Transmitochondriale Cybrid-Generierung mit Hilfe von Krebszelllinien
Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine Technik zur Cybrid-Generierung aus suspensionswachsenden Krebszellen, um die Rolle der Mitochondrien im tumorigenen Prozess zu untersuchen.
Abstract
In den letzten Jahren ist die Zahl der Studien, die sich mit der Aufklärung des Zusammenhangs zwischen Mitochondrien und Krebs befassen, deutlich gestiegen. Es sind jedoch noch weitere Anstrengungen erforderlich, um den Zusammenhang zwischen Veränderungen der Mitochondrien und der Tumorentstehung vollständig zu verstehen und tumorassoziierte mitochondriale Phänotypen zu identifizieren. Um beispielsweise den Beitrag von Mitochondrien bei Tumorentstehungs- und Metastasierungsprozessen zu bewerten, ist es wichtig, den Einfluss von Mitochondrien aus Tumorzellen in verschiedenen nukleären Umgebungen zu verstehen. Ein möglicher Ansatz besteht darin, Mitochondrien in einen anderen Kernhintergrund zu überführen, um die sogenannten Cybridzellen zu erhalten. Bei den traditionellen Cybridisierungstechniken wird eine Zelllinie, der mtDNA fehlt (ρ0, Kernspenderzelle), mit Mitochondrien neu besiedelt, die entweder von enukleierten Zellen oder Blutplättchen stammen. Der Enukleationsprozess erfordert jedoch eine gute Zelladhäsion auf der Kulturplatte, eine Eigenschaft, die in vielen Fällen bei invasiven Zellen teilweise oder vollständig verloren geht. Darüber hinaus besteht eine weitere Schwierigkeit bei den traditionellen Methoden darin, die endogene mtDNA vollständig aus der mitochondrialen Empfängerzelllinie zu entfernen, um reine nukleäre und mitochondriale DNA-Hintergründe zu erhalten, wodurch das Vorhandensein von zwei verschiedenen mtDNA-Spezies in der erzeugten Cybrid vermieden wird. In dieser Arbeit stellen wir ein mitochondriales Austauschprotokoll vor, das auf suspensionswachsende Krebszellen angewendet wird, basierend auf der Wiederbesiedlung von Rhodamin 6G-vorbehandelten Zellen mit isolierten Mitochondrien. Diese Methodik ermöglicht es uns, die Einschränkungen der traditionellen Ansätze zu überwinden und kann daher als Werkzeug verwendet werden, um das Verständnis der mitochondrialen Rolle bei der Krebsprogression und Metastasierung zu erweitern.
Introduction
Die Reprogrammierung des Energiestoffwechsels ist ein Kennzeichen von Krebs1, das erstmals in den 1930er Jahren von Otto Warburg beobachtet wurde2. Unter aeroben Bedingungen wandeln normale Zellen Glukose in Pyruvat um, das dann Acetyl-CoA erzeugt, das die mitochondriale Maschinerie antreibt und die Zellatmung fördert. Dennoch zeigte Warburg, dass die meisten Krebszellen auch unter normoxischen Bedingungen Pyruvat, das sie bei der Glykolyse erhalten, in Laktat umwandeln und sich so auf die Energiegewinnung verlagern. Diese metabolische Anpassung wird als “Warburg-Effekt” bezeichnet und ermöglicht es einigen Krebszellen, ihren Energiebedarf für schnelles Wachstum und Teilung zu decken, obwohl sie ATP weniger effizient erzeugen als der aerobe Prozess 3,4,5. In den letzten Jahrzehnten haben zahlreiche Arbeiten die Bedeutung der Reprogrammierung des Stoffwechsels für das Fortschreiten von Krebs unterstützt. Daher wird die Tumorenergetik als interessantes Ziel gegen Krebs angesehen1. Als zentrale Drehscheibe im energetischen Stoffwechsel und bei der Versorgung mit essentiellen Vorstufen spielen Mitochondrien eine Schlüsselrolle bei diesen Zellanpassungen, die wir bisher nur teilweise verstehen.
In Übereinstimmung mit dem oben Gesagten wurden mitochondriale DNA-Mutationen (mtDNA) als eine der möglichen Ursachen für diese metabolische Reprogrammierung vorgeschlagen, die zu einer beeinträchtigtenLeistung der Elektronentransportkette (ETC) führen könnte 6 und erklären würde, warum einige Krebszellen ihren glykolytischen Stoffwechsel verbessern, um zu überleben. Tatsächlich wurde berichtet, dass mtDNA Mutationen in Krebszellen akkumuliert, die in mindestens 50 % der Tumore vorhanden sind7. Eine kürzlich von Yuan et al. durchgeführte Studie berichtete beispielsweise über das Vorhandensein von hypermutierten und verkürzten mtDNA-Molekülen bei Nieren-, Darm- und Schilddrüsenkrebs8. Darüber hinaus haben viele Arbeiten gezeigt, dass bestimmte mtDNA-Mutationen mit einem aggressiveren Tumorphänotyp und einer Erhöhung des Metastasierungspotenzials von Krebszellen assoziiertsind 9,10,11,12,13,14,15,16.
Trotz der offensichtlichen Bedeutung des mitochondrialen Genoms für das Fortschreiten von Krebs war die Untersuchung dieser Mutationen und ihres Beitrags zur Krankheit aufgrund der Einschränkungen der derzeit verfügbaren experimentellen Modelle und Technologien eine Herausforderung17. Daher werden neue Techniken benötigt, um den tatsächlichen Einfluss der Mitochondrien-DNA auf die Entwicklung und das Fortschreiten von Krebserkrankungen zu verstehen. In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll zur transmitochondrialen Cybrid-Erzeugung aus suspensionswachsenden Krebszellen vor, das auf der Wiederbesiedlung von Rhodamin 6G-vorbehandelten Zellen mit isolierten Mitochondrien basiert und die Hauptherausforderungen traditioneller Cybridisierungsmethoden überwindet18,19. Diese Methodik ermöglicht die Verwendung eines beliebigen Zellkernspenders, unabhängig von der Verfügbarkeit der entsprechenden ρ0-Zelllinie und den Transfer von Mitochondrien aus Zellen, die nach den traditionellen Techniken schwer zu enukleieren wären (d. h. nicht adhärente Zelllinien).
Protocol
Representative Results
Discussion
Seit Otto Warburg berichtete, dass Krebszellen ihren Stoffwechsel verändern und die “aerobe Glykolyse”3,4 potenzieren, während sie gleichzeitig die mitochondriale Atmung reduzieren, ist das Interesse an der Rolle der Mitochondrien bei der Transformation und Progression von Krebs exponentiell gewachsen. In den letzten Jahren wurden Mutationen in der mtDNA und mitochondriale Dysfunktionen als Kennzeichen vieler Krebsarten postuliert25. Bis…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde durch die Fördernummern PID2019-105128RB-I00 für RSA, JMB und AA und PGC2018-095795-B-I00 für PFS und RML finanziert, die beide von MCIN/AEI/10.13039/501100011033 und den Fördernummern B31_20R (RSA, JMA und AA) und E35_17R (PFS und RML) finanziert und von Gobierno de Aragón finanziert wurden. Die Arbeit der RSA wurde durch einen Zuschuss der Asociación Española Contra el Cáncer (AECC) PRDAR21487SOLE unterstützt. Die Autoren bedanken sich für die Verwendung von Servicio General de Apoyo a la Investigación-SAI, Universidad de Zaragoza.
Materials
| 3500XL Genetic Analyzer | ThermoFisher Scientific | 4406016 | |
| 6-well plate | Corning | 08-772-1B | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| AmpFlSTR Identifiler Plus PCR Amplification Kit | ThermoFisher Scientific | 4427368 | |
| Anode Buffer Container 3500 Series | Applied Biosystems | 4393927 | |
| Boric acid | PanReac | 131015 | |
| Bradford assay | Biorad | 5000002 | |
| Cathode Buffer Container 3500 Series | Applied Biosystems | 4408256 | |
| Cell culture flasks | TPP | 90076 | |
| DMEM high glucose | Gibco | 11965092 | |
| EDTA | PanReac | 131026 | |
| Ethidium Bromide | Sigma-Aldrich | E8751 | |
| Geneticin | Gibco | 10131027 | |
| Homogenizer Teflon pestle | Deltalab | 196102 | |
| L929 cell line | ATCC | CCL-1 | |
| MiniProtean Tetra4 Gel System | BioRad | 1658004 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| PCR primers | Sigma-Aldrich | Custom products | |
| Polyacrylamide Solution 30% | PanReac | A3626 | |
| Polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | P7181 | |
| POP-7 | Applied Biosystems | 4393714 | |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| QIAmp DNA Mini Kit | Qiagen | 51306 | |
| Rhodamine-6G | Sigma-Aldrich | R4127 | |
| Serum Fetal Bovine | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| SspI | New England Biolabs | R3132 | |
| Streptomycin/penicillin | PAN biotech | P06-07100 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S3089 | |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris | PanReac | P14030b | |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3750 |
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