Reproducerbarhed og harmonisering i forskning ved hjælp af biologiske standarder: Eksemplet på blodpladeagonist kollagenrelateret peptid

Summary

Her præsenterer vi en metode til standardisering af blodpladeagonisten kollagen-relateret peptid tværbundet (CRP-XL) ved hjælp af lystransmission aggregometri. Mens protokollen er rettet mod blodpladefunktion, kan den eksperimentelle proces anvendes på de fleste biologiske molekyler og bioassays for at sikre videnskabelig stringens og reproducerbarhed.

Abstract

Metrologi - målevidenskaben - er et emne, som kun få biologiske forskere undervises i i deres uddannelse til skade for dem; Anvendelsen af enkle standardiseringsprocesser i den daglige arbejdspraksis giver tillid til data og reproducerbarhed over afstand og tid.

Denne metode demonstrerer, hvordan man standardiserer et kernelaboratorieeksperiment, der anvendes bredt i hæmostaseforskning og klinisk praksis, specifikt måling af responser på blodpladekollagenreceptoren (glycoprotein [GP] VI) agonistkollagenrelateret peptid, tværbundet (CRP-XL) ved lystransmissionsaggregometri (LTA). Brug af denne tilgang vil sikre intra-lab reproducerbarhed og inter-lab harmonisering, uanset agonistlager eller leverandør. Det er vigtigt, at denne metode gælder for andre blodpladeagonister og faktisk mange andre biologiske molekyler og bioassays.

Processen beskrevet nedenfor involverer at lave en 6-8-punkts fortyndingsserie af 'standarden' og 'testen' (det materiale, du kontrollerer) og køre dem side om side i et valgt assay (i dette tilfælde LTA). CRP-XL anvendes ved masse/volumenkoncentrationer, men ikke alle materialer giver den samme biologiske aktivitet ved en given koncentration, så der laves en fortyndingsserie for at sammenligne standard- og testmaterialet og bestemme, hvilken koncentration der er nødvendig for at give tilsvarende aktivitet. Fortyndingsserien skal spænde over 0-100% aggregering. Data afbildes ved hjælp af ikke-lineær regression, og EC_50-værdien for hver prøve (standard og test) bestemmes. For at tildele aktivitet divideres standardens EC_50-værdi med testens værdi for at bestemme, hvor meget mere eller mindre potent den er, og juster koncentrationen i overensstemmelse hermed. Denne fremgangsmåde vil sikre, at den samme biologiske "aktivitet" føjes til analysen igen og igen.

Introduction

Mange af os bruger biologiske agonister og antagonister i vores eksperimenter, oftest i et biologisk assay, der kvantificerer deres virkning på cellefunktionen under specifikke forhold. Metoden beskrevet her er for blodpladeagonisten kollagenrelateret peptid, tværbundet (CRP-XL), en glycoprotein VI-agonist, der aktiverer blodplader, og hvis aktivitet kan måles i en række forskellige assays (lystransmissionsaggregometri, mikroskopi, flowcytometri, Ca²⁺ frigivelse osv.), Men agoniststandardiseringsprotokollen gælder for enhver biologisk agonist / antagonist og / eller bioassay. De fysiske videnskaber er velbevandrede i brugen af standarder i deres daglige arbejdspraksis, og virksomheder, der udvikler bioterapeutiske lægemidler i den kommercielle sektor, forstår værdien af at bruge referencestandarder¹, men de forbliver underudnyttet af mange biologiske forskere, især i det akademiske forskningssamfund, og deres manglende anvendelse påvirker kvaliteten af det videnskabelige output negativt.

CRP-XL er en specifik GPVI-specifik agonist, som blodpladefeltet har brugt i årtier siden beskrivelsen i 1995², hvilket hjælper samfundet med at afgrænse GPVI's rolle fra andre kollagenbindende blodpladeproteiner lige siden ^3,4. Denne agonist kan købes fra en række kommercielle kilder eller produceres internt. Peptidmonomeren kan købes hos en leverandør og derefter tværbindes internt, eller dette kan gøres af leverandøren mod et ekstra gebyr. Yderligere omkostningsbesparelser kan opnås ved at reducere den krævede renhed ved levering (f.eks. 70% versus 95%). Der er heller ingen konsensus om, hvordan CRP-XL skal opbevares, idet nogle vælger kryoopbevaring og andre køling, nogle holder materialet frysetørret indtil brug, og andre opbevarer det i opløsning (vand eller buffer, afhængigt af præference). Derfor er kvaliteten og sammensætningen af laboratorielagre ikke-standardiserede eller harmoniserede. Da denne agonist anvendes i en defineret koncentration (masse/volumen) snarere end aktivitetsenheder, vil styrken af CRP-XL i et laboratorium, f.eks. ved 1 μg/ml, ikke være den samme som i et andet. Det er værd at bemærke, at andre trombocytagonister, der anvendes i marken, allerede er standardiserede (f.eks. Trombin, som leveres og anvendes i aktivitetsenheder snarere end masse / volumen), så bevægelsen væk fra masse / volumen til biologiske enheder bør ikke være for udfordrende for samfundet. Det skal også bemærkes, at patienternes respons på trombocytagonister, herunder CRP-XL, varierer med hensyn til deres følsomhed over for agonister samt deres evne til at respondere (omfang af respons⁾⁵, så det er endnu vigtigere at anvende konsisterede mængder agonistaktivitet i analyserne.

Hvis trombocytagonister kan harmoniseres ved at bruge dem ved en defineret aktivitet i stedet for vægt / volumen, kan det sikres, at et eksperiment i et laboratorium er direkte sammenligneligt med det i andre laboratorier og kan reproduceres nøjagtigt med tillid. Indtil feltet når til enighed om, hvordan CRP-XL-aktivitet skal opbevares og standardiseres, er det vigtigt at udføre regelmæssig kontrol af materialet for at sikre dets konsistens i de måneder/år, hvor det anvendes.

Aktivitetsværditildeling for biologiske standarder skal ske gennem samarbejdende, multicenterstudier (for eksempel ^6,7) og kræver specialekspertise. Behovet for etablerede biologiske standarder for trombocytagonister er for nylig blevet fremhævet af en samarbejdsundersøgelse⁸ støttet af International Society for Thrombosis and Haemostasis (ISTH); Indtil en international CRP-XL-standard er tilgængelig, kan forskere standardisere deres eget materiale lokalt for at sikre konsistens over tid, og at nyt materiale, der stammer kommercielt eller internt, er af sammenlignelig aktivitet med tidligere præparater såvel som resten af samfundet.

Protocol

Blod skal indsamles fra samtykkende raske frivillige og behandles i overensstemmelse med lokale regler. Denne protokol måler agonist-induceret trombocytaggregation i blodpladerigt plasma (PRP) ved lysaggregometri (LTA). ISTH leverer standardiserede protokoller, herunder en 2013-metode til PRP-forberedelse og LTA⁹.  Saml fuldblod i 4% natriumcitrat i henhold til ISTH-anbefalinger i overensstemmelse med lokale etiske komitéregler. Ekskluder donorer, der har taget NSAID inden for de sidste 2 uger.

1. Procedure for analyse

1. Der udtages en delprøve af CRP-XL på stamlager og fortyndes i en buffer (Tyrodes¹⁰) (tabel 1) til en startkoncentration, der vil medføre maksimal aggregering (se bemærkningen nedenfor trin 1.3).
   BEMÆRK: I litteraturen vil en koncentration på 1 μg/ml inducere maksimal aggregering, men nogle laboratorier har brug for højere koncentrationer for at opnå samme effekt - juster fortyndingsserien i overensstemmelse hermed
2. Der laves en tilsvarende fortyndingsserie med standarden (se bemærkningen nedenfor trin 1.3 og figur 1), således at koncentrationerne er de samme som testreagenset.
3. Fremstil en 6- til 8-punkts fortyndingsserie til testen og standarden, igen i assaybuffer, der tager aggregeringsresponsen fra 100% til 0% aggregering. Et eksempel, der viser en koncentrationskurve for 8-punktsfortyndingsserier, er vist i tabel 2.
   BEMÆRK: Nogle laboratorier tilføjer agonist med i alt 10% assayvolumen, fx 50 μL agonist til 450 μL blodplader, således at de fortynder en 10x koncentration til en endelig 1x koncentration i analysen, mens andre tilføjer mindre (mere koncentrerede) volumener agonist, fx 5 μL agonist til 495 μL blodplader - bare sørg for, at fortyndingsserien er passende til analysen under hensyntagen til, hvordan volumenforskydningen påvirker blodpladekoncentrationen - igen, vær konsekvent. I eksemplet tilsættes 30 μL 10x agonist til 270 μL blodpladerigt plasma (PRP).
4. Når blodpladerne er udhvilede og klar til brug, alikvotes de i LTA-kuvetter, tilsættes en omrøringsstang, og de får lov til at nå 37 °C i opbevaringshullerne.
5. Når kuvetten eller kuvetterne er ved temperatur, placeres de i aggregometeret, og sporsporene registreres. Tilsæt agonisten (under omrøring) og registrer dataene.
6. Gentag trin 1.4 for hver koncentration i prøvningen og standarden, indtil de data, der er nødvendige for at plotte kurverne, er indsamlet (eksempler på kurver vist i figur 2).
7. Reagensens styrke beregnes i forhold til standardens Brug igen en hvilken som helst metrik - maksimal aggregering eller areal under kurven - så længe der er konsistens, og analysemodellen passer passende til dataene.

2. Kontrol af koncentrationskurverne

1. Kontroller først, at koncentrationsresponskurverne er parallelle. Der er mange softwarepakker, der gør dette, men her er processen beskrevet for Graphpad Prism (se figur 3).
   1. Indtast dataene, så log(koncentration) er på X-aksen, og respons (% maksimal aggregering/AUC) er på Y-aksen (figur 3A)
   2. Omdan CRP-XL-koncentrationer (figur 3B)
   3. Vælg Ikke-lineær regression fra analysefunktionerne , og brug ligningen for dosis-responsstimulering/hæmning.
   4. Vælg log (agonist) vs. respons (variabel hældning) - brug 3- eller 4-vejs tilpasning afhængigt af, hvad der er bedst for dataene.
   5. Find ud af, om kurverne er parallelle ved hjælp af fanen Sammenlign (som vist i figur 3C), og klik på knappen for at sammenligne datasættene for at sikre, at hældningen (bakkehældningen) og asymptoterne ( toppen og bunden af kurverne) er ækvivalente. I dette eksempel er Hill-hældningen for testen 2,279, og standardhældningen er 2,025, hvilket giver et forhold på 1,125.
   6. Hvis hældningerne er parallelle (for eksempel et acceptkriterium for hældningsforhold mellem 0,8-1,25), og asymptoterne er ækvivalente, skal du fortsætte med styrkeberegning (EC₅₀) ved hjælp af trin 2.1.3 og 2.1.4. I eksemplet her er asymptoterne blevet begrænset, da evalueringen i trin 2.1.5 bekræftede, at asymptoterne er ækvivalente.
   7. Specifikationens EC_50-værdi divideres med testens værdi for at bestemme den relative styrke. I eksemplet her er test/standard (0,07259/0,1498) = 0,4846, dvs. 'testen' er halvt så potent som standarden.
   8. Juster masse/volumenkoncentrationer for at tage højde for forskellen i styrke, dvs. hvis standarden tidligere blev brugt ved 1 μg/ml, ville det nye materiale blive brugt ved 1/0,4846 = 2,063 μg/ml) for at sikre, at sammenlignelige mængder aktivt materiale anvendes i eksperimenter

Representative Results

Figur 1 er en diagrammatisk gengivelse af en fortyndingsserie og har til formål at fremhæve, at der er behov for en fortyndingsserie til både standarden og prøvningen. Figur 2A viser aggregeringsspor for standarden, mens testdataene er vist i figur 2B. Ved 0,075 μg/ml er der et klart respons på standarden, mens den tilsvarende koncentration (0,075 μg/ml) for testen er flad, dvs. ingen respons. Disse data bruges til at plotte de efterfølgende grafer for at give EF₅₀. I eksemplet her blev der anvendt 100% maksimal aggregering til at plotte koncentrations-responskurven og bestemme EC₅₀, som vist i figur 3.

Figur 1: Grafisk beskrivelse af de to fortyndingsserier i testen (venstre) og standarden (højre). Startende med den øverste koncentration (foreslået koncentration: 10 μg/mL CRP-XL) foretages sekventielle 1 til 2 fortyndinger parallelt over 8 punkter (>3 logenheder). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Aggregeringsspor for standard- (venstre) og testfortyndingsserier (højre). Når blodpladeaggregeringen fortsætter (x-aksen), øges mængden af lys, der passerer gennem prøven og når sensoren (y-aksen). (A) Standard. (B) Test. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: Dataindtastning og analyse. (A) Data indtastes, (B) transformeres og (C,D) analyseres for parallelitet (bed softwaren om at fortælle, om bakkeskråningerne og asymptoterne er sammenlignelige [C]). E) Hvis kurverne er parallelle, bestemmes styrken (EC₅₀) ved hjælp af ikke-lineær regressionskurvetilpasning. (F) Afbildede transformerede data. Se metoden for flere detaljer. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tyrodes buffer9
Vælgere	Koncentration	Kommentarer
NaCl	134 mM
Na2HPO4	0,34 mM
KCl	2,9 mM
NaHCO3	12 mM
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethansulfonsyre (HEPES)	20 mM
Glukose	5 mM
MgCl2	1 mM	pH 7,3

Tabel 1: Sammensætning af tyrodes buffer.

8-punkts fortyndingsserie
Fortynding 1	10 μg/ml
Fortynding 2	5 μg/ml
Fortynding 3	2,5 μg/ml
Fortynding 4	1,25 μg/ml
Fortynding 5	0,625 μg/ml
Fortynding 6	0,3125 μg/ml
Fortynding 7	0,15625 μg/ml
Fortynding 8	0,073125 μg/ml

Tabel 2: Et eksempel, der viser en 8-punkts fortyndingsserie.

Discussion

Som vist her er processen med standardisering af materialerne meget ligetil. Selvom det kræver lidt tid at evaluere nye batcher af materiale og/eller kontrollere, at den aktuelle batch er stabil og ikke mister aktivitet over tid, er belønningen, at eksperimenter er reproducerbare igen og igen og sammenlignelige over år snarere end blot levetiden for et parti reagens. Det betyder også, at andre forskere præcist kan genskabe analyseforholdene, og at samfundet er harmoniseret på globalt plan. Kritiske trin i protokollen omfatter fuldblodstapning og PRP-præparation⁹ samt præcision ved fremstilling af fortyndingsserien. Det er også vigtigt at sikre, at test- og standardkurverne er parallelle, før du fortsætter med EC_{50-sammenligningen} . Hvis linjerne ikke er parallelle, eller asymptoterne ikke er ækvivalente, kan det indikere, at test- og standardmaterialet til en vis grad er forskellige.

Alle, der arbejder inden for de biologiske videnskaber, ved, at biologiske analyser ikke altid fungerer konsekvent, så man skal være opmærksom på dette, når man vurderer dataene. I eksemplet vist her, selvom vi bruger de samme donorer til at måle styrken af to meget ens, hvis ikke identiske, materialer, er bakkeskråningerne og asymptoterne ikke identiske. Alligevel accepterer vi en vis variabilitet og konkluderer, at kurverne i dette tilfælde er parallelle og derfor egnede til sammenligning og justering af styrke. Biologiske molekyler er store og komplekse, og posttranslationelle modifikationer under fremstillingen kan påvirke deres styrke i bioassays. Standardisering af biomolekyler og bioassays kan ikke udføres ved hjælp af masse eller volumen og skal gøres ved at kvantificere og sammenligne biologisk aktivitet i et bioassay¹¹. Man skal bruge sin uddannelse og erfaring til at evaluere dataene i forbindelse med analysen.

Begrænsninger ved teknikken er, at selvom dataene kan indikere et problem med reagenset (e), kan de ikke fortælle dig, hvad problemet er. Yderligere arbejde vil være nødvendigt for at afgøre, hvorfor materialerne ikke er sammenlignelige. I en ideel verden ville ethvert materiale, der er kritisk for eksperiment(er) og efterfølgende videnskabelige konklusioner, blive verificeret ved massespektroskopi, men dette er ikke altid en mulighed. Hvis dataene imidlertid ikke er sammenlignelige, er yderligere undersøgelser stadig berettigede i en vis kapacitet. En anden begrænsning af denne tilgang er den tid og de ressourcer, der er nødvendige for at gøre det. Ideelt set bør testen og standarden sammenlignes hos 3-6 donorer for at give en vis tillid til at tildele materialet biologisk aktivitet, men vi føler, at dette er berettiget ved at understøtte reproducerbarhed og pålidelighed. Standardisering af biologisk materiale er ikke nødvendig, hver gang eksperimenter udføres, men som minimum bør det gøres for hvert nyt parti agonister, helst hyppigere, afhængigt af stabilitet og anvendelse. Hvis en standard stilles til rådighed, er dette noget, som internationale standardiseringsorganisationer kan skabe klarhed over.

Mens eksemplet her er for CRP-XL i forbindelse med måling af blodpladeaggregering, er protokollen til sammenligning af biomolekylers biologiske aktivitet i bioassays bredt anvendelig i hele sektoren.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% sodium citrate	Sigma-Aldrich	S1804	Anticoagulant dissolved in water9
4-(2- hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)	Sigma-Aldrich	54457
CRP-XL	Peptide Protein Research Ltd.		A crosslinked, triple-helical peptide2,4 with the sequence GCP*(GPP*)GCP*G (single letter amino acid code: P* = hydroxyproline was obtained as a custom order from Peptide Protein Research Ltd.
Cuvettes and stir bars	Stago	86921	Consumables for aggregometer
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
KCl	Sigma-Aldrich	P5405
MgCl2	Sigma-Aldrich	M4880
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S5136
NaCl	Sigma-Aldrich	Sigma-Aldrich
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6014
Prism	Graphpad		Analysis software package
Platelet rich plasma			Isolated from whole blood from healthy volunteers free of non-steroidal anti-inflammatory drugs for a minimum of 10 days8.