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Cancer Research

अग्नाशय ी कैंसर कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल अल्ट्रास्ट्रक्चरल परिवर्तनों के विज़ुअलाइज़ेशन के लिए एक त्रि-आयामी तकनीक

Published: June 23, 2023 doi: 10.3791/65290
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1, 2, 3, 1,3
1School of Pharmaceutical Science of Zhejiang Chinese Medical University, 2Department of Pharmacy, Zhejiang Provincial Dermatology Hospital, 3Academy of Chinese Medical Sciences of Zhejiang Chinese Medical University
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल बताता है कि उच्च सटीकता, उच्च रिज़ॉल्यूशन और उच्च थ्रूपुट के साथ 3 डी इमेजिंग प्राप्त करने के लिए माइटोकॉन्ड्रियल क्रिस्टे का पुनर्निर्माण कैसे करें।

Abstract

सेल ऑर्गेनेल अल्ट्रास्ट्रक्चर की गतिशील विशेषताओं को समझना, जो न केवल अज्ञात जानकारी में समृद्ध है, बल्कि त्रि-आयामी (3 डी) परिप्रेक्ष्य से परिष्कृत भी है, यांत्रिक अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) अच्छी इमेजिंग गहराई प्रदान करता है और नैनोमीटर पैमाने पर भी सेलुलर ऑर्गेनेल की अल्ट्रास्ट्रक्चरल आकृति विज्ञान की जांच करने के लिए उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवि ढेर के पुनर्निर्माण की अनुमति देता है; इसलिए, 3 डी पुनर्निर्माण अपने अतुलनीय फायदों के कारण महत्व प्राप्त कर रहा है। स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम) एक उच्च-थ्रूपुट छवि अधिग्रहण तकनीक प्रदान करता है जो लगातार स्लाइस में रुचि के एक ही क्षेत्र से 3 डी में बड़ी संरचनाओं के पुनर्निर्माण की अनुमति देता है। इसलिए, ऑर्गेनेल के सच्चे 3 डी अल्ट्रास्ट्रक्चर को बहाल करने के लिए बड़े पैमाने पर 3 डी पुनर्निर्माण में एसईएम का आवेदन तेजी से आम होता जा रहा है। इस प्रोटोकॉल में, हम अग्नाशय के कैंसर कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल क्रिस्टे का अध्ययन करने के लिए सीरियल अल्ट्राथिन सेक्शन और 3 डी पुनर्निर्माण तकनीकों के संयोजन का सुझाव देते हैं। इन तकनीकों का प्रदर्शन कैसे किया जाता है, इसका विवरण इस प्रोटोकॉल में चरण-दर-चरण तरीके से वर्णित किया गया है, जिसमें ऑस्मियम-थियोकार्बोहाइड्राज़ाइड-ऑस्मियम (ओटीओ) विधि, सीरियल अल्ट्राथिन सेक्शन इमेजिंग और विज़ुअलाइज़ेशन डिस्प्ले शामिल हैं।

Introduction

माइटोकॉन्ड्रिया कोशिका में सबसे महत्वपूर्ण जीवों में से एक हैं। वे सेलुलर बायोएनर्जेटिक और चयापचय 1,2 के केंद्रीय केंद्र के रूप में काम करते हैं और कैंसर3 में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। अग्नाशय का कैंसर (पीसी) अपने तेजी से प्रसार और उच्च मृत्यु दर के कारण इलाज के लिए सबसे कठिन कैंसर4 में से एक है। माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन, जो मुख्य रूप से माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान 3,5,6,7 में परिवर्तन के कारण होता है, को पीसी 8 के अंतर्निहित रोग तंत्र से जोड़ा गया है। माइटोकॉन्ड्रिया भी अत्यधिक गतिशील हैं, जो उनके नेटवर्क कनेक्टिविटी और क्रिस्टे संरचना9 में लगातार और गतिशील परिवर्तनों से परिलक्षित होता है। क्रिस्टे संरचना का पुनर्निर्माण सीधे माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन और सेलुलर अवस्था 10,11 को प्रभावित कर सकता है, जो ट्यूमर सेल के विकास, मेटास्टेसिस और ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट परिवर्तन12,13 के दौरान काफी बदल जाते हैं।

हाल के वर्षों में, वैज्ञानिकों ने ईएम अवलोकन14,15,16,17 का उपयोग करके इस ऑर्गेनेल का अध्ययन किया है; उदाहरण के लिए, शोधकर्ताओं ने 3 डी पुनर्निर्माण तकनीक 6,7,18,19 का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल गतिशीलता का विश्लेषण किया है। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवियों के 3 डी पुनर्निर्माण के लिए सामान्य अवधारणा और विधि औपचारिक रूप से 196820 की शुरुआत में स्थापित की गई थी और इसमें टी 4 फेज पूंछ के पुनर्निर्माण के लिए इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, इलेक्ट्रॉन विवर्तन और कंप्यूटर छवि प्रसंस्करण का संयोजन शामिल था। अब तक, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 3 डी इमेजिंग तकनीक ने छवि संकल्प 21, स्वचालनकी डिग्री 22, और प्रसंस्करण मात्रा 23 के संदर्भ में महत्वपूर्ण प्रगति की है और इसका उपयोग जैविक अनुसंधान में तेजी से व्यापक पैमाने पर किया गया है, ऊतक स्तर से नैनोमीटर स्केल24 पर ऑर्गेनेल अल्ट्रास्ट्रक्चर स्तर तक। हाल के वर्षों में, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 3 डी इमेजिंग भी अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए एक आशाजनक तकनीक बन गई है25,26,27.

माइटोकॉन्ड्रियल क्रिस्टे पर बढ़ता ध्यान विशेष रूप से अल्ट्रास्ट्रक्चरल वॉल्यूम इमेजिंग के लिए आवश्यक आवश्यकताओं को दर्शाता है। ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) का उपयोग कॉपर ग्रिड (400 जाल)28 पर एकत्र किए गए नमूनों की कल्पना करने के लिए किया गया है, जिसमें इलेक्ट्रॉन बीम खंड से गुजरता है। हालांकि, कॉपर ग्रिड की सीमित सीमा के कारण, एक ही नमूने29 के निरंतर स्लाइस को पूरी तरह से चित्रित करना असंभव है। यह टीईएम इमेजिंग के दौरान लक्ष्य संरचनाओं के अध्ययन को जटिल बनाता है। इसके अतिरिक्त, टीईएम समय लेने वाले और त्रुटि-प्रवण मैनुअल कार्यों पर निर्भर करता है, जिसमें कई स्लाइस काटना और इकट्ठा करना और उन्हें क्रमिक रूप सेइमेजिंग करना शामिल है, इसलिए इसे बड़ी मात्रा के नमूनोंके अल्ट्रास्ट्रक्चरल पुनर्निर्माण के लिए अनुकूलित नहीं किया गया है। वर्तमान में, बड़ी मात्रा में नमूना इमेजिंग का उच्च-रिज़ॉल्यूशन पुनर्निर्माण विशेष उपकरणों के उपयोग के माध्यम से प्राप्त किया जाता है, जैसे कि टीईएम कैमरा सरणी (टीईएमसीए) 30 या दो दूसरी पीढ़ी के टीईएमसीए सिस्टम (टीईएमसीए 2)31, जो थोड़े समय में स्वचालित उच्च-थ्रूपुट इमेजिंग को सक्षम करते हैं। हालांकि, इस प्रकार की इमेजिंग को अनुकूलित उपकरणों की आवश्यकता के कारण प्राप्त करना आसान और सार्वभौमिक होने का लाभ नहीं है।

टीईएम की तुलना में, एसईएम 32,33 के आधार पर बड़े क्षेत्रों के लिए स्वचालित रूप से हजारों सीरियल वॉल्यूमेट्रिक छवियों को उत्पन्न करने की विधि सीरियल इमेजिंग की दक्षता और विश्वसनीयता को बढ़ाती है और उच्च जेड-रिज़ॉल्यूशन34 प्रदान करती है। उदाहरण के लिए, सीरियल ब्लॉक-फेस स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसबीएफ-एसईएम) और केंद्रित आयन बीम स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एफआईबी-एसईएम) दोनों ने उच्च गति, दक्षता और संकल्प35,36 के साथ अल्ट्रास्ट्रक्चर के 3 डी पुनर्निर्माण को प्राप्त करना संभव बना दिया है। हालांकि, यह अपरिहार्य है कि ब्लॉक की सतह को यांत्रिक रूप से एसबीएफ-एसईएम के हीरे के चाकू द्वारा या एफआईबी-एसईएम33,37 के केंद्रित आयन बीम के साथ मिलिंग करके काट दिया जाता है। नमूनों के लिए दो विधियों की विनाशकारीता के कारण, आगेके विश्लेषण के लिए उसी लक्ष्य संरचना का पुनर्निर्माण करना संभव नहीं है। इसके अलावा, कुछ अध्ययनों ने रोगसंबंधी परिवर्तनों का निरीक्षण करने के लिए ईएम का उपयोग करके कैंसर कोशिकाओं के 3 डी ऑर्गेनेल अल्ट्रास्ट्रक्चर के पुनर्निर्माण का प्रयास किया है। इन कारणों से, कैंसर कोशिकाओं के पैथोलॉजिकल तंत्र को और स्पष्ट करने के लिए, जैसे कि अग्नाशय ी कैंसर कोशिकाएं, हम क्रिस्टे स्तर पर माइटोकॉन्ड्रियल अल्ट्रास्ट्रक्चर का विश्लेषण करने के लिए एक अल्ट्रामाइक्रोटोम और एक फील्ड उत्सर्जन स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (एफई-एसईएम) का उपयोग करके सीरियल सेक्शन छवियों के 3 डी पुनर्निर्माण के लिए एक नई तकनीक का प्रस्ताव करते हैं; इस तकनीक के साथ, एक कुशल और सुलभ विधि का उपयोग करके उच्च-रिज़ॉल्यूशन डेटा प्राप्त किया जा सकता है। अल्ट्रामाइक्रोटोम का उपयोग करके बनाए गए सीरियल अल्ट्राथिन वर्गों को ग्रिड केस में अर्ध-स्थायी रूप से संग्रहीत किया जा सकता है और कई वर्षों के बाद भी कई बार पुन: चित्रित किया जा सकताहै। एफई-एसईएम को उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग, उच्च आवर्धन और बहुमुखी प्रतिभा प्रदान करने की क्षमता के कारण विभिन्न अनुसंधान क्षेत्रों में एक उपकरण के रूप में अत्यधिक मूल्यवानहै। 3 डी में ऑर्गेनेल की ठीक संरचना को प्रदर्शित करने के प्रयास में, एफई-एसईएम43,44 द्वारा उत्पादित बैक-बिखरे इलेक्ट्रॉनों का उपयोग करके उपयोगी रिज़ॉल्यूशन के साथ सीरियल 2 डी छवि स्टैक बनाने की तकनीक का उपयोगविशेष उपकरणों के बिना लक्ष्य क्षेत्रों या उनके संबंधित संरचनाओं के उच्च-थ्रूपुट और मल्टी-स्केल इमेजिंग को प्राप्त करने के लिए भी किया जा सकता है।. चार्ज कलाकृतियों की पीढ़ी सीधे अधिग्रहित छवियों की गुणवत्ता को प्रभावित करती है, इसलिए निवास समय को कम रखना विशेष रूप से महत्वपूर्ण है।

इस प्रकार, वर्तमान अध्ययन माइटोकॉन्ड्रियल क्रिस्टे46 की 3 डी संरचना के पुनर्निर्माण के लिए इस एसईएम तकनीक में नियोजित प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं पर विस्तार से बताता है। विशेष रूप से, हम माइटोकॉन्ड्रियल क्षेत्रों के अर्ध-स्वचालित विभाजन को प्राप्त करने और अमीरा सॉफ्टवेयर का उपयोग करके 3 डी पुनर्निर्माण को डिजिटाइज़ करने के लिए विकसित प्रक्रिया दिखाते हैं, जिसमें पारंपरिक ओटीओ नमूना तैयारी विधि44,47 का उपयोग करके स्लाइस नमूने बनाना, अल्ट्रामाइक्रोटोम स्लाइसिंग का उपयोग करके अनुभाग संग्रह को पूरा करना और एफई-एसईएम द्वारा अनुक्रमिक 2 डी डेटा प्राप्त करना भी शामिल है।

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Protocol

1. सामग्री तैयार करना

  1. डीएमईएम माध्यम (10% भ्रूण गोजातीय सीरम और पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के 100 यू / एमएल) में 2 x 106 पैनक02 कोशिकाएं, और 48 घंटे के लिए 5% कार्बन डाइऑक्साइड और 95% हवा के वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस और 95% आर्द्रता बनाए रखें।
  2. पैनक02 कोशिकाओं को इकट्ठा करें, 2 मिनट के लिए 28 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें, और फिर सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें। सुनिश्चित करें कि नमूना एक उपयुक्त आकार (1 x 107 कोशिकाओं) का है, अन्यथा, निम्नलिखित निर्धारण और निर्जलीकरण चरण अच्छी तरह से काम नहीं करेंगे।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर 1.5 एमएल माइक्रो-सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में ताजा पैनक02 कोशिकाओं को ठीक करने के लिए फिक्सेटिव के रूप में 2.5% ग्लूटाराल्डिहाइड का 1 एमएल जोड़ें।
    नोट: नमूने को निम्नलिखित चरणों में से प्रत्येक में 5 मिनट के लिए 1,006 x g पर सेंट्रीफ्यूज करने की आवश्यकता है (चरण 1.3-1.11)।
  4. फिक्सेटिव को एस्पिरेट करें, और नमूने को 0.1 एम फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) के साथ दो बार कुल्ला करें, और फिर 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर डबल-डिस्टिल्ड पानी (डीडीएच2ओ) के साथ दो बार कुल्ला करें।
  5. 1% ऑस्मियम टेट्रोक्साइड (ओएसओ 4) और 1.5% पोटेशियम फेरोसाइनाइड युक्त घोल का 50 μL 1 घंटे के लिए4 डिग्री सेल्सियस पर 1: 1 के अनुपात में जोड़ें। फिर, हर बार 10 मिनट के लिए 0.1 एम पीबीएस के साथ दो बार कुल्ला करें, और एक और 10 मिनट के लिए डीडीएच2ओ से कुल्ला करें।
  6. 1% थायोकार्बोहाइड्राज़ाइड (टीसीएच) का 1 एमएल जोड़ें, 30 मिनट से 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें, और फिर हर बार 10 मिनट के लिए चार बार डीडीएच2ओ से कुल्ला करें।
  7. 1% ओएसओ4 के 50 μL जोड़ें, 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर ठीक करें, और फिर हर बार 10 मिनट के लिए चार बार डीडीएच2ओ के साथ कुल्ला करें।
  8. रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर 2% यूरिनिल एसीटेट के 1 मिलीलीटर जोड़ें, और फिर हर बार 10 मिनट के लिए चार बार डीडीएच2ओ के साथ कुल्ला करें।
  9. अतिरिक्त 1 घंटे की इनक्यूबेशन के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर वाल्टन समाधान के 1 एमएल (0.066 ग्राम लीड नाइट्रेट का 0.066 ग्राम 0.03 मोल / एल एस्पार्टिक एसिड स्टॉक समाधान में घुल गया) जोड़ें।
  10. हर बार 10 मिनट के लिए चार बार डीडीएच2ओ के साथ कुल्ला करें, और फिर हर बार 10 मिनट के लिए एक श्रेणीबद्ध अल्कोहल श्रृंखला में निर्जलित करें: 50% शराब, 70% शराब, 80% शराब, और 90% अल्कोहल 1x, और 100% अल्कोहल 2x। फिर, हर बार 10 मिनट के लिए दो बार 100% एसीटोन में निर्जलित करें। निर्जलीकरण के लिए प्रत्येक घोल के 1 एमएल का उपयोग करें।
  11. एसीटोन के 200 μL को 3: 1, 1: 1 और 1: 3 के अनुपात में पोन 812 एपॉक्सी राल के साथ मिलाएं। नमूने को क्रमशः 2 घंटे, 4 घंटे और 4 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर राल में भिगोएं, और फिर रात भर गर्भवती करने के लिए 100% पोन 812 एपॉक्सी राल लें।
    नोट: धुंधला और राल एम्बेडिंग चरणों का प्रदर्शन करते समय, फ्यूम हुड में काम करना महत्वपूर्ण है क्योंकि ये विषाक्त पदार्थ हैं। इसके अतिरिक्त, प्रयोग के दौरान लैब कोट और विलायक प्रतिरोधी दस्ताने पहने जाने चाहिए।
  12. नमूनों को एक एम्बेडिंग मोल्ड में डालें, और फिर पॉलीमराइज करने के लिए 48 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर ओवन में रखें। नमूने के चारों ओर राल की उपस्थिति को कम करने के लिए फ्लैट एम्बेडिंग29 का उपयोग करें। यह नमूना स्थापना को सरल बनाता है और बाद की छवि विभाजन पर चार्जिंग कलाकृतियों के प्रभाव को कम करता है।
    नोट: बाद में एक क्षैतिज काटने की सतह उत्पन्न करने के लिए, मोल्ड छेद में राल की एक छोटी मात्रा को जोड़ा जा सकता है, इस बात का ध्यान रखते हुए कि इसे ओवरफिल न किया जाए।
  13. सिलिकॉन वेफर्स को पहले धोकर तैयार करें और फिर 30 मिनट के लिए एक केंद्रित एच 2 एसओ4/एच 2 ओ2समाधान के साथ हाइड्रोफिलाइजिंग करें। एक अल्ट्रामाइक्रोटोम का उपयोग करके हाइड्रोफिलाइज्ड सिलिकॉन वेफर्स पर 70 एनएम की मोटाई के साथ क्रमिक स्लाइस स्ट्रिप्स एकत्र करें, और उन्हें 10 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस ओवन में सुखाएं।
    नोट: धीरे-धीरे स्लाइस को कैप्चर करें क्योंकि स्लाइस हानि या विरूपण को रोकने के लिए स्लाइस वेफर्स की सतह पर तैरता है।

2. छवि अधिग्रहण और त्रि-आयामी पुनर्निर्माण

  1. मंच पर सिलिकॉन वेफर लगाने से पहले, अनुभागों को आसुत जल से तीन बार धोएं, और उन्हें हवा से सुखाएं। 1 सेमी x 0.5 सेमी के आकार के साथ एक प्रवाहकीय कार्बन टेप काटें, और नमूना सेटअप (चित्रा 2 ई) को पूरा करने के लिए सिलिकॉन वेफर और एसईएम नमूना चरण के बीच इसे चिपकाएं।
  2. एफई-एसईएम त्वरण वोल्टेज पैरामीटर को 4 मिमी (चित्रा 3 बी और तालिका 1) की कामकाजी दूरी के साथ 2 केवी पर सेट करें।
    नोट: सिग्नल-टू-शोर अनुपात में सुधार करने और छवि में शोर को कम करने के लिए, जब भी संभव हो कम आवर्धन पर निरीक्षण करें। जैसे-जैसे एकाधिक बढ़ता है, एसईएम की स्कैनिंग रेंज कम हो जाती है, जिससे छवियों पर चार्ज संचय में वृद्धि होती है।
  3. शीर्ष मेनू बार में एच / एल आइकन पर क्लिक करें। सबसे पहले, कम आवर्धन पर, लक्ष्य स्लाइस स्ट्रिप्स के पहले खंड को उन्मुख करें, और फिर उच्च-आवर्धन मोड पर स्विच करने के लिए एच / एल विकल्प (चित्रा 3 ए) पर फिर से क्लिक करें; छवि चमक, कंट्रास्ट और आवर्धन को समायोजित करके रुचि की संरचना के लिए एक उपयुक्त छवि एकत्र करें।
  4. प्रोजेक्ट व्यू > ओपन डेटा का चयन करें, और सॉफ़्टवेयर में विश्लेषण की जाने वाली छवि फ़ाइलों को आयात करें।
  5. संरेखित स्लाइस > संपादित करें (चित्रा 4 बी) पर क्लिक करके चित्रों को संरेखित करें, और छवि पारदर्शिता को संशोधित करके निचले-बाएं मेनू बार में तीव्रता सीमा मान समायोजित करें। यहां, एक अर्ध-स्वचालित संरेखण रणनीति का उपयोग करें; विशेष रूप से, स्वचालित संरेखण के माध्यम से, चित्रों को पिछले चित्र के साथ ओवरलैप करें, और फिर मैन्युअल फाइन-ट्यूनिंग करें।
    नोट: इस काम में, संरेखण की प्रक्रिया के दौरान, पिछली छवि का उपयोग संदर्भ के रूप में किया गया था, और दो छवियों की लक्ष्य संरचना को अधिकतम रूप से ओवरलैप करने के लिए चाल और घूर्णन संचालन का उपयोग किया गया था। संरेखित वर्तमान स्लाइस जोड़ी पर क्लिक करने से छवियों को स्वचालित रूप से संरेखित करने में मदद मिल सकती है, लेकिन गलत प्लेसमेंट हो सकता है।
  6. एक्सट्रैक्ट सबवॉल्यूम मॉड्यूल का चयन करें, और पूरे स्टैक के अतिव्यापी भाग के आकार को फिट करने के लिए संरेखित डेटा सेट को क्लिप करें।
  7. विभाजन उपधारा (चित्रा 4C) के अंतर्गत, सहेजें > पुन: नमूना > विभाजन का चयन करें. सही सीमा का चयन करने के लिए मैजिक वैंड की दहलीज और ब्रश टूल का आकार चुनें। यहां फिर से, एक उपयुक्त बड़े क्षेत्र का स्वचालित रूप से चयन करने के लिए पहले मैजिक वैंड का उपयोग करके एक अर्ध-स्वचालित विभाजन विधि अपनाएं, और फिर विवरणों का सटीक वर्णन करने के लिए ब्रश का उपयोग करें।
    नोट: मैजिक वैंड को मास्किंग मान को बदलकर और ड्रॉ लिमिट लाइन का उपयोग करके रुचि की संरचना और आसपास की संरचनाओं के बीच मौजूद पिक्सेल तीव्रता में स्पष्ट अंतर के आधार पर सेगमेंट छवियों पर लागू किया जा सकता है। यह छवि अधिग्रहण के दौरान उत्पन्न चार्जिंग कलाकृतियों को अलग करने में असमर्थ है। इसलिए, इसके परिणामस्वरूप लक्षित क्षेत्रों के लिए गलत विभाजन हो सकता है। ब्रश टूल का उपयोग जैविक संरचनाओं को सही ढंग से पुनर्निर्माण करने के लिए मैन्युअल रूप से विभाजित करने के लिए किया जा सकता है।
  8. विभाजन > चयन के अंतर्गत, चयनित क्षेत्र (चित्रा 4 सी) जोड़ने के लिए + आइकन पर क्लिक करें।
  9. विभिन्न छवियों में एक ही लक्ष्य संरचना का चयन करने के लिए उपरोक्त चरण (2.8) को दोहराएं जब तक कि रुचि के माइक्रोस्ट्रक्चर के पुनर्निर्माण के लिए चयन पूरा न हो जाए।
    नोट: माइटोकॉन्ड्रियल रीमॉडेलिंग प्रक्रियाओं के दौरान, लक्ष्य वस्तु का चयन अनुक्रमिक छवियों के समूह के बीच में चित्र से किया जाना चाहिए। यदि आवश्यक क्षेत्र को पहले या अंतिम चित्र से चुना गया है, तो पुनर्निर्माण परिणाम एक पूर्ण 3 डी विज़ुअलाइज़ेशन प्रस्तुत करने में सक्षम नहीं होगा।
  10. क्षेत्रीय विभाजन को पूरा करने के बाद, ऑब्जेक्ट के आकार और चित्र रिज़ॉल्यूशन के लिए सर्वोत्तम परिणामों के अनुसार छवि फ़ाइल उत्पन्न करें। फसल संपादक पर क्लिक करें, और उसके बाद वर्चुअल स्लाइडर बॉक्स (चित्रा 4 सी) में संख्या 6 दर्ज करें।
  11. बाईं ओर ड्रॉप-डाउन मेनू में, प्रोजेक्ट उपधारा के तहत ग्रे क्षेत्र पर राइट-क्लिक करें, और सरफेस जेनरेट करें > बनाएं > लागू करें का चयन करें। जेनरेट की गई फ़ाइल में, सतह संरचना और 3D प्रतिनिधित्व बनाने के लिए Surface View मॉड्यूल का उपयोग करें।

3. परिमाणीकरण

  1. लागू करने के > छोटे धब्बे हटाएं पर क्लिक करें (चित्रा 4 डी)। प्रोजेक्ट उपधारा के तहत, ग्रे क्षेत्र पर राइट-क्लिक करें, और लेबल विश्लेषण > लागू करें (चित्रा 4 डी) का चयन करें।
  2. स्तंभ का नाम अनुकूलित करें, और एक माप समूह चुनें. मूल माप बॉक्स से वॉल्यूम 3 d और लंबाई 3 d का चयन करें।
  3. स्क्रीन के निचले-बाएं कोने में लागू करें बटन पर क्लिक करें। डेटा की प्रतिलिपि बनाएँ, और सांख्यिकीय सॉफ़्टवेयर, जैसे ग्राफ़पैड में ग्राफ़ करें।

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Representative Results

सेल कल्चर (चित्रा 1 ए) के दौरान, हमने पहले अग्नाशय ी कैंसर कोशिकाओं को पूर्ण संस्कृति माध्यम, एक (1 एस, 3 आर) -आरएसएल 348 (आरएसएल 3, एक फेरोप्टोसिस एक्टिवेटर, 100 एनएम) समूह और एक आरएसएल 3 (100 एनएम) प्लस फेरोस्टैटिन -149 (फेर -1, एक फेरोप्टोसिस अवरोधक, 100 एनएम) समूह के साथ सुसंस्कृत नियंत्रण समूह में विभाजित किया। उपरोक्त प्रयोगात्मक चरणों के माध्यम से, स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप ने नियंत्रण समूह, आरएसएल 3 समूह और अवरोधक समूह (आरएसएल 3 + फेर -1 समूह) के लिए क्रमशः 38 (पूरक चित्र 1), 43 (पूरक चित्रा 2), और 44 (पूरक चित्र 3) अनुक्रमिक छवियों का अधिग्रहण किया। 1,280 x 960 पिक्सल की तस्वीरों को 8,000 गुना आवर्धन (12.40 एनएम / पिक्सेल के रिज़ॉल्यूशन के साथ) पर कैप्चर किया गया था। सेल क्षेत्र में झुर्री और प्रदूषण दोनों वर्गों के ऊपर नहीं देखे गए थे। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप चित्र कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रिया और एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम जैसे जीवों को स्पष्ट रूप से अलग कर सकते हैं (चित्रा 1 ई)।

एफई-एसईएम द्वारा 2 डी छवियों के अवलोकन से पता चला है कि, कैंसर कोशिकाओं के नियंत्रण समूह (चित्रा 5 ए) में, माइटोकॉन्ड्रिया पूरे साइटोप्लाज्म में वितरित किए गए थे, और उनमें से अधिकांश गोलाकार या अंडाकार और समान रूप से मोटा थे। इसके अतिरिक्त, अपेक्षाकृत नियमित, लम्बी क्रिस्टी वास्तुकला स्पष्ट रूप से दिखाई दे रही थी। इसके विपरीत, आरएसएल 3 समूह (चित्रा 5 डी) में, माइटोकॉन्ड्रिया के बहुमत ने एक सिकुड़ती आकृति विज्ञान, झिल्ली घनत्व में वृद्धि और तुलनात्मक रूप से अस्पष्ट क्रिस्टे संरचना का प्रदर्शन किया। एसईएम चित्रों (चित्रा 5 ई) के करीबी निरीक्षण से पता चला कि सभी माइटोकॉन्ड्रियल क्रिस्टे विघटित या गायब नहीं हुए, क्योंकि क्रिस्टे की अपेक्षाकृत कम संख्या बरकरार रही। आरएसएल 3 समूह की तुलना में, अवरोधक समूह में, अधिकांश माइटोकॉन्ड्रिया ने माइटोकॉन्ड्रियल क्रिस्टे की अभिन्न संरचना को बनाए रखा, और माइटोकॉन्ड्रियल क्रिस्टे संरचनाओं का केवल एक अल्पसंख्यक स्पष्ट नहीं था (चित्रा 5 जी)।

जबकि 2 डी जानकारी माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान में अंतर दिखाती है, यह कभी-कभी विस्तृत और वास्तविक 3 डी संरचना50,51 की पक्षपाती समझ में परिणाम कर सकती है। 3 डी स्थिति (चित्रा 5 सी) के तहत नियंत्रण समूह की क्रिस्टे संरचनाएं 2 डी छवियों के अनुरूप थीं, लेकिन वे आरएसएल 3 समूह के लिए अलग थीं। इस समूह के लिए, पूर्ण माइटोकॉन्ड्रियल क्रिस्टे की उपस्थिति 2 डी छवियों (चित्रा 5 ई) में भी देखी जा सकती है, लेकिन 3 डी (चित्रा 5 एफ) के तहत माइटोकॉन्ड्रिया अनियमित थे और आम तौर पर बीच में खाली हो जाते थे। अवरोधक समूह (चित्रा 5 आई) ने विविध क्रिस्टे आकार दिखाए, जिसमें केवल कुछ माइटोकॉन्ड्रियल क्रिस्टे स्थानीयकृत पतन का प्रदर्शन करते हैं। इस प्रकार, आरएसएल 3 समूह के परिणामों से, यह देखा जा सकता है कि केवल 2 डी विश्लेषण का उपयोग करने से परिणामों की एकतरफा समझ हो सकती है। 3 डी डिस्प्ले के लिए छवियों के एक सेट को स्टैक करते समय प्रस्तुत परिणामों की तुलना में 2 डी छवियों के परिणाम पक्षपाती हैं, इसलिए केवल 2 डी जानकारी के माध्यम से उत्पादित परिणामों को सामान्य ीकृत करना संभव नहीं है। माइटोकॉन्ड्रिया पर आरएसएल 3 के प्रभावों को अधिक निष्पक्ष रूप से प्रदर्शित करने के लिए,माइटोकॉन्ड्रियल परिवर्तनों को मापने और मापने के लिए 3 डी पुनर्निर्माण डेटा का उपयोग किया गया था। नियंत्रण समूह की तुलना में, आरएसएल 3 समूह में 3 डी माइटोकॉन्ड्रिया की लंबाई और मात्रा में काफी कमी आई थी, लेकिन अवरोधक समूह के परिमाणीकरण परिणाम अन्य दो समूहों (चित्रा 5 जे, के) के परिणामों के बीच गिर गए। इन मात्रात्मक आंकड़ों से पता चलता है कि आरएसएल 3 छोटे और अवक्रमित माइटोकॉन्ड्रिया का उत्पादन करता है, और अवरोधकों के अलावा इस प्रभाव को कम करता है।

जैसा कि चित्रा 6 बी और चित्रा 6 सी में दिखाया गया है, यह निर्धारित किया गया था कि फेरोप्टोसिस इंड्यूसर आरएसएल 3 ने माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन का कारण बना और माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान 53,54 को बदलकर और फेरोप्टोसिस को प्राप्त करके सेलुलर चयापचय को प्रभावित किया, जो आरएसएल 355 द्वारा प्रेरित कैंसर थेरेपी में गतिशील कोशिका मृत्यु के सर्वव्यापी रूप का प्रतिनिधित्व कर सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: अग्नाशय ी कैंसर सेल माइटोकॉन्ड्रिया के 3 डी पुनर्निर्माण के लिए सामान्य वर्कफ़्लो। इस प्रोटोकॉल में वर्णित 3 डी पुनर्निर्माण प्रयोगों के लिए एक सामान्य वर्कफ़्लो प्रदर्शित किया गया है। (ए) अग्नाशय के कैंसर कोशिकाओं की संस्कृति। (बी) राल ब्लॉक की तैयारी। (सी) अल्ट्रामाइक्रोटोम का उपयोग करके सीरियल वर्गों का संग्रह। (डी) एक क्षेत्र उत्सर्जन स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके 2 डी छवियों का अधिग्रहण। (ई) अनुक्रमिक एसईएम छवियों में लक्षित माइटोकॉन्ड्रिया की स्थिति। (एफ) 3 डी में माइटोकॉन्ड्रिया का विश्लेषण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: एक हाइड्रोफिलाइज्ड सिलिकॉन वेफर पर निरंतर स्लाइस के स्लाइस स्ट्रिप्स के लिए एक उपकरण। (ए) वेफर को पकड़ने के लिए बल के साथ एक समायोज्य कोण मैनिपुलेटर। (बी) अल्ट्रामाइक्रोटोम के बगल में रखे गए वेफर धारक का फ्रेम। (सी) हीरे के चाकू वाले नीले स्लॉट में सिलिकॉन वेफर की स्थिति। (डी) सिलिकॉन वेफर और डायमंड नाइफ ब्लेड के बीच स्थितिगत संबंध को दिखाने वाला एक क्लोज-अप। (ई) प्रवाहकीय कार्बन गोंद के साथ एसईएम के नमूना चरण से जुड़ी स्लाइस स्ट्रिप्स के साथ एक सिलिकॉन वेफर। (एफ) सीरियल स्लाइस स्ट्रिप्स के सामान्य अवलोकन को दिखाने वाला एक क्लोज-अप। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: पैरामीटर सेट करने और छवियों को प्राप्त करने की प्रक्रिया। (ए) एफई-एसईएम का मेनू बार (तीर एच / एल विकल्प को इंगित करता है)। (बी) इमेजिंग मापदंडों और शर्तों की तालिका। (सी) तीन समूहों में लगातार 2 डी छवियों का अवलोकन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: अमीरा का उपयोग करके 3 डी में माइटोकॉन्ड्रिया की कल्पना करने के लिए एक चरण-दर-चरण मार्गदर्शिका। (ए) एक विशिष्ट फ़ोल्डर से छवियों को आयात करना। (बी) लक्ष्य संरचना के अनुसार छवि ढेर को संरेखित करना। (सी) रुचि के क्षेत्र को विभाजित करना और जोड़ना। (डी) 3 डी संरचना का पुनर्निर्माण और परिमाणन डेटा जोड़ना। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: प्रत्येक समूह में माइटोकॉन्ड्रिया की 2 डी और 3 डी आकृति विज्ञान। (ए) 8,000 गुना आवर्धन और (बी) 15,000 गुना आवर्धन पर नियंत्रण समूह की 2 डी कैंसर कोशिका आकृति विज्ञान। (सी) नियंत्रण समूह के माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान का एक 3 डी प्रतिनिधित्व। आरएसएल 3 समूह की 2 डी कैंसर कोशिका आकृति विज्ञान (डी) 8,000 गुना आवर्धन और (ई) 15,000 गुना आवर्धन। (एफ) आरएसएल 3 समूह के माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान का एक 3 डी प्रतिनिधित्व। आरएसएल 3 + फेर -1 (अवरोधक) समूह की 2 डी कैंसर कोशिका आकृति विज्ञान (जी) 8,000 गुना आवर्धन और (एच) 15,000 गुना आवर्धन। (I) आरएसएल 3 + फेर -1 (अवरोधक) समूह के माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान का एक 3 डी प्रतिनिधित्व। प्रत्येक समूह में माइटोकॉन्ड्रिया की (जे) लंबाई और (के) औसत मात्रा के लिए मात्रात्मक डेटा। तारांकन के साथ महत्वपूर्ण अंतर इंगित किए जाते हैं और छात्र के टी-टेस्ट (बनाम नियंत्रण समूह, * पी≤ 0.05, ** पी≤ 0.01, *** पी≤ 0.001) का उपयोग करके गणना की गई थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: 2 डी और 3 डी स्तरों पर कैंसर कोशिकाओं के माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान में अंतर। (ए) आरएसएल 3 समूह की 2 डी कैंसर सेल आकृति विज्ञान 8,000 गुना आवर्धन पर। (बी) उच्च आवर्धन पर 2 डी माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान। (सी) विशिष्ट माइटोकॉन्ड्रिया का एक 3 डी प्रतिनिधित्व। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

इमेजिंग पैरामीटर शर्तों
DataSize 1280 × 960
PixelSize 12.40234
तेजी से वोल्टेज 2000 वोल्ट
कार्य दूरी 3700μm
उत्सर्जन धारा 13700 nA
बीम करंट 10μA
वर्तमान सीमित एपर्चर एफई-एसईएम के नंबर 2 झंझरी
समय पर ध्यान दें 32 μs/px
कक्षों की संख्या 107
चित्रित वॉल्यूम। 10×8×2.66μm, 212.8μm3
10×8×3.01μm, 240.8μm3
10×8×3.08μm, 246.4μm3

तालिका 1: छवि अधिग्रहण के लिए रिकॉर्डिंग स्थितियों और डेटासेट मापदंडों का सारांश।

पूरक चित्र 1: नियंत्रण समूह से 38 कैंसर सेल माइक्रोसेक्शन की छवियों का अवलोकन। प्रत्येक माइक्रोसेक्शन की छवि संख्या को ऊपर से नीचे तक व्यवस्थित किया जाता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 2: आरएसएल 3 समूह से 43 कैंसर सेल माइक्रोसेक्शन की छवियों का अवलोकन। प्रत्येक माइक्रोसेक्शन की छवि संख्या को ऊपर से नीचे तक व्यवस्थित किया जाता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्र 3:आरएसएल 3 + फेर -1 (अवरोधक) समूह से 44 कैंसर सेल माइक्रोसेक्शन की छवियों का ओ वर्व्यू। प्रत्येक माइक्रोसेक्शन की छवि संख्या को ऊपर से नीचे तक व्यवस्थित किया जाता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यहां प्रस्तुत विधि 3 डी पुनर्निर्माण तकनीक को लागू करने के लिए एक उपयोगी चरण-दर-चरण मार्गदर्शिका है, जिसमें सीरियल अल्ट्राथिन वर्गों से उत्पन्न 2 डी टोमोग्राफिक छवियों के स्टैकिंग और विभाजन के लिए इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और छवि प्रसंस्करण तकनीक को लागू करना शामिल है। यह प्रोटोकॉल 2 डी छवियों की एक सीमा पर प्रकाश डालता है जिसे ऑर्गेनेल अल्ट्रास्ट्रक्चर के 3 डी विज़ुअलाइज़ेशन द्वारा संबोधित किया जा सकता है, जिसमें उच्च-रिज़ॉल्यूशन स्तर और उच्च सटीकता पर संरचनाओं की मजबूत प्रजनन क्षमता के फायदे हैं। इससे भी महत्वपूर्ण बात, इस 3 डी विज़ुअलाइज़ेशन को ट्यूमर कोशिकाओं पर लागू किया जा सकता है ताकि पैथोलॉजिकल तंत्र के अध्ययन को अधिक सरल और विश्वसनीय बनाया जा सके। इस तकनीक की जांच इस काम में माइटोकॉन्ड्रियल क्रिस्टे की स्टीरियोस्कोपिक संरचनाओं को देखने के लिए विभिन्न परिस्थितियों में सीरियल वर्गों के तीन सेटों की तुलना करके की गई थी, जिससेकैंसर कोशिकाओं में होने वाले आरएसएल 3-प्रेरित माइटोकॉन्ड्रियल क्रिस्टे झिल्ली क्षरण को मान्य किया जा सके। ये परिणाम एक एंटी-अग्नाशय ी कैंसर दवा के रूप में आरएसएल 3 की कार्रवाई के तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं।

उच्च-रिज़ॉल्यूशन 2 डी छवियों का अधिग्रहण माइटोकॉन्ड्रियल क्रिस्टे के 3 डी पुनर्निर्माण57 की प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, और छवि की गुणवत्ता सीधे पुनर्निर्माण परिणामों 22,58 को प्रभावित करती है। इसलिए, इस विधि में कुछ सीमाएं भी हैं, जैसे कि एसईएम छवियों59 में उत्पन्न चार्जिंग कलाकृतियां, जो बदले में, लक्ष्य संरचनाओं के गलत विभाजन का कारण बन सकती हैं। इस समस्या को स्लाइस स्कैनिंग समय को छोटा करके, एसईएम को फोकल चार्ज प्रतिपूरक34,60 से लैस करके और ओटीओ विधि का उपयोग करके हल किया जा सकता है, जिसके लिए टीसीएच का उपयोग अतिरिक्त धातुओं 61 के साथ धुंधला करके नमूने को इलेक्ट्रॉनों के लिए अधिक प्रवाहकीय बना सकता है। स्वचालित छवि विभाजन पर भरोसा करना संरचना के दायरे को निर्धारित करने के संदर्भ में गलत होता है, जबकि मैनुअल विभाजन समय लेने वाला58 है। इसलिए, छवि संग्रह62 का एहसास करने के लिए एसईएम के तेजी से स्कैनिंग लाभ के आधार पर, अमीरा सॉफ्टवेयर में अर्ध-स्वचालित विभाजन का उपयोग कुशल इमेजिंग और पुनर्निर्माण को सक्षम करने के लिए किया जा सकता है; अमीरा सॉफ्टवेयर का उपयोग फिजी और एमआईबी63 का उपयोग करने की तुलना में परिणाम को अधिक सटीक और सटीक बना सकता है। 3 डी इमेजिंग में महत्वपूर्ण कदम अल्ट्राथिन वर्गों को प्राप्त करना है। चूक, फ्रैक्चर और विरूपण जैसे मुद्दे, जो छवि निरंतरता को प्रभावित करते हैं, अक्सर अनुभाग संग्रह के दौरान होते हैं। स्लाइस के नुकसान और टूटने जैसी समस्याओं को हल करने के लिए, हमने स्लाइस स्ट्रिप्स के संग्रह के लिए समर्थन के रूप में हाइड्रोफिलाइज्ड सिलिकॉन वेफर्स का उपयोग किया।

यद्यपि एसबीएफ-एसईएम और एफआईबी-एसईएम अनुभागों में विकृति या दोषों को कम कर सकते हैं, इन तकनीकों में धीमी इमेजिंग गति होती है, महंगे उपकरणों की आवश्यकता होती है, और64,65,66 की संरचना को फिर से तैयार करने में असमर्थ होते हैं। एफआईबी-एसईएम में इमेजिंग के दौरान सिस्टम स्थिरता का अभाव होता है, जबकि एसबीएफ-एसईएम जटिल नमूना तैयारी चरणों और एक थकाऊ वर्कफ़्लो34 से बाधित होता है। हाल ही में, माइटोकॉन्ड्रियल संरचना के अध्ययन के लिए उत्तेजित उत्सर्जन रिक्तीकरण (एसटीईडी) माइक्रोस्कोपिक इमेजिंग को धीरे-धीरे लागू किया गया है। यह विधि माइटोकॉन्ड्रियल लेबलिंग67 के लिए जांच के निर्माण के माध्यम से जीवित कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल क्रिस्टे की 3 डी वास्तविक समय छवियों की निगरानी करती है। फ्लोरोसेंट डाई लेबलिंग माइटोकॉन्ड्रियल संलयन और विखंडन68 के दौरान क्रिस्टे में परिवर्तन प्रक्रियाओं को प्रकट कर सकती है। हालांकि, जीवित कोशिकाओं में तीव्र प्रकाश के लिए सीमित सहिष्णुता होती है, इसलिए दीर्घकालिक एसटीईडी इमेजिंग68 में इस तकनीक का उपयोग करना मुश्किल है। इसके अलावा, एसटीईडी अपने रिज़ॉल्यूशन, इमेजिंग गहराई और पिक्सेल नंबर69 द्वारा प्रतिबंधित है।

अन्य तकनीकों की तुलना में, एक विस्तृत क्षेत्र से ऑर्गेनेल अल्ट्रास्ट्रक्चर का निरीक्षण करने के लिए 3 डी पुनर्निर्माण तकनीक के साथ संयुक्त निरंतर अल्ट्राथिन वर्गों का उपयोग न केवल कम समय में उच्च-थ्रूपुट इमेजिंग की अनुमति देता है, बल्कि असतत समयपर लक्ष्य संरचनाओं की उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियों की परीक्षा को भी सक्षम बनाता है।, जिससे इमेजिंग दर और पुनर्निर्माण लचीलेपन में सुधार होता है। इसके अलावा, ऑर्गेनेल रूपात्मक परिवर्तन और अन्य ऑर्गेनेल के साथ स्थानिक कनेक्शन की आगे जांच की जा सकती है। इन पहलुओं को परिमाणित किया जा सकता है, और परिवर्तन के तंत्र को उनके स्थितिगत संबंधोंको प्रदर्शित करने के लिए आसन्न ऑर्गेनेल का पुनर्निर्माण करके अधिक सटीक रूप से प्रकट किया जा सकता है। अमीरा 58 का उपयोग करके 3 डी पुनर्निर्माण और सीरियल-सेक्शन इमेजिंग की यह तकनीक नैनोस्केल72 पर बीमारियों और ऑर्गेनेल अल्ट्रास्ट्रक्चरल परिवर्तनों के बीच सहसंबंध का खुलासा करती है, जिसका व्यापक रूप से चिकित्सा, जीव विज्ञान और अन्य क्षेत्रों में उपयोग किया जाता है, और प्रभावी नए चिकित्सीय73,74 के विकास का मार्ग प्रशस्त करता है।

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Disclosures

लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

इस शोध को झेजियांग प्रांत अनुदान (Z23H290001, LY19H280001) के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था; चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन अनुदान (82274364, 81673607, और 81774011); साथ ही हुज़ौ विज्ञान और प्रौद्योगिकी अनुदान की लोक कल्याण अनुसंधान परियोजना (2021 GY49, 2018GZ24)। हम मेडिकल रिसर्च सेंटर, एकेडमी ऑफ चाइनीज मेडिकल साइंस, झेजियांग चीनी मेडिकल यूनिवर्सिटी के सार्वजनिक मंच से महान सहायता, तकनीकी सहायता और प्रयोगात्मक समर्थन की सराहना करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(1S,3R)-RSL3 MCE HY-100218A
Acetone SIGMA 179124
Amira Visage Imaging 2020.2
Aspartic acid MCE HY-42068
Dulbecco's modified Eagle’s medium Gibco 11995115
Ethanol Merck 100983
Ferrostatin-1 MCE HY-100579
Fetal bovine serum Gibco 10437010
Field emission scanning electron microscope HITACHI SU8010
Glutaraldehyde Alfa Aesar A10500.22
Lead nitrate SANTA CRUZ sc-211724
Osmium Tetroxide SANTA CRUZ sc-206008B
Panc02 European Collection of Authenticated Cell Cultures  98102213
Penicillin-streptomycin Biosharp BL505A
Phosphate Buffered Saline Biosharp BL302A
Pon 812 Epoxy resin SPI CHEM GS02660
Potassium ferrocyanide Macklin P816416
Thiocarbohydrazide Merck 223220
Ultramicrotome LEICA EMUC7
Uranyl Acetate RHAWN R032929

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कैंसर अनुसंधान अंक 196 अग्नाशय ी कैंसर सेल माइटोकॉन्ड्रिया अल्ट्रास्ट्रक्चर 3 डी पुनर्निर्माण स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम) ओटीओ नमूना तैयारी।
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Qi, Y., Liu, Y., Huang, Y., Xiong, M., You, S., Wang, B., Gu, M. A Three-Dimensional Technique for the Visualization of Mitochondrial Ultrastructural Changes in Pancreatic Cancer Cells. J. Vis. Exp. (196), e65290, doi:10.3791/65290 (2023).

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