具有免疫成分的基本三维 （3D） 肠道模型系统

Summary

在这里，我们描述了构建一个基本的三维（3D）肠道细胞系模型系统和一个石蜡包埋方案，用于固定肠道当量的光学显微评估。对选定的蛋白质进行染色可以分析来自单个实验的多个视觉参数，以潜在地用于临床前药物筛选研究。

Abstract

体内和体外肠道模型在研究炎症性肠道疾病的病理生理学、潜在有益物质的药理学筛选以及潜在有害食品成分的毒性研究方面的使用有所增加。与此相关的是，目前需要开发基于细胞的体外模型来替代动物模型。在这里，提出了一个使用细胞系的基本“健康组织”三维（3D）肠道等效模型的方案，具有提供实验简单性（标准化和易于重复的系统）和生理复杂性（Caco-2肠细胞与U937单核细胞和L929成纤维细胞的支持免疫成分）的双重好处。该协议还包括用于固定肠道当量的光学显微镜评估的石蜡包埋，从而提供了从单个实验中分析多个视觉参数的优势。苏木精和伊红 （H&E） 染色切片显示 Caco-2 柱状细胞在对照处理中形成紧密且规则的单层，用于验证该模型作为实验系统的功效。使用麸质作为促炎食品成分，从切片中分析的参数包括单层厚度减少，以及与底层基质 （H&E） 的破坏和分离、闭合蛋白染色所示的紧密连接蛋白表达降低（可统计学量化），以及迁移的 U937 细胞的免疫激活，如分化簇 14 （CD14） 染色和 CD11b 相关分化为巨噬细胞所证明的那样。如使用脂多糖模拟肠道炎症所示，可以测量的其他参数是粘液染色和细胞因子表达增加（如中间因子），这些参数可以在固定前从培养基中提取。基本的三维 （3D） 肠粘膜模型和固定切片可推荐用于炎症状态和屏障完整性研究，并可以分析多个视觉可量化参数。

Introduction

肠上皮屏障是包含不同类型上皮细胞的单细胞厚内膜，构成了身体外部和内部环境之间的第一个物理防御屏障或界面 ^1,2。柱状肠细胞是最丰富的上皮细胞类型。它们负责通过包括紧密连接 （TJ） 在内的多个屏障组件之间的相互作用来维持上皮屏障的完整性，在屏障收紧中起着重要作用 ^1,3。TJ 结构由细胞内斑块蛋白组成，例如闭塞带 （ZO） 和扣带蛋白，与跨膜蛋白（包括闭塞蛋白、claudins 和连接粘附分子 （JAM））合作，形成紧密连接相邻细胞的拉链状结构 ^3,4。跨膜蛋白调节小化合物的被动细胞旁扩散，排除有毒的大分子。

潜在有毒的食物化合物和食物污染物会刺激炎性细胞因子的产生，从而破坏上皮通透性，激活免疫细胞并引起慢性肠道组织炎症 ^5,6,7。相比之下，据报道，各种抗氧化和抗炎植物化学物质可通过恢复 TJ 蛋白表达和组装来降低炎性细胞因子表达并增强肠道 TJ 屏障完整性 ^4,6,8。因此，有益和有害化合物对上皮屏障完整性的调节已经看到体内和体外模型的使用增加，这些模型旨在模拟肠道屏障进行药物筛选和毒性研究。鉴于人们对了解肠病 （IBD）、坏死性小肠结肠炎和癌症的病理生理学的兴趣日益浓厚，这一点尤其重要，这些都可以在实验模型^{中模拟 8、9、10}。

为了实现动物试验中“3R”的目标，人们一直需要开发基于细胞的体外模型。这些措施包括替代使用动物的替代品，减少使用的动物数量，以及改进采用减轻痛苦的方法11,12,13。此外，人类和小鼠模型（啮齿动物是使用最广泛的物种）之间的潜在分子、细胞和生理机制是独特的，导致关于小鼠模型作为人类反应预测因子的功效的争议^12,13。体外人类细胞系模型的众多优点包括靶标限制实验、直接观察和连续分析¹³。

二维 （2D） 培养物中的单细胞型单层已成为强大的模型。然而，这些不能精确地再现人体组织的生理复杂性^8,13,14。因此，3D培养系统正在开发中，并不断改进，以概括健康和患病肠道组织的生理复杂性，作为下一代风险评估工具箱^13,14。这些模型包括具有不同细胞系的 3D Transwell 支架、类器官培养物和使用细胞系和类器官（来自健康和患病组织）的微流体装置（肠芯片）^8,13,14。

本研究中提出的 3D“健康组织”肠道等效方案基于在生理复杂性和实验简单性之间取得平衡¹³。该模型代表了 3D Transwell 支架，由三种细胞系（肠细胞 [金标准结肠腺癌 Caco-2 系]和支持免疫成分 [U937 单核细胞和 L929 成纤维细胞]）组成，构成了一个标准化且易于重复的系统，适用于初步筛选对肠上皮屏障完整性和免疫反应感兴趣的膳食分子。该协议包括石蜡包埋，用于使用固定肠道等效物对上皮屏障完整性进行光学显微镜评估。本方法的优点是可以使包埋组织的许多切片从单个实验中对多个参数进行染色。

Protocol

1. 基本3D重建肠黏膜模型的制备 注意：整个过程必须在无菌层流罩中进行。涉及使用细胞培养箱的程序中的所有步骤都意味着将培养物在含有5%CO2 的湿润气氛中在37°C下孵育（除非方案中另有说明）。 肠道模型系统中使用的细胞系的预先制备在 F25 烧瓶中以 5 x 105 的浓度接种 L929 小鼠成纤维细胞，在 5 mL 含有 2 mM L-谷氨酰胺、10% 胎牛血清 …

Representative Results

第一个重要方面是确定用于实验目的的基本 3D 肠道等效粘膜的可接受性。这是使用组织学和组织病理学实验室中最广泛使用的染色剂进行的，即苏木精（染色核材料深蓝紫色）和伊红（染色细胞质材料深浅不一的粉红色）。首先对未经处理的对照进行H&E染色，该对照在与实验处理相同的条件和时间范围内培养。通过可视化细胞的模式、形状和结构，该肠道细胞模型系统的成功取决于 Caco-2 细胞在 …

Discussion

这里介绍的基本重建肠粘膜模型系统（图6）结合了生理复杂性（含有Caco-2单层的生理上更相关的3D细胞培养物，以及含有成纤维细胞和单核细胞的富含ECM的固有层支持物）和实验简单性（使用商业人类细胞系产生标准化且易于重复的系统）¹³.因此，该模型系统被认为是小鼠模型的合适替代品，旨在评估潜在药物/食品成分对肠道屏障完整性的影响。在这方面…