9. El aumento del daño en el ADN se ha asociado con la sensibilidad al platino y la eficacia de los agentes dañinos del ADN 10,11,12, y ɣ-H2AX se ha propuesto como un biomarcador asociado con la respuesta a la quimioterapia en otros tratamientos contra el cáncer 13. Tras un DSB, una célula competente en HRR realiza una serie de eventos que conducen a BRCA1 y BRCA2 a reclutar RAD51 para reemplazar la proteína de replicación A (RPA) y unirse al ADN. HRR repair utiliza una plantilla de ADN para reparar fielmente el DSB. Sin embargo, cuando los tumores son deficientes en HRR, dependen de vías de reparación alternativas, como la unión de extremos no homólogos (NHEJ). Se sabe que NHEJ es propenso a errores y crea una alta carga mutacional en la célula, que utiliza 53BP1 como regulador positivo14. Todas estas proteínas de daño en el ADN se pueden identificar con precisión como focos utilizando IF. Además de la tinción de proteínas, el AI se puede usar para estudiar la protección de la horquilla y la formación de brechas de ADN monocatenario. La capacidad de tener horquillas estables se ha correlacionado con la respuesta al platino, y recientemente, los ensayos de brecha han demostrado el potencial para predecir la respuesta a los inhibidores de PARP 6,15,16,17. Por lo tanto, la tinción de los análogos de nucleótidos después de la introducción en el genoma es otra forma de estudiar la DDR.
Hasta la fecha, la evaluación de la DDR en el cáncer de ovario se ha limitado en gran medida a líneas celulares 2D homogéneas que no recapitulan la heterogeneidad clonal, el microambiente o la arquitectura de los tumores in vivo 18,19. Investigaciones recientes sugieren que los organoides son superiores a las líneas celulares 2D en el estudio de procesos biológicos complejos como los mecanismos DDR6. La presente metodología evalúa RAD51, ɣ-H2AX, 53BP1, RPA y geminina en DOP. Estos métodos evalúan el organoide intacto y permiten el estudio de los mecanismos DDR en un entorno más similar al microambiente tumoral in vivo. Junto con la microscopía confocal y el conteo automatizado de focos, esta metodología puede ayudar a comprender la vía DDR en el cáncer de ovario y personalizar los planes de tratamiento para las pacientes.
Protocol
Representative Results
Discussion
La respuesta al daño del ADN juega un papel integral tanto en el desarrollo del cáncer de ovario como en la resistencia a la quimioterapia. Por lo tanto, es imperativo una comprensión profunda de los mecanismos de reparación del ADN. Aquí, se presenta una metodología para estudiar las proteínas de reparación del daño del ADN en organoides 3D intactos. Se desarrolla un protocolo reproducible y confiable que utiliza anticuerpos distintivos para evaluar el daño del ADN, la recombinación homóloga, la unión final…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estamos agradecidos por la orientación de Pavel Lobachevsky, PhD en el establecimiento de este protocolo. También nos gustaría reconocer a la Facultad de Medicina de la Universidad de Washington en el Departamento de Obstetricia y Ginecología de St. Louis y la División de Oncología Ginecológica, el Programa de Becarios del Decano de la Universidad de Washington, la Fundación del Grupo de Oncología Ginecológica y el Programa de Desarrollo de Científicos Reproductivos por su apoyo a este proyecto.
Materials
| 1x phosphate buffered saline with calcium and magnesium (PBS++) | Sigma | 14-040-133 | |
| 1x phosphate buffered saline without calcium and magnesium (PBS) | Fisher Scientific | ICN1860454 | |
| Ant-53BP1 Antibody | BD Biosciences | 612522 | diluted to 1:500 in staining buffer |
| Ant-Geminin Antibody | Abcam | ab104306 | diluted to 1:200 in staining buffer |
| Anti-Geminin Antibody | ProteinTech | 10802-1-AP | diluted to 1:400 in staining buffer |
| Anti-RAD51 Antibody | Abcam | ab133534 | diluted to 1:1000 in staining buffer |
| Anti-yH2AX Antibody | Millipore-Sigma | 05-636 | diluted to 1:500 in staining buffer |
| Ant-phospho-RPA32 (S4/S8) Antibody | Bethyl Laboratories | A300-245A-M | diluted to 1:200 in staining buffer |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1605 100 | |
| Centrifuge; Sorvall St 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004240 | |
| Confocal Microscope, Leica SP5 confocal system DMI4000 | Leica | 389584 | |
| Conical Tubes, 15 mL | Corning | 14-959-53A | |
| Countess 3 FL Automated Cell Counter (Cell Counting Machine) | Thermo Scientific | AMQAF2000 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Scientific | C10228 | |
| Cover Slip | LA Colors | Any clear nail polish will suffice | |
| Cultrex RGF Basement Membrane Extract, Type 2 | R&D Systems | 3533-010-02 | Could probably use Matrigel or other BME Matrix |
| DAPI | Thermo Scientific | R37606 | NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent, Diluted in 1x PBS |
| Glycine | Fisher Scientific | NC0756056 | |
| JCountPro | JCountPro | For access to the software, Email: jcountpro@gmail.com | |
| Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 07-000-243 | |
| Nail Polish | StatLab | SL102450 | |
| Parafomraldehyde (PFA), 2% | Electron Microscopy Sciences | 157-4 | Dilute to 4% PFA in PBS++ to obtain 2% PFA |
| Permeabilization Buffer | Made in Lab | 0.2% X-100 Triton in PBS++ | |
| Pipette | Rainin | 17014382 | |
| Pipette Tips | Rainin | 17014967 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Scientific | P36930 | |
| Staining Buffer | Made in Lab | 0.5% BSA, 0.15% Glycine, 0.1% X-100 Triton in PBS++ | |
| Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System | Thermo Scientific | 12-565-8 | |
| Triton X-100 | Sigma-Alderich | 11332481001 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Scientific | 15250061 | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604013 | animal origin-free, recombinant enzyme |
| X-RAD 320 Biological Irradiator | Precision X-Ray Irradiation | X-RAD320 |
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