Generazione di cibridi transmitocondriali utilizzando linee cellulari tumorali

Summary

Questo protocollo descrive una tecnica per la generazione di cibridi da cellule tumorali in sospensione come strumento per studiare il ruolo dei mitocondri nel processo tumorigenico.

Abstract

Negli ultimi anni, il numero di studi dedicati ad accertare la connessione tra mitocondri e cancro è aumentato in modo significativo. Tuttavia, sono ancora necessari ulteriori sforzi per comprendere appieno il legame che coinvolge le alterazioni nei mitocondri e nella tumorigenesi, nonché per identificare i fenotipi mitocondriali associati al tumore. Ad esempio, per valutare il contributo dei mitocondri nei processi di tumorigenesi e metastasi, è essenziale comprendere l’influenza dei mitocondri dalle cellule tumorali in diversi ambienti nucleari. A tal fine, un possibile approccio consiste nel trasferire i mitocondri in un diverso background nucleare per ottenere le cosiddette cellule cibridi. Nelle tecniche tradizionali di cibridizzazione, una linea cellulare priva di mtDNA (ρ⁰, cellula donatrice nucleare) viene ripopolata con mitocondri derivati da cellule enucleate o piastrine. Tuttavia, il processo di enucleazione richiede una buona adesione cellulare alla piastra di coltura, una caratteristica che viene parzialmente o completamente persa in molti casi nelle cellule invasive. Inoltre, un’altra difficoltà riscontrata nei metodi tradizionali è quella di ottenere la completa rimozione del mtDNA endogeno dalla linea cellulare mitocondriale-ricevente per ottenere sfondi di DNA nucleare e mitocondriale puro, evitando la presenza di due diverse specie di mtDNA nel cibride generato. In questo lavoro, presentiamo un protocollo di scambio mitocondriale applicato alle cellule tumorali in sospensione in crescita basato sul ripopolamento di cellule pretrattate con rodamina 6G con mitocondri isolati. Questa metodologia ci consente di superare i limiti degli approcci tradizionali e quindi può essere utilizzata come strumento per espandere la comprensione del ruolo mitocondriale nella progressione del cancro e nelle metastasi.

Introduction

Riprogrammare il metabolismo energetico è un segno distintivo del cancro¹ che è stato osservato per la prima volta da Otto Warburg nel 1930². In condizioni aerobiche, le cellule normali convertono il glucosio in piruvato, che poi genera acetil-coA, alimentando il macchinario mitocondriale e promuovendo la respirazione cellulare. Tuttavia, Warburg ha dimostrato che, anche in condizioni normossiche, la maggior parte delle cellule tumorali converte il piruvato ottenuto dal processo di glicolisi in lattato, spostando il loro modo di ottenere energia. Questo aggiustamento metabolico è noto come “effetto Warburg” e consente ad alcune cellule tumorali di soddisfare le loro richieste energetiche di crescita rapida e divisione, nonostante generino ATP in modo meno efficiente rispetto al processo aerobico ^3,4,5. Negli ultimi decenni, numerosi lavori hanno supportato l’implicazione della riprogrammazione del metabolismo nella progressione del cancro. Quindi, l’energetica del tumore è considerata un obiettivo interessante contro il cancro¹. Come hub centrale nel metabolismo energetico e nella fornitura di precursori essenziali, i mitocondri svolgono un ruolo chiave in questi adattamenti cellulari che, ad oggi, comprendiamo solo parzialmente.

In linea con quanto sopra, le mutazioni del DNA mitocondriale (mtDNA) sono state proposte come una delle possibili cause di questa riprogrammazione metabolica, che potrebbe portare a una ridotta prestazione della catena di trasporto degli elettroni (ETC)⁶ e spiegherebbe perché alcune cellule tumorali migliorano il loro metabolismo glicolitico per sopravvivere. Infatti, è stato riportato che il mtDNA accumula mutazioni all’interno delle cellule tumorali, essendo presente in almeno il 50% dei tumori⁷. Ad esempio, un recente studio condotto da Yuan et al. ha riportato la presenza di molecole di mtDNA ipermutate e troncate nei tumori del rene, del colon-retto e della tiroide⁸. Inoltre, molti lavori hanno dimostrato che alcune mutazioni del mtDNA sono associate ad un fenotipo tumorale più aggressivo e ad un aumento del potenziale metastatico delle cellule tumorali 9,10,11,12,13,14,15,16.

Nonostante l’apparente rilevanza del genoma mitocondriale nella progressione del cancro, lo studio di queste mutazioni e il loro contributo alla malattia sono stati difficili a causa delle limitazioni nei modelli sperimentali e nelle tecnologie attualmente disponibili¹⁷. Pertanto, sono necessarie nuove tecniche per comprendere il reale impatto del DNA dei mitocondri nello sviluppo e nella progressione della malattia del cancro. In questo lavoro, introduciamo un protocollo per la generazione di cibridi transmitocondriali da cellule tumorali in crescita in sospensione, basato sul ripopolamento di cellule pretrattate con rodamina 6G con mitocondri isolati, che supera le principali sfide dei metodi tradizionali di cibridizzazione^18,19. Questa metodologia consente l’utilizzo di qualsiasi nucleo donatore indipendentemente dalla disponibilità della corrispondente linea cellulare ρ⁰ e il trasferimento di mitocondri da cellule che, seguendo le tecniche tradizionali, sarebbero difficili da enucleare (cioè linee cellulari non aderenti).

Protocol

NOTA: tutti i terreni di coltura e le composizioni buffer sono specificati nella tabella 1. Prima della generazione del cibride, entrambi i profili del DNA mitocondriale e nucleare delle cellule donatrici e riceventi devono essere tipizzati per confermare la presenza di differenze genetiche in entrambi i genomi tra le linee cellulari. In questo studio, sono state utilizzate una linea cellulare L929 disponibile in commercio e la sua linea cellulare derivata, L929dt, che è stata generata spontaneamente ne…

Representative Results

Dopo aver seguito il protocollo sopra presentato, dovrebbe essere ottenuta una linea cellulare di cibride omoplasmatico con un background nucleare conservato ma con un nuovo genotipo mitocondriale, come rappresentato negli schemi in Figura 1 e Figura 2. La purezza del DNA mitocondriale e nucleare presente nei cibridi può essere confermata dalla RFLP, come mostrato nella Figura 3, e dall’analisi di genotipizzazione del DNA nucleare,…

Discussion

Da quando Otto Warburg ha riferito che le cellule tumorali spostano il loro metabolismo e potenziano la “glicolisi aerobica”^3,4 riducendo la respirazione mitocondriale^, l’interesse per il ruolo dei mitocondri nella trasformazione e nella progressione del cancro è cresciuto esponenzialmente. Negli ultimi anni, le mutazioni nel mtDNA e la disfunzione mitocondriale sono state postulate come segni distintivi di molti tipi di cancro²⁵. Ad oggi…

Materials

3500XL Genetic Analyzer	ThermoFisher Scientific	4406016
6-well plate	Corning	08-772-1B
Ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	A3678
AmpFlSTR Identifiler Plus PCR Amplification Kit	ThermoFisher Scientific	4427368
Anode Buffer Container 3500 Series	Applied Biosystems	4393927
Boric acid	PanReac	131015
Bradford assay	Biorad	5000002
Cathode Buffer Container 3500 Series	Applied Biosystems	4408256
Cell culture flasks	TPP	90076
DMEM high glucose	Gibco	11965092
EDTA	PanReac	131026
Ethidium Bromide	Sigma-Aldrich	E8751
Geneticin	Gibco	10131027
Homogenizer Teflon pestle	Deltalab	196102
L929 cell line	ATCC	CCL-1
MiniProtean Tetra4 Gel System	BioRad	1658004
MOPS	Sigma-Aldrich	M1254
PCR primers	Sigma-Aldrich	Custom products
Polyacrylamide Solution 30%	PanReac	A3626
Polyethylene glycol	Sigma-Aldrich	P7181
POP-7	Applied Biosystems	4393714
Pyruvate	Sigma-Aldrich	P5280
QIAmp DNA Mini Kit	Qiagen	51306
Rhodamine-6G	Sigma-Aldrich	R4127
Serum Fetal Bovine	Sigma-Aldrich	F7524
SspI	New England Biolabs	R3132
Streptomycin/penicillin	PAN biotech	P06-07100
Sucrose	Sigma-Aldrich	S3089
TEMED	Sigma-Aldrich	T9281
Tris	PanReac	P14030b
Uridine	Sigma-Aldrich	U3750