H9c2 Miyokard Hücrelerinin Crocetin ile Oksidatif Stresten PINK1 / Parkin Yolu Aracılı Mitopaji ile Korunması
Summary
İn vitro deneylere dayanarak, bu çalışma, PINK1 / Parkin sinyal yolunun önemli bir rol oynadığı mitopajiyi etkileyerek kardiyomiyositlerin oksidatif stres hasarını onarmada krosetinin mekanizmasını ortaya koymuştur.
Abstract
Bu çalışma, krosetininH2O2 aracılı H9c2miyokard hücreleri üzerindeki oksidatif stresten koruyucu etkisini in vitro deneylerle araştırmayı ve mekanizmasının mitopajinin etkisiyle ilişkili olup olmadığını araştırmayı amaçlamıştır. Bu çalışmada ayrıca aspir asidinin kardiyomiyositlerde oksidatif stres üzerine terapötik etkisinin gösterilmesi ve mekanizmasının mitopajinin etkisi ile ilişkili olup olmadığının araştırılması amaçlanmıştır. Burada, birH2O2bazlı oksidatif stres modeli oluşturulmuş ve laktat dehidrogenaz (LDH), kreatin kinaz (CK), malondialdehit (MDA), süperoksit dismutaz (SOD), katalaz (CAT) ve glutatyon peroksidaz (GSH Px) seviyelerini tespit ederek kardiyomiyositlerin oksidatif stres hasarının derecesini değerlendirmiştir. Mitokondriyal hasarı ve apoptozu değerlendirmek için reaktif oksijen türleri (ROS) tespit eden floresan boya DCFH-DA, JC-1 boyası ve TUNEL boyası kullanıldı. Otofajik akı Ad-mCherry-GFP-LC3B adenovirüs transfekte edilerek ölçüldü. Mitopaji ile ilişkili proteinler daha sonra batı lekelenmesi ve immünofloresan yoluyla tespit edildi. Bununla birlikte, krosetin (0.1-10 μM) hücre canlılığını önemli ölçüde artırabilir veH2O2’nin neden olduğu apoptozve oksidatif stres hasarını azaltabilir. Aşırı otofajik aktivasyonu olan hücrelerde, krosetin ayrıca otofaji akışını ve mitopaji ile ilişkili proteinler PINK1 ve Parkin’in ekspresyonunu azaltabilir ve Parkin’in mitokondriye transferini tersine çevirebilir. Krosetin,H2O2aracılı oksidatif stres hasarını ve H9c2 hücrelerinin apoptozunu azaltabilir ve mekanizması mitopaji ile yakından ilişkiliydi.
Introduction
Akut miyokard enfarktüsü (), koroner arterlere şiddetli ve inatçı iskemi ve hipoksi sonucu ortaya çıkan, hayatı tehdit eden bir miyokard nekrozudur 1,2. Perkütan koroner girişim (PKG), için birinci basamak terapötik stratejilerden biridir ve genellikle kardiyomiyositleri iskemik hasardan korur 3,4. Distal miyokard, sonrası derhal ve etkili bir şekilde tedavi edilmezse kan ve oksijen kaynağından yoksun kalacaktır, bu da iskemik nekroza ve daha ileri kardiyovasküler komplikasyonlara yol açacaktır 5,6. Kardiyomiyosit iyileşmesini teşvik etmek ve PCI cerrahi fırsatını kaçırdıktan sonra geri dönüşümsüz miyokard hasarını en aza indirmek bir araştırma noktası olmuştur. AMI’den sonra, kardiyomiyositler iskemi ve hipoksi durumundadır, bu da mitokondriyal oksidatif fosforilasyonun inhibisyonu, NAD + ‘nın NADPH’ye indirgenmesi ve tek elektron redüksiyonunun artmasıile sonuçlanır 7. Sonuç olarak, oksijenin eksik indirgeme reaksiyonu, aşırı miktarda reaktif oksijen türü (ROS) üretir ve sonuçta kardiyomiyositlerde oksidatif stres hasarına yol açar8. Aşırı ROS birikimi, lipit peroksidasyonunu tetikleyerek mitokondriyal membranların yapısını ve işlevini daha da bozar. Sonuç, mitokondriyal geçirgenlik geçiş gözeneklerinin sürekli açılması ve mitokondriyal membran potansiyelinde bir azalma, apoptoz ve nekrozu indüklemesidir.
Anjiyotensin dönüştürücü enzim (ACE) inhibitörleri, anjiyotensin reseptör blokerleri (ARB’ler), β-adrenoseptörlerin inhibitörleri, aldosteron antagonistleri ve’deki diğer standart ilaçlar, miyokard enfarktüsünden sonra kalp fonksiyonlarını iyileştirmeye yardımcı olabilir ve aritmiler ve sol ventrikül yeniden şekillenmesi gibi malign olayların ortaya çıkmasını önleyebilir9. Bununla birlikte, enfarktüs sonrası sağkalım ve prognoz enfarktüs boyutundan büyük ölçüde etkilenmektedir ve kardiyomiyosit apoptozunu azaltmada tatmin edici sonuçlar elde edilememiştir10,11. Bu nedenle, miyokard enfarktüsünden sonra kardiyomiyosit iyileşmesini teşvik etmek için ilaçların geliştirilmesi acil bir konu haline gelmiştir.
Geleneksel tıp, uzun yıllardır modern farmasötik araştırmalar için bir ilham kaynağı olmuştur12,13,14,15. Geleneksel Çin tıbbı (TCM), tedavisinde uzun bir geçmişe sahiptir ve son yıllarda yapılan bir dizi randomize kontrol çalışması, TCM’nin hastaların prognozunu gerçekten iyileştirebileceğini doğrulamıştır16,17. TCM teorisine göre,’ye kan stazı18,19 neden olur, bu nedenle kan dolaşımını teşvik eden ilaçlar genellikle akut faz20’de tedavisi için kullanılır. Bunlar arasında safranın kan aktivasyonu ve stazı üzerinde güçlü bir etkisi olduğuna inanılmaktadır ve sıklıkla’nin akut tedavisinde kullanılmaktadır. Safranın önemli bir bileşeni olan krosetin, kardiyomiyositlerin korunmasında önemli bir rol oynayabilir21.
Bu çalışmada, H9c2 miyokard hücreleri,’nin kardiyomiyosit hasarına neden olan miyokard iskemisi / reperfüzyonunu simüle etmek için H2O2tarafından indüklendi ve oksidatif strese bağlı miyokard hasarına karşı koruyucu etkisini araştırmak için bir müdahale olarak krosetin kullanıldı. Krosetinin kardiyomiyositleri koruma mekanizması mitopaji ile daha da araştırıldı. Daha da önemlisi, bu makale mitopaji çalışmasına teknik yaklaşım için bir referans sağlar ve tüm deneysel prosedürü ayrıntılı olarak açıklar.
Protocol
Representative Results
Discussion
İleri teknoloji ile doğal ilaçların karmaşık bileşiklerinden etkili bileşenlerin araştırılması, TCM araştırmasının29 sıcak noktası olmuştur ve doğrulamadan sonra gelecekteki ilaç gelişimi için laboratuvar kanıtları sağlayabilir. Aspir, “kan dolaşımını teşvik etmek ve kan durağanlığını en aza indirmek” tedavisinde temsili bir ilaçtır ve miyokard enfarktüsü tedavisinde yaygın olarak kullanılmaktadır30,31<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Pekin Doğa Bilimleri Vakfı (No. 7202119) ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 82274380) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 0.25% trypsin | Gibco | 2323363 | |
| 1% Penicillin-streptomycin | Sigma | V900929 | |
| 5x protein loading buffer | Beijing Pulilai Gene Technology | B1030-5 | |
| Ad-mCherry GFP-LC3B adenovirus | Beyotime | C3011 | |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZF-0514 | |
| Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZF-0513 | |
| Animal-free blocking solution | CST | 15019s | |
| Anti-Parkin antibody | Santa Cruz | sc-32282 | |
| Anti-PINK1 antibody | ABclonal | A11435 | |
| Anti-TOM20 antibody | ABclonal | A19403 | |
| Anti-β-actin antibody | ABclonal | AC026 | |
| BCA protein assay kit | KeyGEN Biotech | KGP902 | |
| Blood cell counting plate | Servicebio | WG607 | |
| CAT assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A007-1-1 | |
| Chemiluminescence detection system | Shanghai Qinxiang Scientific Instrument Factory | ChemiScope 6100 | |
| CK assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A032-1-1 | |
| Coenzyme Q10 (CoQ 10) | Macklin | C6129 | |
| Crocetin | Chengdu Ruifensi Biotechnology Co., Ltd. | RFS-Z01802006012 | |
| DAPI-containing antifluorescence quenching tablets | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZLI-9557 | |
| DCFH-DA | Beyotime | S0033S | |
| DMSO | Solarbio | D8371 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Gibco | 8122091 | |
| Enhanced Chemiluminescence (ECL) solution | NCM Biotech | P10100 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning-Cellgro | 35-081-CV | |
| GraphPad Prism 7.0 | https://www.graphpad.com/ | ||
| GSH-Px assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A005-1-2 | |
| H9c2 myocardial cells | Beijing Dingguochangsheng Biotech Co., Ltd. | CS0062 | |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-goat IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZB-2305 | |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZB-2301 | |
| JC-1 mitochondrial membrane potential assay kit | LABLEAD | J22202 | |
| LDH assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A020-2-2 | |
| MDA assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A003-2-2 | |
| Methanol | Aladdin | A2114057 | |
| MTS assay | Promega | G3581 | |
| Perhydrol | G-clone | CS7730 | |
| Phosphatase inhibitor | CWBIO | CW2383 | |
| Polybrene | Beyotime | C0351 | |
| Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes | Millipore | ISEQ00010 | |
| Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) lysis buffer | Solarbio | R0010 | |
| SDS-PAGE gels | Shanghai Epizyme Biomedical Technology | PG112 | |
| SDS-PAGE running buffer powder | Servicebio | G2018-1L | |
| SDS-PAGE transfer buffer powder | Servicebio | G2017-1L | |
| SOD assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A001-2-2 | |
| Tris-buffered saline powder | Servicebio | G0001-2L | |
| Triton X-100 | Sigma | SLCC9172 | |
| TUNEL apoptosis assay kit | Beyotime | C1086 | |
| Tween-20 | Solarbio | T8220 |
References
- Anderson, J. L., Morrow, D. A. Acute myocardial infarction. The New England Journal of Medicine. 376 (21), 2053-2064 (2017).
- Samsky, M. D., et al. Cardiogenic shock after acute myocardial infarction: a review. JAMA. 326 (18), 1840-1850 (2021).
- Abbate, A., et al. Survival and cardiac remodeling benefits in patients undergoing late percutaneous coronary intervention of the infarct-related artery: evidence from a meta-analysis of randomized controlled trials. Journal of the American College of Cardiology. 51 (9), 956-964 (2008).
- Santoro, G. M., Carrabba, N., Migliorini, A., Parodi, G., Valenti, R. Acute heart failure in patients with acute myocardial infarction treated with primary percutaneous coronary intervention. European Journal of Heart Failure. 10 (8), 780-785 (2008).
- Dhruva, S. S., et al. Association of use of an intravascular microaxial left ventricular assist device vs intra-aortic balloon pump with in-hospital mortality and major bleeding among patients with acute myocardial infarction complicated by cardiogenic shock. JAMA. 323 (8), 734-745 (2020).
- Wang, Y., et al. Risk factors associated with major cardiovascular events 1 year after acute myocardial infarction. JAMA Network Open. 1 (4), e181079 (2018).
- Jou, M. J., et al. Melatonin protects against common deletion of mitochondrial DNA-augmented mitochondrial oxidative stress and apoptosis. Journal of Pineal Research. 43 (4), 389-403 (2007).
- La Piana, G., Fransvea, E., Marzulli, D., Lofrumento, N. E. Mitochondrial membrane potential supported by exogenous cytochrome c oxidation mimics the early stages of apoptosis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 246 (2), 556-561 (1998).
- De Filippo, O., et al. Impact of secondary prevention medical therapies on outcomes of patients suffering from Myocardial Infarction with NonObstructive Coronary Artery disease (MINOCA): A meta-analysis. International Journal of Cardiology. 368, 1-9 (2022).
- Davidson, S. M., et al. Multitarget strategies to reduce myocardial ischemia/reperfusion injury: JACC review topic of the week. Journal of the American College of Cardiology. 73 (1), 89-99 (2019).
- Caricati-Neto, A., Errante, P. R., Menezes-Rodrigues, F. S. Recent advances in pharmacological and non-pharmacological strategies of cardioprotection. International Journal of Molecular Sciences. 20 (16), 4002 (2019).
- Chen, G. Y., et al. Network pharmacology analysis and experimental validation to investigate the mechanism of total flavonoids of rhizoma drynariae in treating rheumatoid arthritis. Drug Design, Development, and Therapy. 16, 1743-1766 (2022).
- Wei, Z., et al. Traditional Chinese medicine has great potential as candidate drugs for lung cancer: A review. Journal of Ethnopharmacology. 300, 115748 (2023).
- Zhi, W., Liu, Y., Wang, X., Zhang, H. Recent advances of traditional Chinese medicine for the prevention and treatment of atherosclerosis. Journal of Ethnopharmacology. 301, 115749 (2023).
- Liu, M., et al. Hypertensive heart disease and myocardial fibrosis: How traditional Chinese medicine can help addressing unmet therapeutical needs. Pharmacological Research. 185, 106515 (2022).
- Zhang, X. X., et al. Traditional Chinese medicine intervenes ventricular remodeling following acute myocardial infarction: evidence from 40 random controlled trials with 3,659 subjects. Frontiers in Pharmacology. 12, 707394 (2021).
- Hao, P., et al. Traditional Chinese medicine for cardiovascular disease: evidence and potential mechanisms. Journal of the American College of Cardiology. 69 (24), 2952-2966 (2017).
- Delgado-Montero, A., et al. Blood stasis imaging predicts cerebral microembolism during acute myocardial infarction. Journal of the American Society of Echocardiography. 33 (3), 389-398 (2020).
- Lu, C. Y., Lu, P. C., Chen, P. C. Utilization trends in traditional Chinese medicine for acute myocardial infarction. Journal of Ethnopharmacology. 241, 112010 (2019).
- Gao, Z. Y., Xu, H., Shi, D. Z., Wen, C., Liu, B. Y. Analysis on outcome of 5284 patients with coronary artery disease: the role of integrative medicine. Journal of Ethnopharmacology. 141 (2), 578-583 (2012).
- Huang, Z., et al. Crocetin ester improves myocardial ischemia via Rho/ROCK/NF-kappaB pathway. International Immunopharmacology. 38, 186-193 (2016).
- Green, M. R., Sambrook, J. Estimation of cell number by hemocytometry counting. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (11), (2019).
- Zeng, Q., et al. Assessing the potential value and mechanism of Kaji-Ichigoside F1 on arsenite-induced skin cell senescence. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2022, 9574473 (2022).
- Chazotte, B. Labeling mitochondria with JC-1. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (9), (2011).
- Kyrylkova, K., Kyryachenko, S., Leid, M., Kioussi, C. Detection of apoptosis by TUNEL assay. Methods in Molecular Biology. 887, 41-47 (2012).
- Yuan, Y., et al. Palmitate impairs the autophagic flux to induce p62-dependent apoptosis through the upregulation of CYLD in NRCMs. Toxicology. 465, 153032 (2022).
- Kurien, B. T., Scofield, R. H. Western blotting. Methods. 38 (4), 283-293 (2006).
- Chen, G. Y., et al. Total flavonoids of rhizoma drynariae restore the MMP/TIMP balance in models of osteoarthritis by inhibiting the activation of the NF-κB and PI3K/AKT pathways. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 6634837 (2021).
- Amin, A., Hamza, A. A., Bajbouj, K., Ashraf, S. S., Daoud, S. Saffron: a potential candidate for a novel anticancer drug against hepatocellular carcinoma. Hepatology. 54 (3), 857-867 (2011).
- Kamalipour, M., Akhondzadeh, S. Cardiovascular effects of saffron: an evidence-based review. The Journal of Tehran Heart Center. 6 (2), 59-61 (2011).
- Mani, V., Lee, S. K., Yeo, Y., Hahn, B. S. A metabolic perspective and opportunities in pharmacologically important safflower. Metabolites. 10 (6), 253 (2020).
- Broadhead, G. K., Chang, A., Grigg, J., McCluskey, P. Efficacy and safety of saffron supplementation: current clinical findings. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 56 (16), 2767-2776 (2016).
- Gao, H., et al. Insight into the protective effect of salidroside against H2O2-induced injury in H9C2 cells. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 1060271 (2021).
- Chen, G. Y., et al. Prediction of rhizoma drynariae targets in the treatment of osteoarthritis based on network pharmacology and experimental verification. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 5233462 (2021).
- Reers, M., et al. Mitochondrial membrane potential monitored by JC-1 dye. Methods in Enzymology. 260, 406-417 (1995).
- Radovits, T., et al. Poly(ADP-ribose) polymerase inhibition improves endothelial dysfunction induced by reactive oxidant hydrogen peroxide in vitro. European Journal of Pharmacology. 564 (1-3), 158-166 (2007).
- Song, M., et al. Interdependence of parkin-mediated mitophagy and mitochondrial fission in adult mouse hearts. Circulation Research. 117 (4), 346-351 (2015).
- Gan, Z. Y., et al. Activation mechanism of PINK1. Nature. 602 (7896), 328-335 (2022).
- Nguyen, T. N., Padman, B. S., Lazarou, M. Deciphering the molecular signals of PINK1/Parkin mitophagy. Trends in Cell Biology. 26 (10), 733-744 (2016).
- Yamada, T., Dawson, T. M., Yanagawa, T., Iijima, M., Sesaki, H. SQSTM1/p62 promotes mitochondrial ubiquitination independently of PINK1 and PRKN/parkin in mitophagy. Autophagy. 15 (11), 2012-2018 (2019).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition). Autophagy. 17 (1), 1 (2021).
