Geração de Cybrid Transmitochondrial Usando Linhas de Células Cancerígenas

Summary

Este protocolo descreve uma técnica para geração de cybrid a partir de células cancerosas em crescimento em suspensão como uma ferramenta para estudar o papel das mitocôndrias no processo tumorigênico.

Abstract

Nos últimos anos, o número de estudos dedicados a determinar a ligação entre mitocôndrias e câncer aumentou significativamente. No entanto, mais esforços ainda são necessários para compreender completamente a ligação envolvendo alterações nas mitocôndrias e tumorigênese, bem como para identificar fenótipos mitocondriais associados ao tumor. Por exemplo, para avaliar a contribuição das mitocôndrias nos processos de tumorigênese e metástases, é essencial entender a influência das mitocôndrias de células tumorais em diferentes ambientes nucleares. Para isso, uma possível abordagem consiste em transferir mitocôndrias para um fundo nuclear diferente para obter as chamadas células cybrid. Nas técnicas tradicionais de cibridização, uma linhagem celular sem mtDNA (ρ⁰, célula doadora nuclear) é repovoada com mitocôndrias derivadas de células enucleadas ou plaquetas. No entanto, o processo de enucleação requer boa adesão celular à placa de cultura, característica que é parcial ou completamente perdida em muitos casos em células invasivas. Além disso, outra dificuldade encontrada nos métodos tradicionais é conseguir a remoção completa do mtDNA endógeno da linhagem celular receptora mitocondrial para obter fundos de DNA nuclear e mitocondrial puro, evitando a presença de duas espécies diferentes de mtDNA no cybrid gerado. Neste trabalho, apresentamos um protocolo de troca mitocondrial aplicado a células cancerosas em crescimento em suspensão, baseado na repopulação de células pré-tratadas com rodamina 6G com mitocôndrias isoladas. Esta metodologia permite superar as limitações das abordagens tradicionais e, assim, pode ser utilizada como uma ferramenta para ampliar a compreensão do papel mitocondrial na progressão e metástase do câncer.

Introduction

A reprogramação do metabolismo energético é uma marca do câncer¹ que foi observada pela primeira vez por Otto Warburg na década de 1930². Em condições aeróbicas, as células normais convertem a glicose em piruvato, que gera acetil-coA, alimentando a maquinaria mitocondrial e promovendo a respiração celular. No entanto, Warburg demonstrou que, mesmo sob condições normóxicas, a maioria das células cancerosas converte piruvato obtido do processo de glicólise em lactato, mudando seu caminho para obter energia. Esse ajuste metabólico é conhecido como “efeito Warburg” e permite que algumas células cancerosas suprim suas demandas energéticas de rápido crescimento e divisão, apesar de gerarem ATP de forma menos eficiente que o processo aeróbio ^3,4,5. Nas últimas décadas, numerosos trabalhos têm apoiado a implicação da reprogramação metabólica na progressão do câncer. Assim, a energética tumoral é considerada um alvo interessante contra o^câncer1. Como um centro central no metabolismo energético e no fornecimento de precursores essenciais, as mitocôndrias desempenham um papel fundamental nessas adaptações celulares que, até o momento, compreendemos apenas parcialmente.

Em consonância com o exposto, mutações no DNA mitocondrial (mtDNA) têm sido propostas como uma das possíveis causas dessa reprogramação metabólica, o que poderia levar a um comprometimento do desempenho da cadeia de transporte de elétrons (ETC)⁶ e explicaria por que algumas células cancerosas melhoram seu metabolismo glicolítico para sobreviver. De fato, tem sido relatado que o mtDNA acumula mutações dentro das células cancerosas, estando presente em pelo menos 50% dos^tumores7. Por exemplo, um estudo recente realizado por Yuan e col. relatou a presença de moléculas hipermutadas e truncadas do mtDNA em cânceres de rim, colorretal e tireoide⁸. Além disso, muitos trabalhos têm demonstrado que certas mutações no mtDNA estão associadas a um fenótipo tumoral mais agressivo e a um aumento no potencial metastático de células cancerígenas9,10,11,12,13,14,15,16.

Apesar da aparente relevância do genoma mitocondrial na progressão do câncer, o estudo dessas mutações e sua contribuição para a doença têm sido desafiadores devido às limitações dos modelos experimentais e tecnologias atualmente^{disponíveis17}. Assim, novas técnicas para entender o real impacto do DNA mitocondrial no desenvolvimento e progressão da doença oncológica são necessárias. Neste trabalho, apresentamos um protocolo para geração de cibridos transmitocondriais a partir de células cancerosas em suspensão, baseado na repopulação de células pré-tratadas com rodamina 6G com mitocôndrias isoladas, que supera os principais desafios dos métodos tradicionais de cibridização^18,19. Essa metodologia permite o uso de qualquer doador de núcleos independentemente da disponibilidade de sua linhagem celular ρ⁰ correspondente e a transferência de mitocôndrias de células que, seguindo as técnicas tradicionais, seriam difíceis de enuclear (i.e., linhagens celulares não aderentes).

Protocol

NOTA: Todos os meios de cultura e composições de buffer são especificados na Tabela 1. Antes da geração do cybrid, os perfis de DNA mitocondrial e nuclear das células doadoras e receptoras devem ser tipados para confirmar a presença de diferenças genéticas em ambos os genomas entre as linhagens celulares. Neste estudo, uma linhagem celular L929 comercialmente disponível e sua linhagem celular derivada, L929dt, que foi gerada espontaneamente em nosso laboratório (ver13 p…

Representative Results

Após seguir o protocolo acima apresentado, deve-se obter uma linhagem celular homoplasmática cybrid com fundo nuclear conservado, mas com um novo genótipo mitocondrial, conforme representado nos esquemas da Figura 1 e Figura 2. A pureza do DNA mitocondrial e nuclear presente nos cibrídeos pode ser confirmada por RFLP, como mostrado na Figura 3, e pela análise de genotipagem do DNA nuclear, como mostrado na …

Discussion

Desde que Otto Warburg relatou que as células cancerosas alteram seu metabolismo e potencializam a “glicólise aeróbica”^3,4 enquanto reduzem a respiração mitocondrial^, o interesse no papel das mitocôndrias na transformação e progressão do câncer tem crescido exponencialmente. Nos últimos anos, mutações no mtDNA e disfunção mitocondrial têm sido postuladas como características de muitos tipos de^câncer25. Até o momento, num…

Materials

3500XL Genetic Analyzer	ThermoFisher Scientific	4406016
6-well plate	Corning	08-772-1B
Ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	A3678
AmpFlSTR Identifiler Plus PCR Amplification Kit	ThermoFisher Scientific	4427368
Anode Buffer Container 3500 Series	Applied Biosystems	4393927
Boric acid	PanReac	131015
Bradford assay	Biorad	5000002
Cathode Buffer Container 3500 Series	Applied Biosystems	4408256
Cell culture flasks	TPP	90076
DMEM high glucose	Gibco	11965092
EDTA	PanReac	131026
Ethidium Bromide	Sigma-Aldrich	E8751
Geneticin	Gibco	10131027
Homogenizer Teflon pestle	Deltalab	196102
L929 cell line	ATCC	CCL-1
MiniProtean Tetra4 Gel System	BioRad	1658004
MOPS	Sigma-Aldrich	M1254
PCR primers	Sigma-Aldrich	Custom products
Polyacrylamide Solution 30%	PanReac	A3626
Polyethylene glycol	Sigma-Aldrich	P7181
POP-7	Applied Biosystems	4393714
Pyruvate	Sigma-Aldrich	P5280
QIAmp DNA Mini Kit	Qiagen	51306
Rhodamine-6G	Sigma-Aldrich	R4127
Serum Fetal Bovine	Sigma-Aldrich	F7524
SspI	New England Biolabs	R3132
Streptomycin/penicillin	PAN biotech	P06-07100
Sucrose	Sigma-Aldrich	S3089
TEMED	Sigma-Aldrich	T9281
Tris	PanReac	P14030b
Uridine	Sigma-Aldrich	U3750