Summary

حماية خلايا عضلة القلب H9c2 من الإجهاد التأكسدي بواسطة الكروسيتين عبر PINK1 / Parkin Pathway بوساطة الميتوفاجي

Published: May 26, 2023
doi:

Summary

استنادا إلى التجارب المختبرية ، كشفت هذه الدراسة عن آلية الكروسيتين في إصلاح تلف الإجهاد التأكسدي لخلايا عضلة القلب من خلال التأثير على الميتوفاجي ، حيث يلعب مسار إشارات PINK1 / Parkin دورا مهما.

Abstract

تهدف هذه الدراسة إلى استكشاف التأثير التأكسدي الوقائي للكروسيتين على خلايا عضلة القلبH2 O2 بوساطة H9c2 من خلال التجارب في المختبر ، واستكشاف ما إذا كانت آليتها مرتبطة بتأثير الميتوفاجي. تهدف هذه الدراسة أيضا إلى إظهار التأثير العلاجي لحمض القرطم على الإجهاد التأكسدي في خلايا عضلة القلب واستكشاف ما إذا كانت آليته مرتبطة بتأثير الميتوفاجي. هنا ، تم بناء نموذج الإجهاد التأكسدي القائم على H 2 O2وتقييم درجة إصابة الإجهاد التأكسدي لخلايا عضلة القلب من خلال الكشف عن مستويات نازعة هيدروجين اللاكتات (LDH) ، كيناز الكرياتين (CK) ، malondialdehyde (MDA) ، ديسموتاز الفائق (SOD) ، الكاتلاز (CAT) ، والجلوتاثيون بيروكسيديز (GSH Px). تم استخدام أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) – صبغة الفلورسنت المكتشفة DCFH-DA ، JC-1 dye ، وصبغة TUNEL لتقييم تلف الميتوكوندريا وموت الخلايا المبرمج. تم قياس تدفق الالتهام الذاتي عن طريق نقل الفيروس الغدي Ad-mCherry-GFP-LC3B. ثم تم الكشف عن البروتينات المرتبطة بالميتوفاجي عن طريق النشاف الغربي والتألق المناعي. ومع ذلك ، يمكن للكروسيتين (0.1-10 ميكرومتر) أن يحسن بشكل كبير من صلاحية الخلية ويقلل من موت الخلايا المبرمج وتلف الإجهاد التأكسدي الناجم عن H 2 O2. في الخلايا ذات التنشيط المفرط للالتهام الذاتي ، يمكن أن يقلل الكروسيتين أيضا من تدفق الالتهام الذاتي والتعبير عن البروتينات المرتبطة بالميتوفاجي PINK1 و Parkin ، وعكس نقل Parkin إلى الميتوكوندريا. يمكن أن يقلل الكروسيتين من تلف الإجهاد التأكسدي بوساطة H2O2 وموت الخلايا المبرمج لخلايا H9c2 ، وكانت آليته مرتبطة ارتباطا وثيقا بالميتوفاجي.

Introduction

احتشاء عضلة القلب الحاد (AMI) هو نخر عضلة القلب الذي يهدد الحياة والناجم عن نقص التروية الشديد والمستمر ونقص الأكسجة في الشرايين التاجية 1,2. التدخل التاجي عن طريق الجلد (PCI) هو أحد استراتيجيات الخط الأول العلاجية ل AMI ، وعادة ما يحمي خلايا عضلة القلب من التلف الإقفاري 3,4. ستفتقر عضلة القلب البعيدة إلى إمدادات الدم والأكسجين إذا لم يتم علاجها على الفور وبشكل فعال بعد AMI ، مما يؤدي إلى نخر نقص تروية ومضاعفات القلب والأوعية الدمويةالأخرى 5,6. كان تعزيز تعافي خلايا عضلة القلب وتقليل تلف عضلة القلب الذي لا رجعة فيه بعد تفويت الفرصة الجراحية PCI نقطة ساخنة للبحث. بعد AMI ، تكون خلايا عضلة القلب في حالة نقص التروية ونقص الأكسجة ، مما يؤدي إلى تثبيط الفسفرة التأكسدية للميتوكوندريا ، وتقليل NAD + إلى NADPH ، وزيادة تقليل الإلكترون الفردي7. نتيجة لذلك ، يولد تفاعل الاختزال غير المكتمل للأكسجين فائضا من أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ويؤدي في النهاية إلى تلف الإجهاد التأكسدي لخلايا عضلة القلب8. يؤدي التراكم المفرط لأنواع الأكسجين التفاعلية إلى بيروكسيد الدهون ، مما يزيد من تعطيل بنية ووظيفة أغشية الميتوكوندريا. والنتيجة هي فتح مستمر للمسام الانتقالية لنفاذية الميتوكوندريا وانخفاض في إمكانات غشاء الميتوكوندريا ، مما يؤدي إلى موت الخلايا المبرمج والنخر.

يمكن أن تساعد مثبطات الإنزيم المحول للأنجيوتنسين (ACE) ، وحاصرات مستقبلات الأنجيوتنسين (ARBs) ، ومثبطات مستقبلات β الأدرينالين ، ومضادات الألدوستيرون ، والأدوية القياسية الأخرى في AMI في تعزيز وظائف القلب بعد احتشاء عضلة القلب ومنع حدوث الأحداث الخبيثة ، مثل عدم انتظام ضربات القلب وإعادة تشكيل البطين الأيسر9. ومع ذلك ، يتأثر البقاء على قيد الحياة والتشخيص بعد الاحتشاء بشكل كبير بحجم الاحتشاء ، ولم يتم تحقيق نتائج مرضية للحد من موت الخلايا المبرمج في عضلة القلب10,11. وبالتالي ، أصبح تطوير الأدوية لتعزيز انتعاش عضلة القلب بعد احتشاء عضلة القلب قضية ملحة.

كان الطب التقليدي مصدر إلهام للبحوث الصيدلانية الحديثة لسنواتعديدة 12،13،14،15. الطب الصيني التقليدي (TCM) له تاريخ طويل في علاج AMI ، وقد أكدت سلسلة من تجارب التحكم العشوائية في السنوات الأخيرة أن الطب الصيني التقليدي يمكن أن يحسن بالفعل تشخيص المرضى16,17. وفقا لنظرية الطب الصيني التقليدي ، يحدث AMI بسبب ركود الدم18,19 ، لذلك عادة ما تستخدم أدوية تعزيز الدورة الدموية لعلاج AMI في المرحلة الحادة20. من بينها ، يعتقد أن الزعفران له تأثير قوي على تنشيط الدم والركود ، وغالبا ما يستخدم في العلاج الحاد ل AMI. قد يلعب الكروسيتين ، وهو مكون رئيسي للزعفران ، دورا رئيسيا في حماية خلايا عضلة القلب21.

في هذه الدراسة ، تم تحفيز خلايا عضلة القلب H9c2 بواسطة H 2 O2لمحاكاة نقص تروية عضلة القلب / إعادة التروية ، والتي تسبب إصابة عضلة القلب في AMI ، وتم استخدام الكروسيتين كتدخل للتحقيق في تأثيره الوقائي ضد إصابة عضلة القلب الناجمة عن الإجهاد التأكسدي. تم استكشاف آلية حماية الكروسيتين لخلايا عضلة القلب من خلال الميتوفاجي. الأهم من ذلك ، توفر هذه المقالة مرجعا للنهج التقني لدراسة الميتوفاجي وتصف الإجراء التجريبي بأكمله بالتفصيل.

Protocol

أجريت التجارب في مختبر علم وظائف الأعضاء في جامعة بكين للطب الصيني ، الصين. تم تنفيذ جميع طرق الدراسة وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح ذات الصلة بجامعة بكين. 1. ثقافة الخلية أضف 10٪ مصل بقري جنيني و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين إلى وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco (مع 4.5 جم…

Representative Results

آثار الكروسيتين على صلاحية الخليةكان للكروسيتين عند 0.1 ميكرومتر و 0.5 ميكرومتر و 1 ميكرومتر و 5 ميكرومتر و 10 ميكرومتر و 50 ميكرومتر و 100 ميكرومتر تأثير تكاثري كبير على الخلايا ، بينما منع الكروسيتين بتركيزات أعلى من 200 ميكرومتر بشكل كبير تكاثر خلايا H9c2 (الشكل 1 أ). بعد…

Discussion

كان استكشاف المكونات الفعالة من المركبات المعقدة للعقاقير الطبيعية من خلال التكنولوجيا المتقدمة نقطة ساخنة لأبحاث الطب الصيني التقليدي29 ، ويمكن أن يوفر أدلة مختبرية لتطوير الأدوية في المستقبل بعد التحقق. القرطم هو دواء تمثيلي في علاج “تعزيز الدورة الدموية وتقليل ركود الدم” …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم دعم هذه الدراسة من قبل مؤسسة بكين للعلوم الطبيعية (رقم 7202119) والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 82274380).

Materials

0.25% trypsin Gibco 2323363
1% Penicillin-streptomycin Sigma V900929
5x protein loading buffer Beijing Pulilai Gene Technology B1030-5
Ad-mCherry GFP-LC3B adenovirus Beyotime C3011
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)  Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. ZF-0514
Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. ZF-0513
Animal-free blocking solution CST 15019s
Anti-Parkin antibody Santa Cruz sc-32282
Anti-PINK1 antibody ABclonal A11435
Anti-TOM20 antibody ABclonal A19403
Anti-β-actin  antibody ABclonal AC026
BCA protein assay kit KeyGEN Biotech KGP902
Blood cell counting plate Servicebio WG607
CAT assay kits Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A007-1-1
Chemiluminescence detection system Shanghai Qinxiang Scientific Instrument Factory ChemiScope 6100
CK assay kits Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A032-1-1
Coenzyme Q10 (CoQ 10) Macklin C6129
Crocetin Chengdu Ruifensi Biotechnology Co., Ltd. RFS-Z01802006012
DAPI-containing antifluorescence quenching tablets Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. ZLI-9557
DCFH-DA Beyotime S0033S
DMSO Solarbio D8371
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) Gibco 8122091
Enhanced Chemiluminescence (ECL) solution NCM Biotech P10100
Fetal bovine serum (FBS) Corning-Cellgro 35-081-CV
GraphPad Prism 7.0  https://www.graphpad.com/
GSH-Px assay kits Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A005-1-2
H9c2 myocardial cells Beijing Dingguochangsheng Biotech Co., Ltd. CS0062
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-goat IgG (H+L)  Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. ZB-2305
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)  Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. ZB-2301
JC-1 mitochondrial membrane potential assay kit LABLEAD J22202
LDH assay kits Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A020-2-2
MDA assay kits Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A003-2-2
Methanol Aladdin A2114057
MTS assay Promega G3581
Perhydrol G-clone CS7730
Phosphatase inhibitor CWBIO CW2383
Polybrene Beyotime C0351
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes Millipore ISEQ00010
Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) lysis buffer Solarbio R0010
SDS-PAGE gels Shanghai Epizyme Biomedical Technology PG112
SDS-PAGE running buffer powder Servicebio G2018-1L
SDS-PAGE transfer buffer powder Servicebio G2017-1L
SOD assay kits Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A001-2-2
Tris-buffered saline powder Servicebio G0001-2L
Triton X-100 Sigma SLCC9172
TUNEL apoptosis assay kit Beyotime C1086
Tween-20 Solarbio T8220

References

  1. Anderson, J. L., Morrow, D. A. Acute myocardial infarction. The New England Journal of Medicine. 376 (21), 2053-2064 (2017).
  2. Samsky, M. D., et al. Cardiogenic shock after acute myocardial infarction: a review. JAMA. 326 (18), 1840-1850 (2021).
  3. Abbate, A., et al. Survival and cardiac remodeling benefits in patients undergoing late percutaneous coronary intervention of the infarct-related artery: evidence from a meta-analysis of randomized controlled trials. Journal of the American College of Cardiology. 51 (9), 956-964 (2008).
  4. Santoro, G. M., Carrabba, N., Migliorini, A., Parodi, G., Valenti, R. Acute heart failure in patients with acute myocardial infarction treated with primary percutaneous coronary intervention. European Journal of Heart Failure. 10 (8), 780-785 (2008).
  5. Dhruva, S. S., et al. Association of use of an intravascular microaxial left ventricular assist device vs intra-aortic balloon pump with in-hospital mortality and major bleeding among patients with acute myocardial infarction complicated by cardiogenic shock. JAMA. 323 (8), 734-745 (2020).
  6. Wang, Y., et al. Risk factors associated with major cardiovascular events 1 year after acute myocardial infarction. JAMA Network Open. 1 (4), e181079 (2018).
  7. Jou, M. J., et al. Melatonin protects against common deletion of mitochondrial DNA-augmented mitochondrial oxidative stress and apoptosis. Journal of Pineal Research. 43 (4), 389-403 (2007).
  8. La Piana, G., Fransvea, E., Marzulli, D., Lofrumento, N. E. Mitochondrial membrane potential supported by exogenous cytochrome c oxidation mimics the early stages of apoptosis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 246 (2), 556-561 (1998).
  9. De Filippo, O., et al. Impact of secondary prevention medical therapies on outcomes of patients suffering from Myocardial Infarction with NonObstructive Coronary Artery disease (MINOCA): A meta-analysis. International Journal of Cardiology. 368, 1-9 (2022).
  10. Davidson, S. M., et al. Multitarget strategies to reduce myocardial ischemia/reperfusion injury: JACC review topic of the week. Journal of the American College of Cardiology. 73 (1), 89-99 (2019).
  11. Caricati-Neto, A., Errante, P. R., Menezes-Rodrigues, F. S. Recent advances in pharmacological and non-pharmacological strategies of cardioprotection. International Journal of Molecular Sciences. 20 (16), 4002 (2019).
  12. Chen, G. Y., et al. Network pharmacology analysis and experimental validation to investigate the mechanism of total flavonoids of rhizoma drynariae in treating rheumatoid arthritis. Drug Design, Development, and Therapy. 16, 1743-1766 (2022).
  13. Wei, Z., et al. Traditional Chinese medicine has great potential as candidate drugs for lung cancer: A review. Journal of Ethnopharmacology. 300, 115748 (2023).
  14. Zhi, W., Liu, Y., Wang, X., Zhang, H. Recent advances of traditional Chinese medicine for the prevention and treatment of atherosclerosis. Journal of Ethnopharmacology. 301, 115749 (2023).
  15. Liu, M., et al. Hypertensive heart disease and myocardial fibrosis: How traditional Chinese medicine can help addressing unmet therapeutical needs. Pharmacological Research. 185, 106515 (2022).
  16. Zhang, X. X., et al. Traditional Chinese medicine intervenes ventricular remodeling following acute myocardial infarction: evidence from 40 random controlled trials with 3,659 subjects. Frontiers in Pharmacology. 12, 707394 (2021).
  17. Hao, P., et al. Traditional Chinese medicine for cardiovascular disease: evidence and potential mechanisms. Journal of the American College of Cardiology. 69 (24), 2952-2966 (2017).
  18. Delgado-Montero, A., et al. Blood stasis imaging predicts cerebral microembolism during acute myocardial infarction. Journal of the American Society of Echocardiography. 33 (3), 389-398 (2020).
  19. Lu, C. Y., Lu, P. C., Chen, P. C. Utilization trends in traditional Chinese medicine for acute myocardial infarction. Journal of Ethnopharmacology. 241, 112010 (2019).
  20. Gao, Z. Y., Xu, H., Shi, D. Z., Wen, C., Liu, B. Y. Analysis on outcome of 5284 patients with coronary artery disease: the role of integrative medicine. Journal of Ethnopharmacology. 141 (2), 578-583 (2012).
  21. Huang, Z., et al. Crocetin ester improves myocardial ischemia via Rho/ROCK/NF-kappaB pathway. International Immunopharmacology. 38, 186-193 (2016).
  22. Green, M. R., Sambrook, J. Estimation of cell number by hemocytometry counting. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (11), (2019).
  23. Zeng, Q., et al. Assessing the potential value and mechanism of Kaji-Ichigoside F1 on arsenite-induced skin cell senescence. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2022, 9574473 (2022).
  24. Chazotte, B. Labeling mitochondria with JC-1. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (9), (2011).
  25. Kyrylkova, K., Kyryachenko, S., Leid, M., Kioussi, C. Detection of apoptosis by TUNEL assay. Methods in Molecular Biology. 887, 41-47 (2012).
  26. Yuan, Y., et al. Palmitate impairs the autophagic flux to induce p62-dependent apoptosis through the upregulation of CYLD in NRCMs. Toxicology. 465, 153032 (2022).
  27. Kurien, B. T., Scofield, R. H. Western blotting. Methods. 38 (4), 283-293 (2006).
  28. Chen, G. Y., et al. Total flavonoids of rhizoma drynariae restore the MMP/TIMP balance in models of osteoarthritis by inhibiting the activation of the NF-κB and PI3K/AKT pathways. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 6634837 (2021).
  29. Amin, A., Hamza, A. A., Bajbouj, K., Ashraf, S. S., Daoud, S. Saffron: a potential candidate for a novel anticancer drug against hepatocellular carcinoma. Hepatology. 54 (3), 857-867 (2011).
  30. Kamalipour, M., Akhondzadeh, S. Cardiovascular effects of saffron: an evidence-based review. The Journal of Tehran Heart Center. 6 (2), 59-61 (2011).
  31. Mani, V., Lee, S. K., Yeo, Y., Hahn, B. S. A metabolic perspective and opportunities in pharmacologically important safflower. Metabolites. 10 (6), 253 (2020).
  32. Broadhead, G. K., Chang, A., Grigg, J., McCluskey, P. Efficacy and safety of saffron supplementation: current clinical findings. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 56 (16), 2767-2776 (2016).
  33. Gao, H., et al. Insight into the protective effect of salidroside against H2O2-induced injury in H9C2 cells. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 1060271 (2021).
  34. Chen, G. Y., et al. Prediction of rhizoma drynariae targets in the treatment of osteoarthritis based on network pharmacology and experimental verification. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 5233462 (2021).
  35. Reers, M., et al. Mitochondrial membrane potential monitored by JC-1 dye. Methods in Enzymology. 260, 406-417 (1995).
  36. Radovits, T., et al. Poly(ADP-ribose) polymerase inhibition improves endothelial dysfunction induced by reactive oxidant hydrogen peroxide in vitro. European Journal of Pharmacology. 564 (1-3), 158-166 (2007).
  37. Song, M., et al. Interdependence of parkin-mediated mitophagy and mitochondrial fission in adult mouse hearts. Circulation Research. 117 (4), 346-351 (2015).
  38. Gan, Z. Y., et al. Activation mechanism of PINK1. Nature. 602 (7896), 328-335 (2022).
  39. Nguyen, T. N., Padman, B. S., Lazarou, M. Deciphering the molecular signals of PINK1/Parkin mitophagy. Trends in Cell Biology. 26 (10), 733-744 (2016).
  40. Yamada, T., Dawson, T. M., Yanagawa, T., Iijima, M., Sesaki, H. SQSTM1/p62 promotes mitochondrial ubiquitination independently of PINK1 and PRKN/parkin in mitophagy. Autophagy. 15 (11), 2012-2018 (2019).
  41. Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition). Autophagy. 17 (1), 1 (2021).

Play Video

Cite This Article
Chen, J., Li, Y., Zhang, Y., Du, T., Lu, Y., Li, X., Guo, S. Protection of H9c2 Myocardial Cells from Oxidative Stress by Crocetin via PINK1/Parkin Pathway-Mediated Mitophagy. J. Vis. Exp. (195), e65105, doi:10.3791/65105 (2023).

View Video