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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Una tecnica tridimensionale per la visualizzazione dei cambiamenti ultrastrutturali mitocondriali nelle cellule tumorali pancreatiche

Published: June 23, 2023 doi: 10.3791/65290
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1, 2, 3, 1,3
1School of Pharmaceutical Science of Zhejiang Chinese Medical University, 2Department of Pharmacy, Zhejiang Provincial Dermatology Hospital, 3Academy of Chinese Medical Sciences of Zhejiang Chinese Medical University
* These authors contributed equally

Summary

Questo protocollo descrive come ricostruire le creste mitocondriali per ottenere immagini 3D con elevata precisione, alta risoluzione e throughput elevato.

Abstract

Comprendere le caratteristiche dinamiche dell'ultrastruttura dell'organello cellulare, che non è solo ricca di informazioni sconosciute ma anche sofisticata da una prospettiva tridimensionale (3D), è fondamentale per gli studi meccanicistici. La microscopia elettronica (EM) offre una buona profondità di imaging e consente la ricostruzione di pile di immagini ad alta risoluzione per studiare la morfologia ultrastrutturale degli organelli cellulari anche su scala nanometrica; pertanto, la ricostruzione 3D sta acquisendo importanza grazie ai suoi incomparabili vantaggi. La microscopia elettronica a scansione (SEM) fornisce una tecnologia di acquisizione delle immagini ad alta produttività che consente di ricostruire grandi strutture in 3D dalla stessa regione di interesse in sezioni consecutive. Pertanto, l'applicazione del SEM nella ricostruzione 3D su larga scala per ripristinare la vera ultrastruttura 3D degli organelli sta diventando sempre più comune. In questo protocollo, suggeriamo una combinazione di sezione ultrasottile seriale e tecniche di ricostruzione 3D per studiare le criste mitocondriali nelle cellule tumorali pancreatiche. I dettagli di come vengono eseguite queste tecniche sono descritti in questo protocollo in modo dettagliato, incluso il metodo osmio-tiocarboidrazide-osmio (OTO), l'imaging seriale a sezione ultrasottile e il display di visualizzazione.

Introduction

I mitocondri sono uno degli organelli più importanti della cellula. Servono come hub centrale della bioenergetica cellulare e del metabolismo 1,2 e svolgono un ruolo critico nel cancro3. Il cancro del pancreas (PC) è uno dei tumori più difficilida trattare 4 a causa della sua rapida diffusione e dell'alto tasso di mortalità. La disfunzione mitocondriale, causata principalmente da cambiamenti nella morfologia mitocondriale 3,5,6,7, è stata collegata ai meccanismi patologici alla base del PC8. I mitocondri sono anche altamente dinamici, il che si riflette nei frequenti e dinamici cambiamenti nella loro connettività di rete e nella struttura della crisi9. Il rimodellamento della struttura delle cristae può avere un impatto diretto sulla funzione mitocondriale e sullo stato cellulare 10,11, che sono significativamente alterati durante la crescita delle cellule tumorali, le metastasi e i cambiamenti del microambiente tumorale 12,13.

Negli ultimi anni, gli scienziati hanno studiato questo organello utilizzando l'osservazione EM14,15,16,17; ad esempio, i ricercatori hanno analizzato le dinamiche mitocondriali utilizzando tecniche di ricostruzione 3D 6,7,18,19. Il concetto generale e il metodo per la ricostruzione 3D delle immagini di microscopia elettronica sono stati formalmente stabiliti già nel 196820 e prevedevano la combinazione di microscopia elettronica, diffrazione elettronica e elaborazione di immagini al computer per ricostruire la coda del fago T4. Fino ad ora, la tecnologia di imaging 3D al microscopio elettronico ha fatto progressi significativi in termini di risoluzione dell'immagine21, grado di automazione 22 e volume di elaborazione 23 ed è stata utilizzata su scala sempre più ampia nella ricerca biologica, dal livello del tessuto al livello dell'ultrastruttura dell'organello alla scala nanometrica24. Negli ultimi anni, l'imaging 3D al microscopio elettronico è diventato anche una tecnologia promettente per una vasta gamma di applicazioni25,26,27.

La crescente attenzione alle creste mitocondriali illustra in particolare i requisiti essenziali per l'imaging del volume ultrastrutturale. La microscopia elettronica a trasmissione (TEM) è stata utilizzata per visualizzare campioni raccolti su una griglia di rame (400 mesh)28, con il fascio di elettroni che passa attraverso la sezione. Tuttavia, a causa della portata limitata della griglia di rame, è impossibile visualizzare completamente le fette continue dello stesso campione29. Ciò complica lo studio delle strutture target durante l'imaging TEM. Inoltre, TEM si basa su attività manuali dispendiose in termini di tempo e soggette a errori, tra cui il taglio e la raccolta di più sezioni e l'imaging sequenziale21, quindi non è adatto per ricostruzioni ultrastrutturali di campioni di grandi volumi23. Attualmente, la ricostruzione ad alta risoluzione dell'imaging di campioni di grandi volumi è ottenuta attraverso l'uso di apparecchiature specializzate, come il TEM camera array (TEMCA)30 o due sistemi TEMCA di seconda generazione (TEMCA2)31, che consentono l'imaging automatizzato ad alta produttività in breve tempo. Tuttavia, questo tipo di imaging non ha il vantaggio di essere facile da ottenere e universale a causa della necessità di apparecchiature personalizzate.

Rispetto al TEM, il metodo per generare automaticamente migliaia di immagini volumetriche seriali per grandi aree basato su SEM 32,33 migliora l'efficienza e l'affidabilità dell'imaging seriale e offre risoluzioni z più elevate34. Ad esempio, la microscopia elettronica a scansione seriale a scansione a faccia bloccata (SBF-SEM) e la microscopia elettronica a scansione a fascio ionico focalizzato (FIB-SEM) hanno entrambi permesso di ottenere la ricostruzione 3D di ultrastrutture con alta velocità, efficienza e risoluzione35,36. Tuttavia, è inevitabile che la superficie del blocco venga rasata meccanicamente dal coltello diamantato dell'SBF-SEM o mediante fresatura con il fascio ionico focalizzato di FIB-SEM33,37. A causa della distruttività dei due metodi per i campioni, non è possibile ricostruire nuovamente la stessa struttura target per ulteriori analisi38,39,40. Inoltre, pochi studi hanno tentato di ricostruire l'ultrastruttura dell'organello 3D delle cellule tumorali utilizzando EM per osservare i cambiamenti patologici12. Per questi motivi, al fine di chiarire ulteriormente i meccanismi patologici delle cellule tumorali, come le cellule tumorali pancreatiche, proponiamo una nuova tecnologia per la ricostruzione 3D di immagini in sezione seriale utilizzando un ultramicrotomo e un microscopio elettronico a scansione ad emissione di campo (FE-SEM) per analizzare l'ultrastruttura mitocondriale a livello di cristae; Con questa tecnologia, i dati ad alta risoluzione possono essere acquisiti utilizzando un metodo efficiente e accessibile. Le sezioni ultrasottili seriali realizzate con un ultramicrotomo possono essere memorizzate in modo semi-permanente in una custodia a griglia e rivisualizzate più volte, anche dopo diversi anni41. FE-SEM è molto apprezzato come strumento in vari campi di ricerca grazie alla sua capacità di fornire immagini ad alta risoluzione, alto ingrandimento e versatilità42. Nel tentativo di visualizzare la struttura fine degli organelli in 3D, la tecnica per la produzione di pile di immagini seriali 2D con risoluzione utile utilizzando elettroni retrodiffusi prodotti da FE-SEM 43,44 può anche essere utilizzata per ottenere immagini ad alta produttività e multiscala di regioni target o delle loro strutture associate senza attrezzature speciali 45. La generazione di artefatti di carica influisce direttamente sulla qualità delle immagini acquisite, quindi è particolarmente importante mantenere breve il tempo di permanenza.

Pertanto, il presente studio elabora le procedure sperimentali impiegate in questa tecnica SEM per ricostruire la struttura 3D delle creste mitocondriali46. In particolare, mostriamo il processo sviluppato per ottenere la segmentazione semi-automatica delle regioni mitocondriali e digitalizzare la ricostruzione 3D utilizzando il software Amira, che prevede anche la realizzazione di campioni di fette utilizzando il metodo convenzionale di preparazione dei campioni OTO44,47, il completamento della raccolta di sezioni utilizzando il taglio ultramicrotomo e l'acquisizione di dati 2D sequenziali tramite FE-SEM.

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Protocol

1. Preparazione del materiale

  1. Coltura 2 x 106 cellule Panc02 in 12 ml di terreno DMEM (10% siero fetale bovino e 100 U/mL di penicillina-streptomicina), e mantenere a 37 °C e 95% di umidità in un'atmosfera di 5% di anidride carbonica e 95% di aria per 48 ore.
  2. Raccogliere le cellule Panc02, centrifugare a 28 x g per 2 minuti, quindi eliminare il surnatante. Assicurarsi che il campione sia di dimensioni adeguate (1 x 107 celle), altrimenti i seguenti passaggi di fissazione e disidratazione non funzioneranno bene.
  3. Aggiungere 1 mL di glutaraldeide al 2,5% come fissativo per fissare le cellule fresche di Panc02 nelle provette di microcentrifuga da 1,5 mL durante la notte a 4 °C.
    NOTA: I campioni devono essere centrifugati a 1.006 x g per 5 minuti in ciascuna delle seguenti fasi (fasi 1.3-1.11).
  4. Aspirare il fissativo e sciacquare i campioni due volte con soluzione salina tamponata fosfato 0,1 M (PBS), quindi risciacquare due volte con acqua bidistillata (ddH2O) a temperatura ambiente per 10 minuti ciascuno.
  5. Aggiungere 50 μL di una soluzione contenente tetrossido di osmio all'1% (OsO 4) e ferrocianuro di potassio all'1,5% in rapporto 1:1 a4 °C per 1 ora. Quindi, risciacquare due volte con 0,1 M PBS per 10 minuti ogni volta e risciacquare con ddH2O per altri 10 minuti.
  6. Aggiungere 1 mL di tiocarboidrazide (TCH) all'1%, incubare a temperatura ambiente per 30 minuti a 1 ora, quindi risciacquare con ddH2O quattro volte per 10 minuti ogni volta.
  7. Aggiungere 50 μL di OsO 4 all'1%, fissare a temperatura ambiente per 1 ora, quindi risciacquare con ddH2O quattro volte per 10 minuti ogni volta.
  8. Aggiungere 1 mL di acetato di uranile al 2% a 4 °C durante la notte, quindi risciacquare con ddH2O quattro volte per 10 minuti ogni volta.
  9. Aggiungere 1 mL di soluzione di Walton (0,066 g di nitrato di piombo sciolto in 10 mL di soluzione madre di acido aspartico 0,03 mol/L) a 60 °C per un'ulteriore 1 ora di incubazione.
  10. Risciacquare con ddH2O quattro volte per 10 minuti ogni volta, quindi disidratare in una serie di alcol graduato per 10 minuti ogni volta: 50% di alcol, 70% di alcol, 80% di alcol e 90% di alcol 1x e 100% di alcol 2x. Quindi, disidratare in acetone al 100% due volte per 10 minuti ogni volta. Utilizzare 1 mL di ciascuna soluzione per la disidratazione.
  11. Mescolare 200 μL di acetone con resina epossidica Pon 812 in rapporto 3:1, 1:1 e 1:3. Immergere il campione in resina a temperatura ambiente per 2 ore, 4 ore e 4 ore, rispettivamente, quindi prendere la resina epossidica 100% Pon 812 per impregnare durante la notte.
    NOTA: quando si eseguono le fasi di colorazione e incorporamento della resina, è importante operare in una cappa aspirante poiché si tratta di sostanze tossiche. Inoltre, durante l'esperimento devono essere indossati camici da laboratorio e guanti resistenti ai solventi.
  12. Mettere i campioni in uno stampo incorporato, quindi metterli in forno a 60 °C per 48 ore per polimerizzare. Utilizzare l'incorporazione piatta29 per ridurre l'aspetto della resina attorno al campione. Ciò semplifica l'installazione del campione e riduce l'impatto degli artefatti di ricarica sulla successiva segmentazione dell'immagine.
    NOTA: Per generare successivamente una superficie di taglio orizzontale, è possibile aggiungere una piccola quantità di resina nel foro dello stampo, facendo attenzione a non riempirlo eccessivamente.
  13. Preparare i wafer di silicio lavandoli prima e poi idrofilizzandoli con una soluzione concentrata di H 2 SO4/H 2O2per 30 minuti. Raccogliere strisce a fette seriali con uno spessore di 70 nm sui wafer di silicio idrofilizzati utilizzando un ultramicrotomo e asciugarle in un forno a 60 °C per 10 minuti.
    NOTA: cattura lentamente la fetta mentre galleggia sulla superficie dei wafer per evitare la perdita o la deformazione della fetta.

2. Acquisizione di immagini e ricostruzione tridimensionale

  1. Prima di montare un wafer di silicio sul palco, lavare le sezioni con acqua distillata tre volte e asciugarle all'aria. Tagliare un nastro di carbonio conduttivo delle dimensioni di 1 cm x 0,5 cm e incollarlo tra il wafer di silicio e lo stadio del campione SEM per completare la configurazione del campione (Figura 2E).
  2. Impostare il parametro di tensione di accelerazione FE-SEM su 2 kV con una distanza di lavoro di 4 mm (Figura 3B e Tabella 1).
    NOTA: per migliorare il rapporto segnale/rumore e ridurre il rumore nell'immagine, osservare a bassi ingrandimenti quando possibile. All'aumentare del multiplo, il raggio di scansione del SEM diminuisce, portando ad un aumento dell'accumulo di carica sulle immagini.
  3. Fai clic sull'icona H / L nella barra dei menu in alto. Innanzitutto, a basso ingrandimento, orientare la prima sezione delle strisce di fette di destinazione, quindi fare nuovamente clic sull'opzione H/L (Figura 3A) per passare alla modalità ad alto ingrandimento; Raccogli un'immagine appropriata per la struttura di interesse regolando la luminosità, il contrasto e l'ingrandimento dell'immagine.
  4. Selezionare Project View > Open Data e importare i file di immagine da analizzare nel software.
  5. Allineare le immagini facendo clic su Allinea sezioni > Modifica (Figura 4B) e regolare il valore Intervallo intensità nella barra dei menu in basso a sinistra modificando la trasparenza dell'immagine. Qui, utilizzare una strategia di allineamento semi-automatico; In particolare, tramite l'allineamento automatico, fare in modo che le immagini si sovrappongano a un'immagine precedente e quindi eseguire la messa a punto manuale.
    NOTA: in questo lavoro, durante il processo di allineamento, l'immagine precedente è stata utilizzata come riferimento e le operazioni di spostamento e rotazione sono state utilizzate per sovrapporsi al massimo alla struttura di destinazione delle due immagini. Facendo clic su Allinea coppia di sezioni correnti è possibile allineare automaticamente le immagini, ma potrebbero verificarsi errori di posizionamento.
  6. Selezionare il modulo Estrai sottovolume e ritagliare i set di dati allineati in base alle dimensioni della parte sovrapposta dell'intero stack.
  7. Nella sottosezione Segmentazione (Figura 4C), selezionare Ricampiona > segmentazione > Salva. Scegliete la soglia della bacchetta magica e la dimensione dello strumento pennello per selezionare l'intervallo corretto. Anche in questo caso, adottare un metodo di segmentazione semi-automatico utilizzando prima la bacchetta magica per selezionare automaticamente un'area di grandi dimensioni adatta, quindi utilizzare il pennello per descrivere accuratamente i dettagli.
    NOTA: La bacchetta magica può essere applicata alle immagini segmentate in base alle ovvie differenze nell'intensità dei pixel esistenti tra la struttura di interesse e le strutture circostanti alterando il valore di mascheramento e utilizzando la linea limite di disegno. Non è in grado di distinguere gli artefatti di ricarica generati durante l'acquisizione delle immagini. Pertanto, potrebbe comportare una segmentazione errata per le regioni target. Lo strumento Pennello può essere utilizzato per segmentare manualmente per ricostruire accuratamente le strutture biologiche.
  8. In Segmentazione > selezione, fare clic sull'icona + per aggiungere l'area selezionata (Figura 4C).
  9. Ripetere il passaggio precedente (2.8) per selezionare la stessa struttura di destinazione in immagini diverse fino al completamento della selezione per la ricostruzione delle microstrutture di interesse.
    NOTA: Durante i processi di rimodellamento mitocondriale, la selezione dell'oggetto target deve essere eseguita dall'immagine al centro di un gruppo di immagini sequenziali. Se l'area richiesta viene selezionata dalla prima o dall'ultima immagine, il risultato della ricostruzione non sarà in grado di presentare una visualizzazione 3D completa.
  10. Dopo aver completato la segmentazione regionale, generare il file di immagine in base ai migliori risultati per le dimensioni dell'oggetto e la risoluzione dell'immagine. Fare clic su Crop Editor (Ritaglia editor), quindi immettere il numero 6 nella casella Virtual Slider (Figura 4C).
  11. Nel menu a discesa a sinistra, fare clic con il pulsante destro del mouse sull'area grigia nella sottosezione Progetto e selezionare Genera superficie > Crea > Applica. Nel file generato, usa il modulo Surface View per creare la struttura della superficie e la rappresentazione 3D.

3. Quantificazione

  1. Fare clic su Rimuovi piccoli punti > applicare (Figura 4D). Nella sottosezione Progetto fare clic con il pulsante destro del mouse sull'area grigia e scegliere Analisi etichette > Applica (Figura 4D).
  2. Personalizzare il nome della colonna e scegliere un gruppo di misure. Selezionare Volume3d e Length3d dalla casella Misure native.
  3. Fare clic sul pulsante Applica nell'angolo inferiore sinistro dello schermo. Copiare i dati e rappresentare graficamente nel software statistico, ad esempio GraphPad.

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Representative Results

Durante la coltura cellulare (Figura 1A), abbiamo prima diviso le cellule tumorali pancreatiche in un gruppo di controllo coltivato con terreno di coltura completo, un gruppo (1S,3R)-RSL348 (RSL3, un attivatore della ferroptosi, 100 nM) e un gruppo RSL3 (100 nM) più ferrostatina-149 (Fer-1, un inibitore della ferroptosi, 100 nM). Attraverso le fasi sperimentali di cui sopra, il microscopio elettronico a scansione ha acquisito 38 (Figura supplementare 1), 43 (Figura supplementare 2) e 44 (Figura supplementare 3) immagini sequenziali rispettivamente per il gruppo di controllo, il gruppo RSL3 e il gruppo inibitore (gruppo RSL3 + Fer-1). Le immagini di 1.280 x 960 pixel sono state catturate con un ingrandimento di 8.000 volte (con una risoluzione di 12,40 nm / pixel). Sia le rughe che l'inquinamento nell'area della cella non sono stati osservati sopra le sezioni. Le immagini del microscopio elettronico potrebbero distinguere chiaramente gli organelli, come i mitocondri e il reticolo endoplasmatico, nelle cellule (Figura 1E).

L'osservazione delle immagini 2D da parte di FE-SEM ha mostrato che, nel gruppo di controllo delle cellule tumorali (Figura 5A), i mitocondri erano distribuiti in tutto il citoplasma e la maggior parte di essi erano sferici o ovali e uniformemente paffuti. Inoltre, l'architettura cristae relativamente regolare e allungata era chiaramente visibile. Al contrario, nel gruppo RSL3 (Figura 5D), la maggior parte dei mitocondri mostrava una morfologia in contrazione, un aumento della densità della membrana e una struttura cristae relativamente vaga. Un'ispezione più ravvicinata delle immagini SEM (Figura 5E) ha rivelato che non tutte le creste mitocondriali sono degenerate o sono scomparse, poiché un numero relativamente piccolo di creste è rimasto intatto. Rispetto al gruppo RSL3, nel gruppo inibitore, la maggior parte dei mitocondri ha mantenuto la struttura integrale delle creste mitocondriali e solo una minoranza delle strutture delle creste mitocondriali non era evidente (Figura 5G).

Mentre le informazioni 2D mostrano differenze nella morfologia mitocondriale, a volte possono risultare in una comprensione distorta della struttura 3D dettagliata e reale50,51. Le strutture cristae del gruppo di controllo sotto la condizione 3D (Figura 5C) erano coerenti con le immagini 2D, ma erano diverse per il gruppo RSL3. Per questo gruppo, la presenza di cristae mitocondriali complete potrebbe anche essere osservata nelle immagini 2D (Figura 5E), ma i mitocondri sotto 3D (Figura 5F) erano irregolari e generalmente vacuolati nel mezzo. Il gruppo inibitore (Figura 5I) ha mostrato diverse forme di crestae, con solo alcune creste mitocondriali che mostrano un collasso localizzato. Pertanto, dai risultati del gruppo RSL3, si può vedere che solo l'utilizzo dell'analisi 2D può portare a una comprensione unilaterale dei risultati. I risultati delle immagini 2D sono distorti rispetto ai risultati presentati quando si impila un set di immagini per la visualizzazione 3D, quindi non è possibile generalizzare i risultati prodotti solo attraverso le informazioni 2D. Per dimostrare in modo più oggettivo gli effetti di RSL3 sui mitocondri, sono stati utilizzati dati di ricostruzione 3D per quantificare e misurare le alterazioni mitocondriali52. Rispetto al gruppo di controllo, la lunghezza e il volume dei mitocondri 3D nel gruppo RSL3 sono diminuiti significativamente, ma i risultati della quantificazione del gruppo inibitore sono diminuiti tra i risultati degli altri due gruppi (Figura 5J, K). Questi dati quantitativi suggeriscono che RSL3 produce mitocondri più piccoli e degradati e l'aggiunta di inibitori riduce questo effetto.

Come mostrato in Figura 6B e Figura 6C, è stato determinato che l'induttore della ferroptosi RSL3 ha causato disfunzione mitocondriale e influenzato il metabolismo cellulare alterando la morfologia mitocondriale 53,54 e provocando ferroptosi, che può rappresentare una forma ubiquitaria di morte cellulare dinamica nella terapia del cancro indotta daRSL3 55.

Figure 1
Figura 1: Flusso di lavoro generale per la ricostruzione 3D dei mitocondri delle cellule tumorali pancreatiche. Viene dimostrato un flusso di lavoro generale per gli esperimenti di ricostruzione 3D descritti in questo protocollo. (A) Coltura di cellule tumorali pancreatiche. (B) Preparazione del blocco di resina. (C) Raccolta di sezioni seriali mediante un ultramicrotomo. (D) Acquisizione di immagini 2D mediante microscopio elettronico a scansione ad emissione di campo. (E) Posizionamento dei mitocondri bersaglio nelle immagini SEM sequenziali. (F) Analisi dei mitocondri in 3D. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Un dispositivo per il montaggio di strisce di fette continue su un wafer di silicio idrofilizzato. (A) Un manipolatore angolare regolabile con pinza per trattenere il wafer. (B) Telaio del portawafer posto accanto all'ultramicrotomo. (C) Posizionamento del wafer di silicio nella fessura blu contenente il coltello diamantato. (D) Un primo piano che mostra la relazione posizionale tra il wafer di silicio e la lama del coltello diamantato. (E) Un wafer di silicio con strisce di fette attaccate allo stadio campione del SEM con colla di carbonio conduttiva. (F) Un primo piano che mostra la panoramica generale delle strisce di fette seriali. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Il processo di impostazione dei parametri e acquisizione delle immagini. (A) La barra dei menu dell'FE-SEM (la freccia punta all'opzione H/L). (B) Tabella dei parametri e delle condizioni di imaging. (C) Panoramica delle immagini 2D consecutive in tre gruppi. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Una guida passo-passo per visualizzare i mitocondri in 3D utilizzando Amira. (A) Importazione di immagini da una cartella specifica. (B) Allineare le pile di immagini in base alla struttura di destinazione. (C) Segmentazione e aggiunta della regione di interesse. (D) Ricostruire la struttura 3D e aggiungere i dati di quantificazione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 5
Figura 5: La morfologia 2D e 3D dei mitocondri in ciascun gruppo. La morfologia delle cellule tumorali 2D del gruppo di controllo a (A) ingrandimento di 8.000 volte e (B) ingrandimento di 15.000 volte. (C) Una rappresentazione 3D della morfologia mitocondriale del gruppo di controllo. La morfologia delle cellule tumorali 2D del gruppo RSL3 a (D) ingrandimento di 8.000 volte e (E) ingrandimento di 15.000 volte. (F) Una rappresentazione 3D della morfologia mitocondriale del gruppo RSL3. La morfologia delle cellule tumorali 2D del gruppo RSL3 + Fer-1 (inibitore) a (G) ingrandimento di 8.000 volte e (H) ingrandimento di 15.000 volte. (I) Una rappresentazione 3D della morfologia mitocondriale del gruppo RSL3 + Fer-1 (inibitore). I dati quantitativi per la lunghezza (J) e il volume medio (K) dei mitocondri in ciascun gruppo. Le differenze significative sono indicate con asterischi e sono state calcolate utilizzando il test t di Student (rispetto al gruppo di controllo, * p≤ 0,05, ** p≤ 0,01, ***p ≤ 0,001). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Differenze nella morfologia mitocondriale delle cellule tumorali a livello 2D e 3D. (A) La morfologia delle cellule tumorali 2D del gruppo RSL3 con un ingrandimento di 8.000 volte. (B) La morfologia mitocondriale 2D ad un ingrandimento maggiore. (C) Una rappresentazione 3D di mitocondri specifici. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Parametri di imaging Condizioni
DataSize 1280 × 960
Dimensione pixel 12.40234
AccelerazioneTensione 2000 Volt
Distanza di lavoro 3700μm
Corrente di emissione 13700 nA
Corrente del fascio 10μA
Apertura di limitazione della corrente N. 2 griglia di FE-SEM
Tempo di permanenza 32 μs/px
Numero di celle 107
Volumi modificati 10×8×2,66μm, 212,8μm³
10×8×3,01μm, 240,8μm³
10×8×3,08μm, 246,4μm³

Tabella 1: Riepilogo delle condizioni di registrazione e dei parametri del dataset per l'acquisizione dell'immagine.

Figura supplementare 1: Panoramica delle immagini di 38 microsezioni di cellule tumorali del gruppo di controllo. Il numero di immagine di ogni microsezione è disposto dall'alto verso il basso. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 2: Panoramica delle immagini di 43 microsezioni di cellule tumorali del gruppo RSL3. Il numero di immagine di ogni microsezione è disposto dall'alto verso il basso. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 3: Opanoramica delle immagini di 44 microsezioni di cellule tumorali del gruppo RSL3 + Fer-1 (inibitore). Il numero di immagine di ogni microsezione è disposto dall'alto verso il basso. Clicca qui per scaricare questo file.

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Discussion

Il metodo qui presentato è un'utile guida passo-passo per applicare la tecnica di ricostruzione 3D, che prevede l'applicazione della microscopia elettronica e della tecnologia di elaborazione delle immagini all'impilamento e alla segmentazione di immagini tomografiche 2D generate da sezioni seriali ultrasottili. Questo protocollo evidenzia una limitazione delle immagini 2D che può essere affrontata dalla visualizzazione 3D dell'ultrastruttura dell'organello, che presenta i vantaggi di una forte riproducibilità delle strutture ad un livello di alta risoluzione e maggiore precisione. Ancora più importante, questa visualizzazione 3D può essere applicata alle cellule tumorali per rendere lo studio dei meccanismi patologici più semplice e affidabile. Questa tecnica è stata esaminata in questo lavoro per visualizzare le strutture stereoscopiche delle creste mitocondriali confrontando tre serie di sezioni seriali in condizioni diverse, convalidando così la degradazione della membrana mitocondriale indotta da RSL3 che si verifica nelle cellule tumorali56. Questi risultati forniscono informazioni sul meccanismo d'azione di RSL3 come farmaco anti-cancro del pancreas.

L'acquisizione di immagini 2D ad alta risoluzione gioca un ruolo importante nel processo di ricostruzione 3D57 delle creste mitocondriali e la qualità dell'immagine influisce direttamente sui risultati della ricostruzione 22,58. Pertanto, questo metodo ha anche alcune limitazioni, come gli artefatti di carica generati nelle immagini SEM59, che, a loro volta, possono portare a una segmentazione errata delle strutture target. Questo problema può essere risolto abbreviando il tempo di scansione della fetta, dotando SEM di un compensatore di carica focale34,60 e utilizzando il metodo OTO, per il quale l'uso di TCH può rendere il campione più conduttivo agli elettroni colorando con metalli aggiuntivi 61. Affidarsi alla segmentazione automatica delle immagini tende ad essere impreciso in termini di determinazione dell'ambito della struttura, mentre la segmentazione manuale richiede molto tempo58. Pertanto, sulla base del vantaggio della scansione rapida di SEM per realizzare la raccolta di immagini62, la segmentazione semi-automatica nel software Amira può essere utilizzata per consentire un'imaging e una ricostruzione efficienti; l'utilizzo del software Amira può anche rendere il risultato più accurato e preciso rispetto all'utilizzo di FIJI e MIB63. Il passo chiave nell'imaging 3D è l'acquisizione di sezioni ultrasottili. Problemi come omissioni, fratture e distorsioni, che influiscono sulla continuità dell'immagine, si verificano spesso durante la raccolta delle sezioni. Per risolvere problemi come la perdita e la rottura delle fette, abbiamo utilizzato wafer di silicio idrofilizzato come supporto per la raccolta delle strisce di fette.

Sebbene SBF-SEM e FIB-SEM possano ridurre la deformazione o i difetti nelle sezioni, queste tecniche hanno una bassa velocità di imaging, richiedono strumenti costosi e non sono in grado di ricreare la struttura di interesse64,65,66. FIB-SEM manca di stabilità del sistema durante l'imaging, mentre SBF-SEM è ostacolato da complicate fasi di preparazione dei campioni e da un noioso flusso di lavoro34. Recentemente, l'imaging microscopico STED (Stimolated emission depletion) è stato gradualmente applicato allo studio della struttura mitocondriale. Questo metodo monitora le immagini 3D in tempo reale delle criste mitocondriali nelle cellule vive attraverso la costruzione di sonde per l'etichettatura mitocondriale67. L'etichettatura dei coloranti fluorescenti può rivelare i processi di cambiamento nella fusione mitocondriale e nella fissione68. Tuttavia, le cellule vive hanno una tolleranza limitata per la luce intensa, quindi è difficile utilizzare questa tecnica nell'imaging STED a lungo termine68. Inoltre, STED è limitato dalla sua risoluzione, profondità di imaging e numero di pixel69.

Rispetto ad altre tecniche, l'uso di sezioni ultrasottili continue combinate con la tecnologia di ricostruzione 3D per osservare l'ultrastruttura degli organelli da un ampio campo visivo non solo consente l'imaging ad alto rendimento in un breve periodo di tempo, ma consente anche l'esame di immagini ad alta risoluzione di strutture target a tempi discreti21, migliorando così la velocità di imaging e la flessibilità di ricostruzione. Inoltre, i cambiamenti morfologici degli organelli e le connessioni spaziali con altri organelli possono essere ulteriormente esaminati. Questi aspetti possono essere quantificati e i meccanismi di cambiamento possono essere rivelati più accuratamente ricostruendo organelli adiacenti per mostrare le loro relazioni posizionali70,71. Questa tecnologia di ricostruzione 3D e imaging a sezione seriale utilizzando Amira58 rivela la correlazione tra malattie e organelli cambiamenti ultrastrutturali su scala nanometrica 72, è stata ampiamente utilizzata in medicina, biologia e altri campi e apre la strada allo sviluppo di nuove terapie efficaci73,74.

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Disclosures

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Acknowledgments

Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni della Natural Science Foundation of Zhejiang Province (Z23H290001, LY19H280001); Sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (82274364, 81673607 e 81774011); nonché il Public Welfare Research Project di Huzhou Science and Technology Grant (2021GY49, 2018GZ24). Apprezziamo il grande aiuto, il supporto tecnico e il supporto sperimentale della piattaforma pubblica del Centro di ricerca medica, Accademia delle scienze mediche cinesi, Università medica cinese di Zhejiang.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(1S,3R)-RSL3 MCE HY-100218A
Acetone SIGMA 179124
Amira Visage Imaging 2020.2
Aspartic acid MCE HY-42068
Dulbecco's modified Eagle’s medium Gibco 11995115
Ethanol Merck 100983
Ferrostatin-1 MCE HY-100579
Fetal bovine serum Gibco 10437010
Field emission scanning electron microscope HITACHI SU8010
Glutaraldehyde Alfa Aesar A10500.22
Lead nitrate SANTA CRUZ sc-211724
Osmium Tetroxide SANTA CRUZ sc-206008B
Panc02 European Collection of Authenticated Cell Cultures  98102213
Penicillin-streptomycin Biosharp BL505A
Phosphate Buffered Saline Biosharp BL302A
Pon 812 Epoxy resin SPI CHEM GS02660
Potassium ferrocyanide Macklin P816416
Thiocarbohydrazide Merck 223220
Ultramicrotome LEICA EMUC7
Uranyl Acetate RHAWN R032929

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Ricerca sul cancro numero 196 Cellula tumorale pancreatica mitocondri ultrastruttura ricostruzione 3D microscopia elettronica a scansione (SEM) preparazione del campione OTO
Una tecnica tridimensionale per la visualizzazione dei cambiamenti ultrastrutturali mitocondriali nelle cellule tumorali pancreatiche
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Qi, Y., Liu, Y., Huang, Y., Xiong,… More

Qi, Y., Liu, Y., Huang, Y., Xiong, M., You, S., Wang, B., Gu, M. A Three-Dimensional Technique for the Visualization of Mitochondrial Ultrastructural Changes in Pancreatic Cancer Cells. J. Vis. Exp. (196), e65290, doi:10.3791/65290 (2023).

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