Summary
Het huidige protocol beschrijft een kloonbare elektronenmicroscopie-etiketteringstechnologie voor het detecteren van metallothioneïne-gelabelde eiwitten in cellen met behulp van een nieuwe op autonucleatieonderdrukkingsmechanisme gebaseerde gouden nanodeeltjessynthesetechniek.
Abstract
Het analyseren van de precieze lokalisatie van eiwitmoleculen in cellen met ultrastructurele resolutie is van groot belang voor de studie van verschillende fysiologische of pathologische processen in alle levende organismen. Daarom is de ontwikkeling van kloonbare tags die kunnen worden gebruikt als elektronenmicroscopie-sondes van grote waarde, net zoals fluorescerende eiwitten een cruciale rol hebben gespeeld op het gebied van optische beeldvorming. Het autonucleatieonderdrukkingsmechanisme (ANSM) werd onlangs ontdekt, dat de specifieke synthese van gouden nanodeeltjes (AuNP's) op cysteïnerijke tags mogelijk maakt, zoals metallothioneïne (MT) en antivrieseiwit (AFP).
Op basis van de ANSM werd een elektronenmicroscopie-etiketteringstechnologie ontwikkeld, die de specifieke detectie van gelabelde eiwitten in prokaryote en eukaryote cellen mogelijk maakt met een ongekende etiketteringsefficiëntie. Deze studie illustreert een protocol voor de detectie van MTn (een gemanipuleerde MT-variant zonder aldehyde-reactieve residuen) fusie-eiwitten in zoogdiercellen met goed bewaarde ultrastructuur. In dit protocol werden hogedrukbevriezing en vriessubstitutiefixatie uitgevoerd met behulp van niet-aldehydefixatieven (zoals looizuur, uranylacetaat) om de near-native ultrastructuur te behouden en schade aan de tagactiviteit veroorzaakt door aldehyde-crosslinking te voorkomen.
Een eenvoudige rehydratatie in één stap werd gebruikt voorafgaand aan de op ansm gebaseerde AuNP-synthese. De resultaten toonden aan dat de gelabelde eiwitten zich richtten op verschillende organellen, waaronder de membranen en het lumen van het endoplasmatisch reticulum (ER), en mitochondriale matrices werden gedetecteerd met hoge efficiëntie en specificiteit. Dit onderzoek biedt biologen een robuust protocol om een enorm scala aan biologische vragen op het niveau van één molecuul in cellulaire ultrastructurele contexten aan te pakken.
Introduction
In het postgenomische tijdperk heeft de ontwikkeling van groen fluorescerend eiwit (GFP) als een single-molecule reporter voor lichtmicroscopie een revolutie teweeggebracht op het gebied van modern life science onderzoek 1,2. Al tientallen jaren is elektronenmicroscopie (EM) een krachtig hulpmiddel voor het intuïtief observeren van de cellulaire ultrastructuur met nanoschaalresolutie3; De precieze identificatie en lokalisatie van eiwitmoleculen blijft echter een uitdaging.
De meest gebruikte EM-etiketteringstechniek is de immuno-elektronenmicroscopie (IEM) etiketteringstechniek, die is gebaseerd op de antigeen-antilichaamreactie. Hoewel er veel technieken zijn ontwikkeld op het gebied van IEM-etikettering, waaronder pre-embedding IEM en post-embedding IEM (op harssecties of gehydrateerde cryosecties), lijdt het nog steeds aan een lage etiketteringsefficiëntie (<10%)4,5, wat verband houdt met de monstervoorbereiding en de antilichaamkwaliteit. Om deze beperkingen te overwinnen, heeft het ontwikkelen van genetisch gecodeerde tags een groot toepassingspotentieel.
Twee hoofdtypen EM-tags zijn de afgelopen jaren grondig onderzocht. Eén type is de DAB-kleuringsmethode, die tags zoals APEX2 gebruikt om 3,3'-diaminobenzidine (DAB) te oxideren tot osmiofiele polymeren voor EM-visualisatie 6,7,8,9,10,11,12. Het maakt het labelen van eiwitten met een hoge abundantie in subcellulaire regio's mogelijk, maar is niet geschikt voor het tellen van één molecuul. Het andere type maakt gebruik van metaalbindende eiwitten, zoals ferritine 13 en metallothioneïne (MT) 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26, om elektronendichte metaalafzettingen te genereren in situ voor EM visualisatie. Alleen de laatste heeft echt potentieel voor visualisatie en tellen van één molecuul. De moleculaire grootte van ferritine is te groot (~ 450 kD) om als een veelbelovende tag te worden gebruikt, terwijl de kleine omvang (~ 5 kD) van MT en zijn vermogen om verschillende ionen te binden door zijn 20 cysteïnes veel aandacht hebben getrokken. Verschillende laboratoria hebben geprobeerd gezuiverde MT-fusie-eiwitten of MT-expressiecellen te labelen door rechtstreeks met Au + te broeden. Deze pogingen hebben aanvankelijk bewezen dat MT-tags goudionen kunnen binden om signalen met een hoog contrast te vormen, maar geen enkele heeft echt de effectieve identificatie van individuele eiwitten in cellen bereikt en ze zijn niet breed toepasbaar 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23.
De ANSM-gebaseerde AuNP-synthesetechniek, waarbij AuNP's van 2-6 nm-formaat rechtstreeks op cysteïnerijke tags (bijv. MT, de MT-varianten MTn en MTα, AFP) worden gesynthetiseerd als elektrondichte labels voor EM-visualisatie, is de eerste betrouwbare en toepasbare benadering voor eiwitetikettering en detectie van één molecuul in cellen24,25,26. Het maakt de specifieke synthese van AuNP's op geïsoleerde tagfusie-eiwitten mogelijk en heeft een ongekende etiketteringsefficiëntie bereikt in niet-gefixeerde of chemisch gefixeerde prokaryote (E. coli) en eukaryote (S. pombe) cellen. Het implementeren van hetzelfde protocol in meer geavanceerde systemen zoals zoogdiercellen of zelfs weefsels brengt echter extra uitdagingen met zich mee, zoals de complexere intracellulaire redoxhomeostase en de meer fragiele cellulaire structuur.
Deze studie presenteert een kloonbare EM-etiketteringstechnologie, die de nieuwe ANSM-gebaseerde AuNP-synthesetechniek combineert voor het labelen van genetisch gecodeerde cysteïnerijke tags (MT) met de HPF / FSF-rehydratie-HPF / FSF-monstervoorbereidingsmethode, maakt de ondubbelzinnige identificatie van gelabelde eiwitten in het ER-membraan, ER-lumen en mitochondriale matrix in HeLa-cellen mogelijk. De huidige methode combineert de kenmerken van hoge etiketteringsefficiëntie, een hoge signaal-ruisverhouding, single-molecule labeling en sterke universaliteit, en deze methode heeft brede toepassingsperspectieven in life science-onderzoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle benodigdheden die in dit experiment worden gebruikt, worden vermeld in de materiaaltabel. De stapsgewijze workflow van het huidige protocol wordt weergegeven in figuur 1.
1. Celkweek op saffierschijven
- Breng saffierschijven van 3 mm x 0,16 mm over naar een centrifugebuis van 2 ml met 1 ml ethanol en soniceer gedurende 10 minuten in een ultrasone reiniger.
- Brand elke saffierschijf in een alcohollampvlam totdat er geen zichtbare afzettingen op het oppervlak zijn.
OPMERKING: Via de bovenstaande methode kunnen saffierschijven vele malen worden gerecycled. - Label één zijde van elke saffierschijf met een nummer met behulp van een oplosmiddelbestendige pen (figuur 1A).
OPMERKING: De gebruikte markerpen moet van tevoren worden getest om te bepalen of deze bestand is tegen aceton en methanoloplosmiddelen om het verlies van markeringen te voorkomen. - Plaats de gelabelde saffierschijven op de bodem van een kweekschaal van 35 mm met de gelabelde zijde naar boven gericht.
- Steriliseer de celkweekschaal met saffierschijven onder UV-licht gedurende 30 minuten.
- Draai de saffierschijven om met een pincet (de gelabelde kant naar beneden gericht) en steriliseer nog eens 30 minuten onder UV-licht. Nu is de kweekschaal met de saffierschijven klaar voor celkweek.
OPMERKING: De saffierschijven kunnen ook worden gesteriliseerd door autoclaveren. - Zaai de cellen op de hierboven bereide saffierschijven en groei tot 80% -90% confluentie in een celincubator bij 37 °C, 95% vochtigheid en 5% CO2 (figuur 1B).
OPMERKING: Stabiele HeLa-cellijnen die MTn-tags tot expressie brengen, werden gegenereerd zoals beschreven in Jiang et al.26.
2. Hogedrukbevriezing (HPF)
LET OP: Vloeibare stikstof wordt gebruikt in dit experiment. Gebruik bij het werken met vloeibare stikstof de juiste veiligheidsprocedures en persoonlijke beschermingsmiddelen om bevriezing en verstikking te voorkomen.
- Bereid de hogedrukvriesmachine ten minste 2 uur voor het experiment voor volgens de instructies van de fabrikant.
- Breng type A HPF aluminium dragers (uitsparing: 0,025 / 0,275 mm) over naar een centrifugebuis van 2 ml met 1 ml ethanol en soniceer gedurende 10 minuten in een ultrasone reiniger.
- Droog de dragers in een petrischaaltje bedekt met kwalitatief filterpapier (gemiddelde snelheid).
- Week de voorgereinigde dragers in 1-hexadeceen.
OPMERKING: BSA wordt niet aanbevolen als cryoprotectant in het huidige experiment, omdat het de daaropvolgende synthese van gouden nanodeeltjes zal verstoren. - Gebruik een fijn pincet om een saffierschijf met cellen uit de kweekschaal te pakken; Raak het gelabelde oppervlak aan met kwalitatief filterpapier (gemiddelde snelheid) om het overtollige medium te verwijderen.
OPMERKING: De thermische geleidbaarheid van water is zeer laag en te veel restwater zal het bevriezingseffect beïnvloeden. Houd zo min mogelijk water vast om te voorkomen dat de cellen uitdrogen. - Monteer de saffierschijf in de HPF-monsterhouder en sluit de schijf snel af met een 0,025 mm diepe aluminium drager met 1-hexadeceen (figuur 1C).
- Zuig overtollige oplossing aan met kwalitatief filtreerpapier (gemiddelde snelheid).
- Laad de monsterhouder voor het invriezen onder hoge druk (figuur 1D).
OPMERKING: Het laadproces van het monster moet zo snel mogelijk zijn (binnen 1 minuut) om fysiologische veranderingen als gevolg van veranderingen in de temperatuur, vochtigheid, pH en zuurstofgehalte te minimaliseren. - Laad de saffierschijfdragerassemblage onder vloeibare stikstof in een schuim cryobox en bewaar de assemblage in een cryovial in vloeibare stikstof voor gebruik.
OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. De exemplaren in cryovialen kunnen jarenlang worden opgeslagen in een vloeibare stikstofdewar.
3. Vriessubstitutiefixatie (FSF) en rehydratatie (figuur 1E)
- Vul de automatische vriessubstitutiemachine (AFS) met vloeibare stikstof en koel de kamer tot −90 °C.
LET OP: Vloeibare stikstof wordt gebruikt in dit experiment. Gebruik bij het werken met vloeibare stikstof de juiste veiligheidsprocedures en persoonlijke beschermingsmiddelen om bevriezing en verstikking te voorkomen. - Bereid 2 ml 0,01% looizuur (g/v) in aceton (FSF-oplossing 1) in een ronde polypropyleencontainer van 20 mm (figuur 1E) in een zuurkast en vries deze in vloeibare stikstof in.
- Laad de monsters (de saffierschijfdragerassemblages) in de container met bevroren FSF-oplossing 1 onder LN2 met behulp van een voorgekoeld pincet.
- Breng de container over naar de voorgekoelde AFS-kamer voor FSF-verwerking bij −90 °C.
- Bewaar de monsters gedurende 1 uur bij −90 °C; Scheid vervolgens de saffierschijven van de dragers met een voorgekoeld pincet en zorg ervoor dat de gemarkeerde zijden van de saffierschijven naar beneden zijn gericht.
OPMERKING: Het pincet moet voldoende voorgekoeld zijn om temperatuurveranderingen te voorkomen. De saffierschijven moeten gemakkelijk kunnen worden gescheiden. - Nog 8-10 uur bij −90 °C bewaren; vervolgens binnen 3 uur opwarmen tot −60 °C.
- Vervang de FSF-oplossing 1 in de container door voorgekoeld aceton en incubeer gedurende 1 uur. Herhaal deze aceton wash 2x.
- Verwarm tot −30 °C binnen 3 uur. Bereid gedurende deze periode 2 ml 0,01% uranylacetaat in aceton (FSF-oplossing 2, verdund van 10% uranylacetaat in methanol) voor en koel deze voor in een centrifugebuis van 2 ml.
LET OP: Uranylacetaat, gebruikt in het huidige experiment, is radioactief en zeer giftig; het moet worden behandeld volgens de juiste veiligheidsprocedures en worden verwijderd als gevaarlijk chemisch afval. - Vervang de aceton door FSF-oplossing 2 en incubeer gedurende 3 uur bij −30 °C.
- Vervang de FSF-oplossing 2 in de container door voorgekoeld aceton en incubeer gedurende 30 minuten bij −30 °C. Herhaal deze aceton wash 2x.
- Verwarm van −30 °C tot 4 °C binnen 2 uur.
- Vervang de aceton door 2 ml 0,2 M HEPES-buffer met 1 mM CaCl 2 en 1 mM MgCl2 bij pH 5,5.
- Vervang de buffer eenmaal en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur of bij 4 °C gedurende een nacht.
OPMERKING: Het protocol kan hier een nacht worden gepauzeerd of ten minste 6 uur worden voortgezet totdat de monsters opnieuw zijn ingevroren in stap 5.
4. ANSM-gebaseerde AuNP-synthese voor zoogdiercellen (figuur 1F)
- Was met PBS-A buffer 3x gedurende 5 min elke keer.
- Breng de saffierschijven over in een kweekschaal van 35 mm met 1 ml PBS-A-buffer bij kamertemperatuur.
OPMERKING: Houd altijd de gemarkeerde zijden van de saffierschijven naar beneden gericht en vermijd overlapping van de saffierschijven en wrijven van de cellen. - Bereid de reducerende oplossing door 4,28 μL 2-mercaptoethanol toe te voegen aan een centrifugebuis van 2 ml met 1 ml PBS-A-buffer en goed te mengen in een zuurkast.
LET OP: 2-Mercaptoethanol is giftig en heeft een penetrante geur; Het moet worden behandeld volgens de juiste veiligheidsprocedures. - Vervang de PBS-A-buffer in de kweekschaal door 1 ml reducerende oplossing en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Bereid de gouden voorloper voor gebruik.
- Voeg 80 μL 10 mM HAuCl4 in ddH 2 O toe aan een centrifugebuis van2ml met 1 ml reducerende oplossing en onmiddellijk vortex.
OPMERKING: De oplossing kan troebel worden. - Voeg 80 μL 500 mM D-penicillamine in ddH2O toe aan de bovenstaande oplossing en onmiddellijk vortex.
OPMERKING: De oplossing kan weer duidelijk worden.
- Voeg 80 μL 10 mM HAuCl4 in ddH 2 O toe aan een centrifugebuis van2ml met 1 ml reducerende oplossing en onmiddellijk vortex.
- Vervang de oplossing in de kweekschaal door de in stap 4.5 bereide 1 ml goudprecursoroplossing en incubeer gedurende 2 uur bij 4 °C.
OPMERKING: Eén milliliter van de goudvoorloper is voldoende om te reageren met ongeveer 1 × 106 cellen (samenvloeiend op een schaal van 35 mm). Grotere volumes van de precursor zijn nodig wanneer de AuNP's aanzienlijk kleiner worden. - Weeg 0,0038 g NaBH 4 af in een centrifugebuis van 1,5 ml, voeg 1 ml ijskoude ddH2O en vortex toe om vlak voor gebruik vers 100 mM NaBH4 te maken.
- Voeg 20-100 μL 100 mM NaBH 4 toe aan de oplossing uit stap4.6 , schud onmiddellijk om goed te mengen en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
OPMERKING: Bereid 100 mM NaBH4 vers voor onmiddellijk gebruik. Na het toevoegen van de NaBH4 zal de kleur van de oplossing geleidelijk rood worden en vervolgens verdiepen. Als er geen kleurverandering wordt waargenomen, geeft dit grotendeels aan dat het experiment is mislukt. - Vervang de oplossing door 2 ml PBS-A-buffer om de reactie te stoppen.
OPMERKING: Het stoppen van de reactie binnen 30 minuten is van cruciaal belang, omdat een langdurige reactie de AuNPs geleidelijk zal afbreken.
5. Bevriezing onder hoge druk en bevriezingssubstitutiefixatie (figuur 1C-F)
OPMERKING: De monsters zijn weer HPF en FSF en de procedure is bijna hetzelfde als die eerder beschreven in sectie 2 en sectie 3, met een paar wijzigingen.
- Bereid 1% osmiumtetroxide en 0,1% uranylacetaat in aceton (FSF-oplossing 3, verdund uit 4% osmiumtetroxide in aceton en 10% uranylacetaat in methanol).
LET OP: Osmiumtetroxide en uranylacetaat zijn zeer giftige chemicaliën; Ze moeten volgens de juiste veiligheidsprocedures worden behandeld en als gevaarlijk chemisch afval worden verwijderd. - Laad de monsters (de saffierschijfdragerassemblages) in de container met bevroren FSF-oplossing 3 onder LN2 met behulp van een voorgekoeld pincet.
- Breng de container over naar de voorgekoelde AFS-kamer voor FSF-verwerking bij −90 °C en voer het FSF-programma als volgt uit: 8-10 uur bewaren bij −90 °C; vervolgens binnen 3 uur verwarmen tot −60 °C; gedurende 3 uur bij −60 °C bewaren; vervolgens binnen 3 uur verwarmen tot −30 °C; gedurende 3 uur bij −30 °C bewaren; vervolgens binnen 2 uur verwarmen tot 4 °C.
- Wanneer de temperatuur 4 °C bereikt, brengt u de monsters over naar de zuurkast en houdt u deze gedurende 15 minuten op kamertemperatuur.
- Was met aceton 3x gedurende telkens 15 min.
- Behoud in aceton bij kamertemperatuur gedurende ten minste 2 uur.
6. Harsinfiltratie, inbedding en polymerisatie
- Bereid het epoxyharsmengsel voor gebruik volgens de instructies van de fabrikant.
LET OP: De epoxyhars die in het huidige experiment wordt gebruikt, is giftig voorafgaand aan polymerisatie; Het moet worden behandeld volgens de juiste veiligheidsprocedures. Niet-gepolymeriseerde hars moet worden verwijderd als gevaarlijk chemisch afval of worden gepolymeriseerd voordat ze worden verwijderd. - Breng de saffierschijven over in insluitcapsules met platte bodem en infiltreer gedurende ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur met hars.
OPMERKING: Houd de gemarkeerde zijkanten van de saffierschijven naar beneden gericht. - Polymeriseer het monster bij 60 °C in een oven gedurende ten minste 18 uur.
OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd na polymerisatie. Gepolymeriseerde monsterblokken kunnen jarenlang in een droge container worden bewaard.
7. Ultradunne doorsnede
- Snijd de gepolymeriseerde monsterblokken voorzichtig af met een scheermes om de saffierschijven bloot te leggen.
- Dompel de blokpunten met saffierschijven enkele seconden in vloeibare stikstof en ontdooi bij kamertemperatuur. Herhaal de vries-dooiactie meerdere keren om de schijven van de blokken los te maken.
OPMERKING: Vermijd langdurig invriezen, omdat dit de monsterblokken kan kraken. Maak de saffierschijven voorzichtig los met een mes, vermijd overmatige kracht, die de monsters kan beschadigen. - Snijd het blokvlak bij tot een trapeziumvorm voor ultradunne doorsnede (figuur 1G).
- Verkrijg 70-100 nm ultradunne secties met een ultramicrotoom (figuur 1H).
- Kies de secties op zeshoekige koperen roosters met 200 mazen.
OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd na sectie. De secties op gordels kunnen jarenlang in een droge container worden bewaard. Indien gewenst kunnen de secties op roosters worden gekleurd met 2% uranylaceton om een beter membraancontrast te verkrijgen. Loodkleuring moet worden vermeden omdat het de signalen van nanogouddeeltjes maskeert.
8. TEM-beeldvorming (figuur 1I)
- Onderzoek de ultradunne secties op koperen roosters met behulp van een transmissie-elektronenmicroscoop. Doorgaans is een vergrotingsbereik van 11 kX tot 30 kX geschikt voor het visualiseren van AuNP's in cellen, en een geschikte onscherptewaarde is nodig om ervoor te zorgen dat 2-3 nm AuNP's zichtbaar zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De op ANSM gebaseerde AuNP-synthesetechniek is een uiterst nuttig hulpmiddel voor het labelen en detecteren van MT-gelabelde eiwitten met TEM26. Om de robuustheid ervan in zoogdiercellen te valideren, werden drie stabiele cellijnen gegenereerd die EGFP-MTn-KDEL, Ost4-EGFP-MTn of Mito-acGFP-MTn in Hela-cellen tot expressie brengen. KDEL is een canonieke C-terminale endoplasmatisch reticulum (ER) retentie/retrieval sequentie, die het fusie-eiwit EGFP-MTn-KDEL in het ER-lumen of de perinucleaire ruimte van de nucleaire envelop (NE) handhaaft. Ost4 is een subeenheid van het oligosaccharyltransferasecomplex, een membraaneiwitcomplex gelokaliseerd in het ER en NE dat de N-glycosylering van ontluikende polypeptiden katalyseert. Het C-eindpunt van het Ost4-fusie-eiwit Ost4-EGFP-MTn staat tegenover het cytosol. Mito is een mitochondriale targetingsequentie die zich richt op het fusie-eiwit Mito-acGFP-MTn in de mitochondriale matrix.
Het HPF/FSF-monsterpreparaat, gecombineerd met het gebruik van looizuur en uranylacetaat in plaats van aldehydefixatieven, behield een uitstekende ultrastructuur met een goed membraancontrast (figuur 2, figuur 3 en figuur 4). De algehele structuur van het monster was dicht, zonder duidelijke cytoplasma- en lipidenextractie. De membraanstructuur was glad, zonder duidelijke vervorming, en de fosfolipide dubbellaagse structuur was duidelijk zichtbaar.
Naast de goed bewaard gebleven ultrastructuur, werd efficiënte etikettering waargenomen in alle drie de gevallen die verschillende organelspecificiteiten vertegenwoordigen. Het EGFP-MTn-KDEL-eiwit verscheen als 2-5 nm grote gouden nanodeeltjes die uitsluitend verdeeld waren in het perifere ER-lumen en in de perinucleaire ruimte van het NE (figuur 2A-C). De goed bewaarde ultrastructuur maakte niet alleen de identificatie van gelabelde eiwitten met één molecuul mogelijk, maar vergemakkelijkte ook de analyse van organelinteracties, zoals ER-mitochondriale interacties (figuur 2D, E). Nanodeeltjes van het Ost4-EGFP-MTn-eiwit bakenden het ER-membraan af (figuur 3A-D) en het buitenmembraan van het NE (figuur 3E). Nanodeeltjes werden ook verdeeld over het binnenmembraan van het NO, maar het aantal nanodeeltjes daar was lager dan op het buitenmembraan, wat aangeeft dat de eiwitsamenstelling van de binnenste en buitenste membranen anders was (figuur 3E). Evenzo vertoonden de Mito-acGFP-MTn-expresserende cellen specifieke labeling in de mitochondriale matrix (figuur 4A-E). Er werden geen deeltjes waargenomen in de blaasjes of ER (figuur 4A-D) en weinig deeltjes werden getoond in de mvb's (figuur 4D).
Figuur 1: Schema voor de workflow van de kloonbare elektronenmicroscopie etiketteringstechnologie . (A) Saffierschijven worden gelabeld en gesteriliseerd voor celkweek. (B) Cellen worden gekweekt op saffierschijven in een kweekschaal van 35 mm. (C) De saffierschijven met cellen zijn afgedekt met 0,025 mm diepe aluminium dragers voor hogedrukbevriezing en de extra ruimte is gevuld met 1-hexadeceen. (D) De cellen worden gecryofixeerd door HPF. E) Vastlegging door vriessubstitutie. (F) De schematische stappen van de op ansm gebaseerde AuNP-synthese. (G) De saffierschijven met cellen zijn ingebed in inbeddingscapsules met platte bodem. De harsblokken zijn bijgesneden voor ultradunne secties. (H) De bijgesneden harsblokken zijn doorsneden met een ultramicrotoom. (I) De ultradunne secties zijn afgebeeld met TEM. Afkortingen: ANSM = autonucleatie onderdrukkingsmechanisme; AuNP = gouden nanodeeltje; HPF = hogedrukbevriezing; FSF = vries-substitutiefixatie; TEM = transmissie-elektronenmicroscopie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: ANSM-gebaseerde AuNP-synthese op EGFP-MTn-KDEL uitgedrukt in HeLa-cellen. (A,D) EM-beelden van een 90 nm dik deel van HeLa-cellen dat EGFP-MTn-KDEL tot expressie brengt, tonen AuNP's die specifiek zijn geaccumuleerd in het lumen van het endoplasmatisch reticulum en in de perinucleaire ruimte van de nucleaire envelop. Weinig deeltjes worden waargenomen in de mitochondriën, lysosoom, kern of cytosol. (B,C) Ingezoomde afbeeldingen van respectievelijk de rode en gele rechthoeken in (A). (E) Ingezoomde afbeelding van het groene rechthoekgebied in (D). Dit cijfer is aangepast van Jiang et al.26. Schaalbalken = (B,C,E) 200 nm; (A,D) 500 nm. Afkortingen: ANSM = autonucleatie onderdrukkingsmechanisme; AuNP = gouden nanodeeltje; EGFP = versterkt groen fluorescerend eiwit; ER = endoplasmatisch reticulum; NE = nucleaire enveloppe; M = mitochondriën; Lyso = lysosoom; N = kern. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: ANSM-gebaseerde AuNP-synthese op Ost4-EGFP-MTn uitgedrukt in HeLa-cellen. (A-D) EM-beelden van een 90 nm dik deel van HeLa-cellen dat Ost4-EGFP-MTn tot expressie brengt, tonen AuNP's die specifiek zijn geaccumuleerd op het membraan van het endoplasmatisch reticulum. (E) Een EM-beeld van een 90 nm dik deel van HeLa-cellen dat Ost4-EGFP-MTn tot expressie brengt, toont AuNP's die specifiek zijn geaccumuleerd op het membraan van het NE (nucleaire enveloppe). Weinig deeltjes worden waargenomen in de mitochondriën, lysosoom, kern of cytosol. (C) Ingezoomde afbeelding van het rode rechthoekgebied in (A). Dit cijfer is aangepast van Jiang et al.26. Schaalbalken = (B-E) 200 nm; (A) 500 nm. Afkortingen: ANSM = autonucleatie onderdrukkingsmechanisme; AuNP = gouden nanodeeltje; EGFP = versterkt groen fluorescerend eiwit; ER = endoplasmatisch reticulum; NE = nucleaire envelop; M = mitochondriën; Lyso = lysosoom; N = kern; EM = elektronenmicroscopie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: ANSM-gebaseerde AuNP-synthese op Mito-acGFP-MTn uitgedrukt in HeLa-cellen. (A,D,E) EM-beelden van een 90 nm dik deel van HeLa-cellen dat Mito-acGFP-MTn tot expressie brengt, tonen AuNP's die specifiek zijn geaccumuleerd in de matrix van de mitochondriën (M). Weinig deeltjes worden waargenomen in het endoplasmatisch reticulum, kern, blaasje, multi-vesiculaire lichaam of cytosol. (B,C) Ingezoomde afbeelding van respectievelijk de rode en gele rechthoekgebieden in (A). Dit cijfer is aangepast van Jiang et al.26. Schaalbalken = (D,E) 200 nm; (B,C) 500 nm; A) 1 μm. Afkortingen: ANSM = autonucleatie onderdrukkingsmechanisme; AuNP = gouden nanodeeltje; EGFP = versterkt groen fluorescerend eiwit; ER = endoplasmatisch reticulum; NE = nucleaire enveloppe; M = mitochondriën; Lyso = lysosoom; N = kern; V= blaasje; MVB = multi-vesiculair lichaam. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De studie presenteert hier een robuuste kloonbare EM-etiketteringstechnologie voor de visualisatie van eiwitmoleculen met één molecuul in de cellulaire omgeving met ultrastructurele resolutie. De AuNP's die direct worden gesynthetiseerd op genetisch gecodeerde cysteïnerijke tags zorgen voor een ondubbelzinnige en nauwkeurige lokalisatie van de doeleiwitten. Hogedrukvries- en vriessubstitutietechniek behoudt uitstekend de ultrastructuur van biologische monsters. Alles bij elkaar biedt de hier gepresenteerde kloonbare elektronenmicroscopie-etiketteringstechnologie een krachtig hulpmiddel voor de efficiënte lokalisatie en herkenning van een enkel molecuul in cellulaire ultrastructurele contexten in situ met EM.
Het ANSM-mechanisme onderdrukt het autonucleatieproces van thiolaat-Au(I)-polymeren26, wat een typische reactie is in de klassieke Brust-Schiffrin-methode (BSM)27 die veel wordt gebruikt voor het synthetiseren van met thiolaat afgedekte gouden nanoclusters. Daarom kan de op ANSM gebaseerde AuNP-synthesetechniek specifiek 2-6 nm-formaat AuNP's rechtstreeks op cysteïnerijke tags synthetiseren als elektrondichte labels voor EM-visualisatie met een hoge signaal-ruisverhouding en hoge efficiëntie. In tegenstelling tot APEX2- of HPR-etiketteringstechnieken die afhankelijk zijn van DAB-polymeerafzetting, die niet aftelbaar is en niet geschikt voor oplosbare eiwitten in het cytosol, is de op ANSM gebaseerde AuNP-synthesetechniek de enige techniek die tot nu toe detectie van één molecuul mogelijk maakt.
Het nadeel van de kloonbare elektronenmicroscopie-etiketteringstechnologie is dat de op ANSM gebaseerde AuNP-synthesetechniek afhankelijk is van de activiteit van de thiolgroep van cysteïne, die gevoelig is voor aldehydefixatieven. De oxidatieve bescherming van thiolen door 3,3'-dithiodipropionzuur (DTDPA) is geïntroduceerd voorafgaand aan aldehydefixatie in E. coli en de splijtingsgist S. pombe, wat resulteert in een goede morfologie en uitstekende etiketteringsefficiëntie24,25,26. In dit werk werkte de oxidatie/fixatiemethode goed voor die tags die tot expressie komen in een relatief oxidatief compartiment, zoals het ER-lumen en de mitochondriale matrix (in EGFP-MTn-KDEL- en Mito-acGFP-MTn-cellen). Het was echter suboptimaal voor cytosolische tags (Ost4-GFP-MTn) in zoogdiercellen. De reden kan zijn dat de tags in de reduceercompartimenten niet goed gevouwen zijn en dat de reducerende stoffen zoals GSH die in overvloed aanwezig zijn in het cytoplasma bestand zijn tegen oxidatie.
HPF-FSF-techniek is de gouden standaard in de ultrastructurele conservering van biologische monsters voor elektronenmicroscopie. In dit werk bereikte de methode van HPF / FSF-rehydratie-HPF / FSF, die de conventionele chemische fixatie en permeabilisatie volledig vermijdt, efficiënte etikettering met Ost4-GFP-MTn en leverde een uitstekende celstructuur op. Deze methode heeft echter nog steeds bepaalde beperkingen. Ten eerste kan een tweede HPF leiden tot aanzienlijke ijskristalschade. Ten tweede hebben verschillende batches uranylacetaat problemen met inconsistente kwaliteit en oplosbaarheid. Aciculaire precipitaten verschenen af en toe in de gerehydrateerde monsters wanneer ze werden gevisualiseerd door elektronenmicroscopie. Wassen met HEPES-buffer op pH 5,5 kan dit probleem verlichten. Ten derde moet de monstervoorbereiding voor weefselmonsters verder worden geoptimaliseerd.
Kortom, de kloonbare EM-etiketteringstechnologie, die de op ANSM gebaseerde AuNP-synthesetechniek combineert met de monstervoorbereidingsmethode van HPF / FSF-rehydratie-HPF / FSF, maakt de ondubbelzinnige identificatie van genetisch gelabelde eiwitten in cellen door elektronenmicroscopie mogelijk. Het huidige protocol moet het mogelijk maken om een enorm scala aan biologische vragen aan te pakken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteur verklaart geen belangenconflicten te hebben.
Acknowledgments
Het hier beschreven protocol is afgeleid van het artikel gepubliceerd door Jiang et al. (2020). Dit werk werd ondersteund door subsidies van de MOST (973-programma's nrs. 2011CB812502 en 2014CB849902) en door financiële steun van de gemeentelijke overheid van Beijing.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.025 mm/0.275 mm Aluminum carrier | Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend | ||
| 0.2 M HEPES buffer | Dissolve HEPES (0.2 M) in 980 mL of ddH2O, then add 10 mL of 100 mM MgCl2 and 10 mL of 100 mM CaCl2 (final concentration 1 mM), respectively, adjust pH to 5.5 | ||
| 1.5 mL MaxyClear snaplock microtube | Axygen Scientific | MCT150C | |
| 2 mL polypropylene screw cap microtubes | Biologix | 81-0204 | |
| 200 mesh hexagonal copper grid | Tedpella inc | G200HEX | |
| 2-mercaptoethanol | Amresco | 0482-250ML | |
| 35 mm cell culture dishes | Corning | 430165 | |
| 50 mL polypropylene centrifuge tubes | Corning | 430928 | |
| Acetone | Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company | 31025 | |
| Automated freeze substitution machine | Leica | AFS2 | |
| Customized 3.05 mm x 0.66 mm specimen holders for HPF | Beijing Wulundes Biotech Ltd. | ||
| D-penicillamine | TCI | P0147 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium | GBICO | C11965500BT | |
| Fetal bovine serum | GBICO | 10099-141C | |
| Flat bottom embedding capsule | Tedpella inc | ||
| Foam cryobox | |||
| Formvar 15/95 resin | Electron Microscopy Sciences | 15800 | |
| HAuCl4 | Sigma | 4022-1G | |
| HEPES | sigma | H3375-500G | |
| HPF machine | Wohlwend | HPF compact01 | |
| Methonal | Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company | 12397 | |
| NaBH4 | Sigma | 480886-25G | |
| OsO4 | Electron Microscopy Sciences | 19110 | |
| PBS-A buffer | Dissolve NaH2PO4 (1.125 mM), Na2HPO4 (3.867 mM), NaCl (100 mM) in 1 L of ddH2O, adjust to pH 7.4 | ||
| Qualitative filter paper (medium speed) | Beyotime Biotechnology | FFT08 | |
| Sapphire discs | Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend | ||
| Solvent resistant pen | Electron Microscopy Sciences | 62053-B | |
| SPI-Pon 812 resin | SPI Inc | 02659-AB | |
| Transmission electron microscopy | FEI | Tecnai G2 spirit | |
| Trypsin-EDTA | GBICO | C25200-056 | |
| Tweezers | Dumont | ||
| Ultramictotome | Leica | FC7 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 |
References
- Tsien, R. Y.
- Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W.
- Masters, B. R. History of the electron microscope in cell biology. Encylopedia of Life Sciences. , (2009).
- Griffiths, G., Hoppeler, H. Quantitation in immunocytochemistry: Correlation of immunogold labeling to absolute number of membrane antigens. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 34 (11), 1389-1398 (1986).
- Tokuyasu, K. T. A technique for ultracryotomy of cell suspensions and tissues. Journal of Cell Biology. 57 (2), 551-565 (1973).
- Connolly, C. N., Futter, C. E., Gibson, A., Hopkins, C. R., Cutler, D. F. Transport into and out of the Golgi complex studied by transfecting cells with cDNAs encoding horseradish peroxidase. Journal of Cell Biology. 127 (3), 641-652 (1994).
- Grabenbauer, M., et al. Correlative microscopy and electron tomography of GFP through photooxidation. Nature Methods. 2 (11), 857-862 (2005).
- Gaietta, G., et al. Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking. Science. 296 (5567), 503-507 (2002).
- Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms. PLoS Biology. 9 (4), e1001041 (2011).
- Martell, J. D., et al. Engineered ascorbate peroxidase as a genetically encoded reporter for electron microscopy. Nature Biotechnology. 30 (11), 1143-1148 (2012).
- Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
- Mavlyutov, T. A., et al. APEX2-enhanced electron microscopy distinguishes sigma-1 receptor localization in the nucleoplasmic reticulum. Oncotarget. 8 (31), 51317-51330 (2017).
- Wang, Q., Mercogliano, C. P., Lowe, J. A ferritin-based label for cellular electron cryotomography. Structure. 19 (2), 147-154 (2011).
- Sano, T., Glazer, A. N., Cantor, C. R. A streptavidin-metallothionein chimera that allows specific labeling of biological materials with many different heavy metal ions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (5), 1534-1538 (1992).
- Mercogliano, C. P., DeRosier, D. J. Gold nanocluster formation using metallothionein: Mass spectrometry and electron microscopy. Journal of Molecular Biology. 355 (2), 211-223 (2006).
- Mercogliano, C. P., DeRosier, D. J. Concatenated metallothionein as a clonable gold label for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 160 (1), 70-82 (2007).
- Morphew, M. K., et al. Metallothionein as a clonable tag for protein localization by electron microscopy of cells. Journal of Microscopy. 260 (1), 20-29 (2015).
- Nishino, Y., Yasunaga, T., Miyazawa, A. A genetically encoded metallothionein tag enabling efficient protein detection by electron microscopy. Journal of Electron Microscopy. 56 (3), 93-101 (2007).
- Bouchet-Marquis, C., Pagratis, M., Kirmse, R., Hoenger, A. Metallothionein as a clonable high-density marker for cryo-electron microscopy. Journal of Structural Biology. 177 (1), 119-127 (2012).
- Fukunaga, Y., et al. Electron microscopic analysis of a fusion protein of postsynaptic density-95 and metallothionein in cultured hippocampal neurons. Journal of Electron Microscopy. 56 (4), 119-129 (2007).
- Diestra, E., Fontana, J., Guichard, P., Marco, S., Risco, C. Visualization of proteins in intact cells with a clonable tag for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 165 (3), 157-168 (2009).
- Risco, C., et al. sensitive, high-resolution detection of protein molecules in eukaryotic cells using metal-tagging transmission electron microscopy. Structure. 20 (5), 759-766 (2012).
- Ding, S. -W., et al. Noncanonical role for the host Vps4 AAA+ ATPase ESCRT protein in the formation of tomato bushy stunt virus replicase. PLoS Pathogens. 10 (4), e1004087 (2014).
- Jiang, Z., et al. Direct synthesis of gold nanoparticles on cysteine-rich tags in yeast cells. Protocol Exchange. , (2020).
- Jiang, Z., et al. Direct synthesis of gold nanoparticles on cysteine-rich tags in mammalian cells. Protocol Exchange. , (2020).
- Jiang, Z., et al. Genetically encoded tags for direct synthesis of EM-visible gold nanoparticles in cells. Nature Methods. 17 (9), 937-946 (2020).
- Brust, M., Walker, M., Bethell, D., Schiffrin, D. J., Whyman, R. Synthesis of thiol-derivatised gold nanoparticles in a two-phase liquid-liquid system. Journal of the Chemical Society, Chemical Communications. 7, 801-802 (1994).
