Protección de las células miocárdicas H9c2 del estrés oxidativo por crocetina a través de la mitofagia mediada por la vía PINK1 / Parkin
Summary
Basado en experimentos in vitro , este estudio reveló el mecanismo de la crocetina en la reparación del daño por estrés oxidativo de los cardiomiocitos al influir en la mitofagia, en la que la vía de señalización PINK1 / Parkin juega un papel importante.
Abstract
Este estudio tuvo como objetivo explorar el efecto protector del estrés oxidativo de la crocetina en las células miocárdicas H9c2 mediadas porH2O2 a través de experimentos in vitro, y explorar más a fondo si su mecanismo está relacionado con el impacto de la mitofagia. Este estudio también tuvo como objetivo demostrar el efecto terapéutico del ácido cártamo sobre el estrés oxidativo en cardiomiocitos y explorar si su mecanismo está relacionado con el efecto de la mitofagia. Aquí, se construyó un modelo de estrés oxidativo basado enH2O2y se evaluó el grado de lesión por estrés oxidativo de los cardiomiocitos mediante la detección de los niveles de lactato deshidrogenasa (LDH), creatina quinasa (CK), malondialdehído (MDA), superóxido dismutasa (SOD), catalasa (CAT) y glutatión peroxidasa (GSH Px). Se emplearon colorantes fluorescentes detectores de especies reactivas de oxígeno (ROS) DCFH-DA, colorante JC-1 y colorante TUNEL para evaluar el daño mitocondrial y la apoptosis. El flujo autofágico se midió mediante la transfección de adenovirus Ad-mCherry-GFP-LC3B. Las proteínas relacionadas con la mitofagia se detectaron a través de Western blot e inmunofluorescencia. Sin embargo, la crocetina (0,1-10 μM) podría mejorar significativamente la viabilidad celular y reducir la apoptosis y el daño por estrés oxidativo causado porH2O2. En células con activación autofágica excesiva, la crocetina también podría reducir el flujo de autofagia y la expresión de proteínas relacionadas con la mitofagia PINK1 y Parkin, y revertir la transferencia de Parkin a las mitocondrias. La crocetina podría reducir el daño por estrés oxidativo mediado porH2O2y la apoptosis de las célulasH9c2, y su mecanismo estaba estrechamente relacionado con la mitofagia.
Introduction
El infarto agudo de miocardio (IAM) es una necrosis miocárdica potencialmente mortal causada por isquemia e hipoxia graves y persistentes en las arterias coronarias 1,2. La intervención coronaria percutánea (ICP) es una de las estrategias terapéuticas de primera línea para el IAM, y generalmente protege a los cardiomiocitos del daño isquémico 3,4. El miocardio distal carecerá de suministro de sangre y oxígeno si no se trata con prontitud y eficacia después del IAM, lo que conduce a necrosis isquémica y complicaciones cardiovasculares adicionales 5,6. Promover la recuperación de cardiomiocitos y minimizar el daño miocárdico irreversible después de perder la oportunidad quirúrgica de ICP ha sido un punto caliente de investigación. Después del IAM, los cardiomiocitos se encuentran en un estado de isquemia e hipoxia, lo que resulta en la inhibición de la fosforilación oxidativa mitocondrial, la reducción de NAD + a NADPH y el aumento de la reducción de un solo electrón7. Como resultado, la reacción de reducción incompleta del oxígeno genera un exceso de especies reactivas de oxígeno (ROS) y, en última instancia, conduce al daño por estrés oxidativo de los cardiomiocitos8. Una acumulación excesiva de ROS desencadena la peroxidación lipídica, alterando aún más la estructura y función de las membranas mitocondriales. El resultado es una apertura continua de los poros de transición de permeabilidad mitocondrial y una disminución del potencial de la membrana mitocondrial, induciendo apoptosis y necrosis.
Los inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (ECA), los bloqueadores de los receptores de angiotensina (BRA), los inhibidores de los β receptores adrenérgicos, los antagonistas de la aldosterona y otros fármacos estándar en el IAM pueden ayudar a mejorar la función cardíaca después del infarto de miocardio y prevenir la aparición de eventos malignos, como arritmias y remodelación ventricular izquierda9. Sin embargo, la supervivencia y el pronóstico postinfarto se ven muy afectados por el tamaño del infarto, y no se han logrado resultados satisfactorios para reducir la apoptosis cardiomiocitaria10,11. Por lo tanto, el desarrollo de fármacos para promover la recuperación de los cardiomiocitos después del infarto de miocardio se ha convertido en un tema urgente.
La medicina tradicional ha sido una fuente de inspiración para la investigación farmacéutica moderna durante muchos años12,13,14,15. La medicina tradicional china (MTC) tiene una larga historia en el tratamiento del IAM, y una serie de ensayos controlados aleatorios en los últimos años han confirmado que la MTC puede mejorar el pronóstico de los pacientes16,17. De acuerdo con la teoría de la MTC, el IAM es causado por la estasis sanguínea18,19, por lo que los medicamentos para promover la circulación sanguínea se utilizan generalmente para el tratamiento del IAM en la fase aguda20. Entre ellos, se cree que el azafrán tiene un poderoso efecto sobre la activación y la estasis de la sangre, y se usa a menudo en el tratamiento agudo del IAM. La crocetina, un componente importante del azafrán, puede desempeñar un papel clave en la protección de los cardiomiocitos21.
En este estudio, las células miocárdicas H9c2 fueron inducidas porH2O2para simular isquemia/reperfusión miocárdica, que causa una lesión cardiomiocitaria del IAM, y la crocetina se utilizó como una intervención para investigar su efecto protector contra la lesión miocárdica inducida por el estrés oxidativo. El mecanismo de crocetina que protege a los cardiomiocitos se exploró más a fondo a través de la mitofagia. Más importante aún, este artículo proporciona una referencia para el enfoque técnico para el estudio de la mitofagia y describe todo el procedimiento experimental en detalle.
Protocol
Representative Results
Discussion
La exploración de ingredientes efectivos a partir de compuestos complejos de medicamentos naturales a través de tecnología avanzada ha sido un punto caliente de la investigación de la MTC29, y puede proporcionar evidencia de laboratorio para el desarrollo futuro de medicamentos después de la verificación. El cártamo es un fármaco representativo en el tratamiento de “promover la circulación sanguínea y minimizar la estasis sanguínea” y es ampliamente utilizado en el tratamiento del infar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por la Fundación de Ciencias Naturales de Beijing (No. 7202119) y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 82274380).
Materials
| 0.25% trypsin | Gibco | 2323363 | |
| 1% Penicillin-streptomycin | Sigma | V900929 | |
| 5x protein loading buffer | Beijing Pulilai Gene Technology | B1030-5 | |
| Ad-mCherry GFP-LC3B adenovirus | Beyotime | C3011 | |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZF-0514 | |
| Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZF-0513 | |
| Animal-free blocking solution | CST | 15019s | |
| Anti-Parkin antibody | Santa Cruz | sc-32282 | |
| Anti-PINK1 antibody | ABclonal | A11435 | |
| Anti-TOM20 antibody | ABclonal | A19403 | |
| Anti-β-actin antibody | ABclonal | AC026 | |
| BCA protein assay kit | KeyGEN Biotech | KGP902 | |
| Blood cell counting plate | Servicebio | WG607 | |
| CAT assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A007-1-1 | |
| Chemiluminescence detection system | Shanghai Qinxiang Scientific Instrument Factory | ChemiScope 6100 | |
| CK assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A032-1-1 | |
| Coenzyme Q10 (CoQ 10) | Macklin | C6129 | |
| Crocetin | Chengdu Ruifensi Biotechnology Co., Ltd. | RFS-Z01802006012 | |
| DAPI-containing antifluorescence quenching tablets | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZLI-9557 | |
| DCFH-DA | Beyotime | S0033S | |
| DMSO | Solarbio | D8371 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Gibco | 8122091 | |
| Enhanced Chemiluminescence (ECL) solution | NCM Biotech | P10100 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning-Cellgro | 35-081-CV | |
| GraphPad Prism 7.0 | https://www.graphpad.com/ | ||
| GSH-Px assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A005-1-2 | |
| H9c2 myocardial cells | Beijing Dingguochangsheng Biotech Co., Ltd. | CS0062 | |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-goat IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZB-2305 | |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZB-2301 | |
| JC-1 mitochondrial membrane potential assay kit | LABLEAD | J22202 | |
| LDH assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A020-2-2 | |
| MDA assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A003-2-2 | |
| Methanol | Aladdin | A2114057 | |
| MTS assay | Promega | G3581 | |
| Perhydrol | G-clone | CS7730 | |
| Phosphatase inhibitor | CWBIO | CW2383 | |
| Polybrene | Beyotime | C0351 | |
| Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes | Millipore | ISEQ00010 | |
| Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) lysis buffer | Solarbio | R0010 | |
| SDS-PAGE gels | Shanghai Epizyme Biomedical Technology | PG112 | |
| SDS-PAGE running buffer powder | Servicebio | G2018-1L | |
| SDS-PAGE transfer buffer powder | Servicebio | G2017-1L | |
| SOD assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A001-2-2 | |
| Tris-buffered saline powder | Servicebio | G0001-2L | |
| Triton X-100 | Sigma | SLCC9172 | |
| TUNEL apoptosis assay kit | Beyotime | C1086 | |
| Tween-20 | Solarbio | T8220 |
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