Protezione delle cellule miocardiche H9c2 dallo stress ossidativo mediante Crocetina tramite la mitofagia mediata dalla via PINK1/Parkin

Summary

Sulla base di esperimenti in vitro , questo studio ha rivelato il meccanismo della crocetina nel riparare il danno da stress ossidativo dei cardiomiociti influenzando la mitofagia, in cui la via di segnalazione PINK1 / Parkin svolge un ruolo importante.

Abstract

Questo studio mirava a esplorare l’effetto protettivo dello stress ossidativo della crocetina sulle cellule miocardiche H9c2 mediate da H 2 O₂attraverso esperimenti in vitro e ad esplorare ulteriormente se il suo meccanismo è correlato all’impatto della mitofagia. Questo studio mirava anche a dimostrare l’effetto terapeutico dell’acido di cartamo sullo stress ossidativo nei cardiomiociti ed esplorare se il suo meccanismo è correlato all’effetto della mitofagia. Qui, è stato costruito un modello di stress ossidativo basato su H 2 O₂e valutato il grado di danno da stress ossidativo dei cardiomiociti rilevando i livelli di lattato deidrogenasi (LDH), creatina chinasi (CK), malondialdeide (MDA), superossido dismutasi (SOD), catalasi (CAT) e glutatione perossidasi (GSH Px). Il colorante fluorescente DCFH-DA (delle specie reattive dell’ossigeno (ROS), il colorante JC-1 e il colorante TUNEL sono stati impiegati per valutare il danno mitocondriale e l’apoptosi. Il flusso autofagico è stato misurato trasfettando l’adenovirus Ad-mCherry-GFP-LC3B. Le proteine correlate alla mitofagia sono state quindi rilevate tramite western blotting e immunofluorescenza. Tuttavia, la crocetina (0,1-10 μM) potrebbe migliorare significativamente la vitalità cellulare e ridurre l’apoptosi e il danno da stress ossidativo causato da H 2 O₂. Nelle cellule con eccessiva attivazione autofagica, la crocetina potrebbe anche ridurre il flusso autofagico e l’espressione delle proteine correlate alla mitofagia PINK1 e Parkin, e invertire il trasferimento di Parkin ai mitocondri. La crocetina potrebbe ridurre il danno da stress ossidativo mediato da H 2 O₂e l’apoptosi delle cellule H9c2, e il suo meccanismo era strettamente correlato alla mitofagia.

Introduction

L’infarto miocardico acuto (IMA) è una necrosi miocardica pericolosa per la vita causata da ischemia grave e persistente e ipossia alle arterie coronarie ^1,2. L’intervento coronarico percutaneo (PCI) è una delle strategie terapeutiche di prima linea per l’IMA e di solito protegge i cardiomiociti dal danno ischemico ^3,4. Il miocardio distale mancherà di apporto di sangue e ossigeno se non trattato tempestivamente ed efficacemente dopo AMI, che porta a necrosi ischemica e ulteriori complicanze cardiovascolari ^5,6. Promuovere il recupero dei cardiomiociti e ridurre al minimo il danno miocardico irreversibile dopo aver perso l’opportunità chirurgica PCI è stato un hotspot di ricerca. Dopo l’IMA, i cardiomiociti sono in uno stato di ischemia e ipossia, con conseguente inibizione della fosforilazione ossidativa mitocondriale, riduzione di NAD+ a NADPH e aumento della riduzione di singoli elettroni⁷. Di conseguenza, la reazione di riduzione incompleta dell’ossigeno genera un eccesso di specie reattive dell’ossigeno (ROS) e alla fine porta a danni da stress ossidativo ai cardiomiociti⁸. Un eccessivo accumulo di ROS innesca la perossidazione lipidica, interrompendo ulteriormente la struttura e la funzione delle membrane mitocondriali. Il risultato è un’apertura continua dei pori di transizione della permeabilità mitocondriale e una diminuzione del potenziale della membrana mitocondriale, inducendo apoptosi e necrosi.

Gli inibitori dell’enzima di conversione dell’angiotensina (ACE), i bloccanti del recettore dell’angiotensina (ARB), gli inibitori dei β-adrenocettori, gli antagonisti dell’aldosterone e altri farmaci standard nell’AMI possono aiutare a migliorare la funzione cardiaca dopo infarto miocardico e prevenire il verificarsi di eventi maligni, come aritmie e rimodellamento ventricolare sinistro⁹. Tuttavia, la sopravvivenza post-infarto e la prognosi sono fortemente influenzate dalle dimensioni dell’infarto e non sono stati raggiunti risultati soddisfacenti per ridurre l’apoptosi dei cardiomiociti^10,11. Pertanto, lo sviluppo di farmaci per promuovere il recupero dei cardiomiociti dopo l’infarto miocardico è diventato un problema urgente.

La medicina tradizionale è stata fonte di ispirazione per la moderna ricerca farmaceutica per molti anni^12,13,14,15. La medicina tradizionale cinese (MTC) ha una lunga storia nel trattamento dell’IMA e una serie di studi randomizzati di controllo negli ultimi anni hanno confermato che la MTC può effettivamente migliorare la prognosi dei pazienti^16,17. Secondo la teoria TCM, l’AMI è causata dalla stasi del sangue^18,19, quindi i farmaci per promuovere la circolazione sanguigna sono solitamente utilizzati per il trattamento dell’AMI nella fase acuta²⁰. Tra questi, si ritiene che lo zafferano abbia un potente effetto sull’attivazione e sulla stasi del sangue ed è spesso usato nel trattamento acuto dell’AMI. La crocetina, un componente importante dello zafferano, può svolgere un ruolo chiave nella protezione dei cardiomiociti²¹.

In questo studio, le cellule miocardiche H9c2 sono state indotteda H 2 O₂ per simulare l’ischemia/riperfusione miocardica, che causa una lesione cardiomiocitaria di AMI, e la crocetina è stata utilizzata come intervento per studiare il suo effetto protettivo contro il danno miocardico indotto da stress ossidativo. Il meccanismo della crocetina che protegge i cardiomiociti è stato ulteriormente esplorato attraverso la mitofagia. Ancora più importante, questo articolo fornisce un riferimento per l’approccio tecnico allo studio della mitofagia e descrive l’intera procedura sperimentale in dettaglio.

Protocol

Gli esperimenti sono stati eseguiti nel Laboratorio di Fisiologia presso l’Università di Medicina Cinese di Pechino, in Cina. Tutti i metodi di studio sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e i regolamenti pertinenti dell’Università di Pechino. 1. Coltura cellulare Aggiungere il 10% di siero bovino fetale e l’1% di penicillina/streptomicina al terreno di base modificato Eagle medium (DMEM) di Dulbecco (con 4,5 g/L di D-glucosio, 4,g.g/L di L-glutammi…

Representative Results

Effetti della crocetina sulla vitalità cellulareLa crocetina a 0,1 μM, 0,5 μM, 1 μM, 5 μM, 10 μM, 50 μM e 100 μM ha avuto un significativo effetto proliferativo sulle cellule, mentre la crocetina a concentrazioni superiori a 200 μM ha inibito significativamente la proliferazione delle cellule H9c2 (Figura 1A). Dopo 4 ore di trattamento con 400 μM H 2 O2, la vitalità cellulare è stata ridotta considerevolmente e la crocetina ha potuto inv…

Discussion

L’esplorazione di ingredienti efficaci da composti complessi di droghe naturali attraverso tecnologie avanzate è stata un punto focale della ricerca TCM²⁹ e può fornire prove di laboratorio per il futuro sviluppo di farmaci dopo la verifica. Il cartamo è un farmaco rappresentativo nel trattamento di “promuovere la circolazione sanguigna e ridurre al minimo la stasi del sangue” ed è ampiamente usato nel trattamento dell’infarto miocardico^30,31<sup class="xref"…

Materials

0.25% trypsin	Gibco	2323363
1% Penicillin-streptomycin	Sigma	V900929
5x protein loading buffer	Beijing Pulilai Gene Technology	B1030-5
Ad-mCherry GFP-LC3B adenovirus	Beyotime	C3011
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)	Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.	ZF-0514
Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)	Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.	ZF-0513
Animal-free blocking solution	CST	15019s
Anti-Parkin antibody	Santa Cruz	sc-32282
Anti-PINK1 antibody	ABclonal	A11435
Anti-TOM20 antibody	ABclonal	A19403
Anti-β-actin  antibody	ABclonal	AC026
BCA protein assay kit	KeyGEN Biotech	KGP902
Blood cell counting plate	Servicebio	WG607
CAT assay kits	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A007-1-1
Chemiluminescence detection system	Shanghai Qinxiang Scientific Instrument Factory	ChemiScope 6100
CK assay kits	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A032-1-1
Coenzyme Q10 (CoQ 10)	Macklin	C6129
Crocetin	Chengdu Ruifensi Biotechnology Co., Ltd.	RFS-Z01802006012
DAPI-containing antifluorescence quenching tablets	Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.	ZLI-9557
DCFH-DA	Beyotime	S0033S
DMSO	Solarbio	D8371
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)	Gibco	8122091
Enhanced Chemiluminescence (ECL) solution	NCM Biotech	P10100
Fetal bovine serum (FBS)	Corning-Cellgro	35-081-CV
GraphPad Prism 7.0	https://www.graphpad.com/
GSH-Px assay kits	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A005-1-2
H9c2 myocardial cells	Beijing Dingguochangsheng Biotech Co., Ltd.	CS0062
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-goat IgG (H+L)	Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.	ZB-2305
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)	Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.	ZB-2301
JC-1 mitochondrial membrane potential assay kit	LABLEAD	J22202
LDH assay kits	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A020-2-2
MDA assay kits	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A003-2-2
Methanol	Aladdin	A2114057
MTS assay	Promega	G3581
Perhydrol	G-clone	CS7730
Phosphatase inhibitor	CWBIO	CW2383
Polybrene	Beyotime	C0351
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes	Millipore	ISEQ00010
Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) lysis buffer	Solarbio	R0010
SDS-PAGE gels	Shanghai Epizyme Biomedical Technology	PG112
SDS-PAGE running buffer powder	Servicebio	G2018-1L
SDS-PAGE transfer buffer powder	Servicebio	G2017-1L
SOD assay kits	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A001-2-2
Tris-buffered saline powder	Servicebio	G0001-2L
Triton X-100	Sigma	SLCC9172
TUNEL apoptosis assay kit	Beyotime	C1086
Tween-20	Solarbio	T8220