Summary
Este protocolo enfoca a neovascularização corneana induzida por queimadura alcalina em camundongos. O método gera um modelo de doença corneana reprodutível e controlável para estudar a angiogênese patológica e os mecanismos moleculares associados e testar novos agentes farmacológicos para prevenir a neovascularização corneana.
Abstract
A neovascularização da córnea (CoNV), uma forma patológica de angiogênese, envolve o crescimento de vasos sanguíneos e linfáticos na córnea avascular a partir do limbo e afeta negativamente a transparência e a visão. A queimadura alcalina é uma das formas mais comuns de trauma ocular que leva à CoNV. Neste protocolo, a CoNV é induzida experimentalmente usando solução de hidróxido de sódio de forma controlada para garantir a reprodutibilidade. O modelo de queimadura alcalina é útil para o entendimento da patologia da CoNV e pode ser estendido para o estudo da angiogênese em geral devido à avascularidade, transparência e acessibilidade da córnea. Neste trabalho, a CoNV foi analisada por exame direto em microscópio dissecante e por imunomarcação de córneas de montagem plana usando anti-CD31 mAb. A linfangiogênese foi detectada em córneas planas por imunomarcação com anti-LYVE-1 mAb. O edema de córnea foi visualizado e quantificado pela tomografia de coerência óptica (OCT). Em resumo, este modelo ajudará a avançar os ensaios de neovascularização existentes e a descobrir novas estratégias de tratamento para a angiogênese ocular e extraocular patológica.
Introduction
A córnea é um tecido avascular que mantém sua transparência ao estabelecer um privilégio angiogênico1,2. Danos à córnea podem resultar em inflamação e desenvolvimento de vasos sanguíneos e linfáticos, além de fibrose3. A neovascularização da córnea (NVO) leva à deficiência visual e é a segunda causa de cegueira nomundo4. A CoNV afeta cerca de 1,4 milhão de pessoas nos Estados Unidos por ano5. A NVco pode ser induzida por vários fatores, incluindo queimaduras químicas, infecções, inflamação e hipóxia 3,6. As queimaduras químicas são uma das emergências oculares mais comuns, sendo responsáveis por cerca de 13,2% dos traumas oculares e requerem avaliação e tratamentoimediato7. As queimaduras químicas podem ser alcalinas ou ácidas, mas as alcalinas causam lesões mais graves, pois o álcali penetra mais profundamente no tecido8.
Modelos de camundongos de queimadura alcalina são amplamente utilizados para estudar CoNV e cicatrização de feridas. Comparados ao modelo de angiogênese de bolsa corneana 9,10, os modelos de queimadura alcalina são relativamente simples de criar e também podem ser usados para estudar inflamação corneana, fibrose e proliferação epitelial. Esses modelos também estão mais relacionados às queimaduras químicas clínicas do que os modelos de sutura corneana de angiogênese11. Com queimadura alcalina, a córnea avascular desenvolve vasos sanguíneos devido à inflamação e a um desequilíbrio nos fatores antiangiogênicos e pró-angiogênicos 1,2. As desvantagens dos modelos de queimadura alcalina corneana são as dificuldades no controle da área e gravidade da queimadura alcalina, a variação na neovascularização corneana e a queima não intencional dos tecidos adjacentes devido ao excesso de solução alcalina. O objetivo deste estudo é descrever um modelo controlado de queimadura alcalina corneana em camundongos utilizando papel de filtro pré-embebido em solução de hidróxido de sódio. Esse modelo poderia ser usado para estudar fatores angiogênicos, reagentes terapêuticos antiangiogênicos e outros fatores e reagentes que poderiam modular a inflamação e a fibrose.
Protocol
Todo o trabalho com animais, incluindo os procedimentos experimentais e a eutanásia, foi aprovado pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) da Baylor College of Medicine com o número de protocolo AN-8790.
1. Preparação de 1 N NaOH
- Adicionar 4 mL de água deionizada estéril a um tubo centrífugo de 15 mL. Pesar 400 mg de hidróxido de sódio (NaOH) e adicionar ao tubo cuidadosamente.
- Dissolva o NaOH agitando lentamente a solução usando uma haste de vidro. Completar o volume para 10 mL adicionando água deionizada estéril ao tubo e misturar novamente invertendo suavemente o tubo para cima e para baixo. Feche bem a tampa e guarde a solução à temperatura ambiente.
- Prepare a solução fresca todos os meses porque a concentração da solução de NaOH pode ser reduzida pela solução que absorve dióxido de carbono no ar.
- Misture sempre suavemente a solução de NaOH antes de usar.
CUIDADO: Prepare a solução dentro de um exaustor químico e use equipamentos de proteção individual (EPIs) apropriados.
2. Preparação da solução de paraformaldeído (PFA) a 4%
- Adicionar 30 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) a um copo de vidro. Pese 4 g de paraformaldeído (PFA) e junte-o ao copo.
- Mantenha o copo numa placa quente a 60 °C com agitação. Adicione a solução de NaOH 1 N gota a gota para elevar o pH até que a solução limpe.
- Verificar e ajustar o pH para 7,4 utilizando 1 N de ácido clorídrico (HCl). Ajustar o volume final para 50 mL com 1x PBS.
- Arrefecer e filtrar a solução. Conservar a solução a 4 °C.
CUIDADO: Prepare a solução em um exaustor enquanto estiver usando EPI apropriado.
3. Preparação do coquetel de ketamina/xilazina
- Preparar o coquetel de cetamina/xilazina adicionando 0,8 mL de cetamina (concentração estoque: 100 mg/mL) e 0,16 mL de xilazina (concentração estoque: 100 mg/mL) a 9,4 mL de solução salina.
- Armazenar o cocktail em frascos de injeção estéreis à temperatura ambiente (TR).
4. Queimadura alcalina na córnea do rato
- Injetar meloxicam (4-6 mg/kg de peso corporal) por via subcutânea 30 minutos antes do procedimento para alívio da dor. Anestesiar os camundongos (C57BL/6J, 6-8 semanas de idade, machos) usando uma injeção i.p. do coquetel cetamina/xilazina (Ketamina 80 mg/kg e Xilazina 16 mg/kg de peso corporal).
- Verifique a resposta reflexa (retirada do pedal) apertando os dedos dos pés do mouse e confirme a ausência do reflexo. Aplicar uma gota de anestésico tópico, proparacaína a 0,5%, na superfície corneana de um olho e uma gota de lágrimas artificiais no outro olho.
- Usando um punch de biópsia de 2 mm, perfure os discos de papel de filtro Whatman.
- Adicionar 2 μL de NaOH 1N a uma placa de Petri limpa. Coloque o disco de papel filtro de 2 mm sobre a gota de NaOH de 1 N e deixe de molho por 15 s.
- Pegue o papel filtro com pinça e aplique o papel filtro no olho tratado com proparacaína no centro da córnea por 30 s.
OBS: O papel filtro deve estar tocando apenas o centro da córnea, e deve-se tomar cuidado para evitar a movimentação do papel filtro uma vez colocado, pois mover o papel filtro pode causar queimaduras nos tecidos adjacentes. - Lave o olho lavando com 20 mL de solução salina estéril em uma seringa estéril.
NOTA: Deve-se tomar cuidado para garantir que a córnea, juntamente com o saco conjuntival, seja lavada cuidadosamente para garantir que não haja mais danos à córnea ou ao tecido circundante. Lavar o saco conjuntival evitará ainda mais o simbléfaro. - Limpe suavemente o excesso de soro fisiológico dos olhos e da área circundante usando lenços descartáveis macios. Depois, mantenha os ratos em uma gaiola de recuperação em uma almofada de aquecimento aquecida até o deambulação.
NOTA: Os ratos são monitorados diariamente após a queimadura alcalina por 3 dias. Se forem observados sintomas de dor ou stress, meloxicam (4-6 mg/kg de peso corporal) é administrado por via subcutânea.
5. Exame e avaliação da neovascularização e opacidade
- Em camundongos anestesiados, examinar os olhos sob um microscópio de dissecção no dia 10 após a queimadura e obter imagens usando uma câmera acoplada ao escopo de dissecção para pontuar a opacidade e a neovascularização.
NOTA: Um escopo de dissecção regular com uma câmera conectada é suficiente. - Ao observar a córnea através do microscópio de dissecção, pontuar a opacidade após a queimadura com base na seguinteescala12:
0 = Sem opacidade; córnea clara
1 = Opacidade leve; ligeira nebulosidade nas áreas da íris e pupilas; íris e pupila facilmente visíveis
2 = Opacidade moderada; íris e pupila pouco visíveis
3 = Opacidade grave; íris ou pupila não visíveis
4 = Córnea opaca; íris e pupila não visíveis - Ao observar a córnea através do microscópio de dissecção, pontuar a CoNV com base na seguinteescala12:
0 = Sem neovascularização; ausência de novos vasos do limbo
1 = Neovascularização leve; novos navios originários do limbo
2 = Neovascularização moderada; vasos sanguíneos originados do limbo e crescendo em direção ao centro da córnea
3 = Neovascularização grave; vasos sanguíneos que se originam do limbo e atingem e/ou atravessam o centro da córnea - Use o teste t de Student para comparar estatisticamente os escores de opacidade e neovascularização entre os grupos de queimadura alcalina e olhos saudáveis.
- Eutanasiar os camundongos no dia 10 por exposição ao isoflurano a 5% até 1 min após a parada respiratória, seguida de luxação cervical, e coletar as córneas para imagens de montagem plana.
6. Tomografia de coerência óptica (OCT)
- Tire imagens de OCT do segmento anterior dos olhos em camundongos anestesiados no dia 10 após a queimadura. Realize a aquisição de imagens da OCT como uma varredura de volume usando o modo IR + OCT com um campo de visão de 30° e 100% de intensidade IR.
- Quantifique a espessura das córneas utilizando o software ImageJ.
- Para medir a espessura, use a ferramenta Seleção de linha no software ImageJ para criar uma linha reta entre as superfícies anterior e posterior na córnea central.
- Clique em Analisar > Medir nas ferramentas de software para transferir os valores para a janela de dados.
- Copie os valores para um arquivo de planilha e compare estatisticamente a espessura da córnea entre os grupos de queimadura alcalina e olhos saudáveis usando um teste t de Student.
NOTA: A espessura da córnea é a distância de um ponto na superfície anterior da córnea até o ponto mais próximo na superfície posterior da córnea no centro da córnea.
7. Imunomarcação para CoNV em córneas planas
- Eutanasiar os camundongos no dia 10 pós-queimadura alcalina e enuclear os olhos por dissecção romba.
- Afaste as pálpebras usando os dedos polegar e indicador e coloque pinças sob o globo ocular. Feche a pinça e puxe suavemente o globo ocular para fora da órbita.
- Coloque os globos oculares em 1x PBS. Para cada globo ocular, remova a córnea do globo ocular fazendo primeiro uma incisão usando uma agulha de 30 G abaixo da área do limbo.
- Cortar ao redor da área do limbo usando microtesoura corneana, com a incisão como ponto de partida, e separar lentamente a córnea e o limbo do globo terrestre.
- Limpe as córneas suavemente usando um pincel fino para remover a íris. Fixar as córneas em paraformaldeído a 4% por 1 h.
- Lave as córneas três vezes por 20 min cada em 1x PBS à temperatura ambiente (TR).
- Incubar em tampão de bloqueio (1x PBS suplementado com 0,1% de Triton-X 100 e 5% de albumina de soro bovino [BSA]) por 1 h no TR.
- Transfira as córneas para uma solução de anticorpos contendo anticorpos primários. Preparar a solução de anticorpos em 1x PBS suplementado com BSA a 1%, Triton-X 100 a 0,1%, Dylight550-conjugado anti-CD31 mAb (1:100) e Alexa Fluor488-conjugado anti-LYVE-1 mAb (1:100).
- Incubar durante 3 dias a 4 °C. Lave as córneas em 1x PBS três vezes por 20 min cada.
- Manchar os núcleos usando solução de coloração Hoechst (1:1.000) por 5 min no escuro.
- Achate as córneas com cortes radiais e monte-as em uma lâmina de vidro pré-limpa usando meio de montagem e lamínulas. Selar as lamínulas com esmalte transparente e secar as lâminas durante a noite no escuro antes da análise por microscopia confocal.
- Imagem das córneas planas usando microscopia confocal costurando imagens individuais Z-stack; Use uma objetiva de 10x, lasers de 488 nm e 561 nm e uma resolução de 512 pixels x 512 pixels por fatia em scanners Galvano não ressonantes.
- Quantifique a densidade dos vasos sanguíneos CD31+ e linfáticos LYVE-1+ usando o software ImageJ.
- Para determinar a densidade vascular, converta as imagens confocais em uma imagem de 8 bits.
- Escolha Densidade Vascular nos Plugins.
- Escolha a região de interesse na imagem e clique em OK. As medições serão abertas em uma nova janela de dados.
- Copie os valores para um arquivo de planilha e compare estatisticamente a densidade vascular entre os grupos de queimadura alcalina e olhos saudáveis usando um teste t de Student.
NOTA: CD31, também chamada de molécula de adesão de células endoteliais plaquetárias-1 (PECAM-1), é uma molécula de adesão celular envolvida na angiogênese e é altamente expressa nas células endoteliais de vasos sanguíneos precoces e maduros13. O LYVE-1 (lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor-1) é um marcador de superfície celular em células endoteliais linfáticas e pode ser usado como marcador de linfangiogênese14.
Representative Results
Este estudo descreve um método para induzir angiogênese corneana no olho de camundongo por queimadura alcalina. As imagens obtidas com o microscópio de dissecção (Figura 1A,B) demonstraram escores de neovascularização e opacidade significativamente elevados nas córneas do grupo queimado alcalino (P < 0,05; Figura 1C,D). As córneas coletadas no 10º dia foram novamente imunomarcadas com anti-CD31 mAb para vasos sanguíneos e anti-LYVE-1 mAb para linfáticos, respectivamente (Figura 2A-I). O grupo queimadura alcalina apresentou densidades significativamente maiores de vasos sanguíneos e linfáticos após 10 dias (P < 0,001 e P < 0,05, respectivamente; Figura 2J,K). A espessura da córnea, imageada e quantificada pela OCT (Figura 3A,B), foi significativamente maior no grupo com queimadura alcalina (P < 0,01; Figura 3C).
Figura 1: Neovascularização e opacidade corneana induzida por queimadura alcalina. (A,B) A neovascularização da córnea brotou dos vasos do limbo em direção ao centro da córnea no olho de camundongo (A) queimado por álcali (B), mas não foi saudável 10 dias após a lesão. (C,D) Quantificação da (C) neovascularização corneana e (D) opacidade nos painéis A e B (± MEV; teste t; *P < 0,05; n = 3 olhos, 1 olho/rato). As setas vermelhas representam o limbo, e a seta amarela indica o surgimento de novos vasos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Neovascularização da córnea e linfangiogênese por queimadura alcalina. A imuno-histoquímica revelou vasos sanguíneos (A,D,G) e (B,E,H) utilizando os mAbs anti-CD31 e anti-LYVE-1, respectivamente. (A-C) A córnea de camundongo saudável. (D-I) A córnea alcalina-queimada 10 dias após a lesão. (C,F,I) Imagens sobrepostas de sinais CD31 e LYVE-1. (G-I) Imagens ampliadas para painéis D-F. Barras de escala = (A-F) 200 μm e (G-I) 500 μm. (J,K) Quantificação da densidade de vasos sanguíneos e linfáticos nos painéis A-F, conforme indicado (± MEV; teste t; *P < 0,05; ***P < 0,001; n = 3 olhos, 1 olho/rato). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Aumento da espessura da córnea causado pela queimadura alcalina . (A) Uma imagem OCT de um olho de rato saudável. (B) Uma imagem de OCT da córnea de camundongo 10 dias após queimadura alcalina. (C) Quantificação da espessura corneana nos painéis A e B, medida no centro da córnea (± MEV; teste t; **P < 0,01; n = 3 olhos, 1 olho/rato). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
A córnea é um excelente tecido para o estudo da angiogênese e inflamação, pois é acessível e avascular, podendo ser convenientemente detectada e documentada a neovascularização. A queimadura da córnea em coelhos, ratos e camundongos tem sido utilizada para estudar a angiogênese corneana, inflamação e opacidade, ulceração, perfuração da córnea e fibrose15,16,17. Além disso, o modelo de queimadura corneana em camundongos é valioso para testar várias estratégias terapêuticas para angiogênese e inflamação, pois camundongos possuem um sistema imunológico intimamente relacionado ao de humanos18. A disponibilidade de técnicas para manipular geneticamente o genoma de camundongos também torna a espécie uma excelente escolha para esse tipo deestudo19. O desafio desta pesquisa foi desenvolver um método de queimadura corneana que forneça fisiopatologia consistente e reprodutível.
O modelo de queimadura alcalina é particularmente útil para a triagem farmacológica de drogas que modulam a angiogênese, inflamação e fibrose. Os requisitos mínimos de reagentes e recursos, a simplicidade de realizar a queima alcalina e os benefícios da curta duração do protocolo e da observação direta dos resultados tornam a queimadura alcalina na córnea de camundongos uma escolha primária para a triagem farmacológica de drogas. Entretanto, alguns cuidados devem ser considerados na realização desse procedimento para garantir consistência e reprodutibilidade. Em primeiro lugar, o papel de filtro deve ser colocado no centro da córnea para evitar queimar outras áreas do olho, especialmente o limbo, pálpebras e conjuntiva; em segundo lugar, o volume e a concentração de NaOH devem ser apropriados para obter resultados consistentes da queimadura alcalina na córnea. O filtro não deve estar a pingar molhado, mas deve ter sido embebido na solução de NaOH. O tamanho e o tipo de filtro e a normalidade e volume da solução utilizada neste método são otimizados para evitar um transbordamento de NaOH. O uso de papel de filtro de tamanhos diferentes ou de um volume maior ou menor de NaOH causaria inconsistências na neovascularização. Em terceiro lugar, é importante evitar que a solução de NaOH absorva CO2 no ar ambiente, apertando imediatamente a tampa do tubo da solução após a utilização e reduzindo a relação ar/solução. Deve-se tomar cuidado com o uso de soluções alcalinas frescas para evitar inconsistências na neovascularização e evitar ulceração corneana. Finalmente, a lavagem extensiva de toda a solução de NaOH do olho e conjuntiva com soro fisiológico é necessária para evitar mais danos à córnea e aos tecidos circundantes do olho. A lavagem completa da córnea e dos tecidos adjacentes também evitará o simbléfaro.
O protocolo aqui descrito é um método eficiente e confiável para o estudo da fisiopatologia da angiogênese corneana. Este protocolo pode ser usado para estudar a inflamação da córnea, fibrose e cicatrização de feridas.
Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela SRB Charitable Corporation, National Institutes of Health (NIH) P30EY002520, e uma bolsa institucional irrestrita da Research to Prevent Blindness (RPB) para o Departamento de Oftalmologia, Baylor College of Medicine. W.L. é apoiado pela The Knights Templar Eye Foundation Endowment em Oftalmologia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium Chloride Injection | Hospira | KL-7302 | |
| 30 G Needle | McKesson | 16-N3005 | |
| A1R Confocal | Nikon Instruments | ||
| Anti-CD31 | Novus Biologicals | NB100-1642R | |
| Anti-LYVE-1 | Life technologies | 53-0443-82 | |
| ASM Module | Heidelberg Engineering | Anterior segment objective | |
| Biopsy Punch | McKesson | 16-1309 | |
| BSA | Thermoscientific | 9048-46-8 | |
| Coverslip | VWR International | 22X22-1-601640G | |
| Dissection Microscope | AmScope | SM-4TZ-30WY-10M3 | |
| Fluoromount-G | Electron Microscopy Sciences | 17984-25 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 15000-02 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11049-10 | |
| Forceps | Fisherbrand | 12-000-157 | |
| Forceps | Roboz | RS-4905 | |
| Gonak Hypromellose | Akorn | 17478006412 | |
| GraphPad Prism 9 | GraphPad Sotware, Inc | ||
| Heating pad | K&H Pet Products | 100213018 | |
| Hoescht | Life Technologies | 62249 | |
| HRA + OCT Spectralis | Heidelberg Engineering | ||
| Insulin Syringe | Mckesson | 102-SN310C31516P | |
| Kimwipe | Kimberly Clark Professional | 34155 | |
| Micro Cover Glass | VWR | 48366-067 | |
| Microscissors | Roboz | RS-5110 | |
| Microscopic Slide | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| NaOH | Sigma Aldrich | 55881-500G | |
| Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Dexamethasone | Bausch & Lomb | 24208-0795-35 | |
| Normal Serum | Jackson Immuno | 008-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 158127-500G | |
| PBS | Gibco | 20012-027 | |
| Proparacaine HCl | Bausch & Lomb | 24208073006 | |
| Saline | Henry Schein | 1531042 | |
| SMZ125 | Nikon Instruments | ||
| Syringe 10 mL | McKesson | 16-S10C | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | TX1568-1 | |
| Whatmann Filter Paper | Cytiva | WHA1003323 |
References
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