Базовая трехмерная (3D) система моделей кишечника с иммунным компонентом

Summary

В данной статье мы опишем построение базовой трехмерной (3D) системы моделирования кишечной клеточной линии и протокола встраивания парафина для световой микроскопической оценки фиксированных кишечных эквивалентов. Окрашивание выбранных белков позволяет анализировать несколько визуальных параметров из одного эксперимента для потенциального использования в доклинических скрининговых исследованиях лекарственных средств.

Abstract

Отмечается рост использования моделей кишечника in vivo и in vitro для изучения патофизиологии воспалительных заболеваний кишечника, для фармакологического скрининга потенциально полезных веществ и для исследований токсичности потенциально вредных пищевых компонентов. Актуально то, что в настоящее время существует потребность в разработке клеточных моделей in vitro для замены моделей на животных. Здесь представлен протокол для базовой, «здоровой» трехмерной (3D) эквивалентной модели кишечника с использованием клеточных линий, обладающий двойным преимуществом, обеспечивающим как экспериментальную простоту (стандартизированная и легко воспроизводимая система), так и физиологическую сложность (энтероциты Caco-2 с поддерживающим иммунным компонентом моноцитов U937 и фибробластов L929). Протокол также включает в себя введение парафина для световой микроскопической оценки фиксированных кишечных эквивалентов, тем самым обеспечивая преимущество анализа нескольких визуальных параметров в одном эксперименте. Окрашенные гематоксилином и эозином (H&E) срезы, показывающие столбчатые клетки Caco-2, образующие плотный и регулярный монослой в контрольных процедурах, используются для проверки эффективности модели в качестве экспериментальной системы. Используя глютен в качестве провоспалительного компонента пищи, параметры, анализируемые из срезов, включают уменьшение толщины монослоя, а также разрушение и отслоение от нижележащего матрикса (H&E), снижение экспрессии белка плотного соединения, как показано при окклюдиновом окрашивании (количественно поддающееся статистической оценке), и иммунную активацию мигрирующих клеток U937, о чем свидетельствует окрашивание кластера дифференцировки 14 (CD14) и дифференцировка, связанная с CD11b, в макрофаги. Как показано при использовании липополисахарида для моделирования воспаления кишечника, дополнительными параметрами, которые могут быть измерены, являются повышенное окрашивание слизи и экспрессия цитокинов (таких как мидкин), которые могут быть извлечены из среды до фиксации. Базовая трехмерная (3D) модель слизистой оболочки кишечника и фиксированные срезы могут быть рекомендованы для исследований воспалительного статуса и целостности барьера с возможностью анализа нескольких визуальных количественных параметров.

Introduction

Эпителиальный барьер кишечника, внутренняя оболочка толщиной в одну клетку, содержащая различные типы эпителиальных клеток, представляет собой первый физический защитный барьер или интерфейс между внешней и внутренней средой тела ^1,2. Энтероциты столбчатого типа представляют собой наиболее распространенный тип эпителиальных клеток. Они отвечают за поддержание целостности эпителиального барьера за счет взаимодействия между несколькими компонентами барьера, включая плотные соединения (ТЖ), играя значительную роль в уплотнении барьера ^1,3. Структура TJ состоит из внутриклеточных белков бляшек, таких как zonula occludens (ZO) и цингулин, взаимодействующих с трансмембранными белками, включая окклюдины, клаудины и молекулы соединительной адгезии (JAM), которые образуют структуру, подобную молнии, плотно связывающую соседние клетки ^3,4. Трансмембранные белки регулируют пассивную параклеточную диффузию мелких соединений и исключают токсичные крупные молекулы.

Потенциально токсичные пищевые соединения и пищевые загрязнители стимулируют воспалительную продукцию цитокинов, которые нарушают проницаемость эпителия, активируя иммунные клетки и вызывая хроническое воспаление тканей кишечника ^5,6,7. Напротив, сообщалось, что различные антиоксидантные и противовоспалительные фитохимические вещества снижают экспрессию воспалительных цитокинов и улучшают целостность кишечного барьера TJ за счет восстановления экспрессии и сборки белка TJ ^4,6,8. Таким образом, регуляция целостности эпителиального барьера как полезными, так и вредными соединениями привела к увеличению использования моделей как in vivo, так и in vitro, направленных на имитацию кишечного барьера для фармацевтического скрининга и исследований токсичности. Это особенно актуально с учетом растущего интереса к пониманию патофизиологии кишечных заболеваний кишечника (ВЗК), некротизирующего энтероколита и рака, которые могут быть смоделированы на экспериментальных моделях ^8,9,10.

Существует спрос на разработку клеточных моделей in vitro для достижения цели «3R» в испытаниях на животных. К ним относятся альтернативы использованию животных, сокращение числа используемых животных и совершенствование методов смягчения дистресса 11,12,13. Более того, молекулярные, клеточные и физиологические механизмы, лежащие в основе человеческих и мышиных моделей (грызуны являются наиболее широко используемыми видами), различны, что приводит к спорам относительно эффективности мышиных моделей в качестве предикторов в человеческих реакциях^12,13. Многочисленные преимущества моделей человеческих клеточных линий in vitro включают эксперименты с ограничением мишеней, прямое наблюдение и непрерывный анализ¹³.

Монослои одноклеточного типа в двумерных (2D) культурах послужили мощными моделями. Однако они не могут точно воспроизвести физиологическую сложность человеческих тканей ^8,13,14. В результате, системы 3D-культивирования разрабатываются с постоянно растущими улучшениями для повторения физиологической сложности как здоровых, так и больных тканей кишечника в качестве инструментария для оценки риска следующего поколения^13,14. Эти модели включают в себя 3D-каркасы Transwell с различными клеточными линиями, органоидными культурами и микрофлюидными устройствами (кишечник на чипе), использующими как клеточные линии, так и органоиды (полученные как из здоровых, так и из больных тканей)^8,13,14.

Трехмерный протокол «здоровой ткани» кишечного эквивалента, представленный в настоящем исследовании, был основан на нахождении баланса между физиологической сложностью и экспериментальной простотой¹³. Модель представляет собой 3D-каркас Transwell, состоящий из трех клеточных линий (энтероциты [линия Caco-2 золотого стандарта аденокарциномы толстой кишки] с поддерживающим иммунным компонентом [моноциты U937 и фибробласты L929]), представляющие собой стандартизированную и легко воспроизводимую систему, применимую для предварительного скрининга интересующих пищевых молекул на целостность эпителиального барьера кишечника и иммунный ответ. Протокол включает введение парафина для световой микроскопической оценки целостности эпителиального барьера с использованием фиксированных кишечных эквивалентов. Преимущество данного подхода заключается в том, что в рамках одного эксперимента можно окрасить множество участков внедренных тканей по нескольким параметрам.

Protocol

1. Подготовка базовой 3D реконструированной модели слизистой оболочки кишечника ПРИМЕЧАНИЕ: Вся процедура должна проводиться в стерильном ламинарном колпаке. Все этапы процедуры, связанные с использованием клеточного инкубатора, означают, что культуры инкубируются при 37…

Representative Results

Первым важным аспектом является определение приемлемости базового 3D слизистой оболочки кишечного эквивалента для экспериментальных целей. Это делается с помощью наиболее широко используемых красителей в гистологических и гистопатологических лабораториях, а именно гематоксилина (о…

Discussion

Представленная здесь базовая реконструированная система моделирования слизистой оболочки кишечника (рис. 6) сочетает в себе физиологическую сложность (более физиологически релевантные 3D-клеточные культуры, содержащие монослой Caco-2 с богатой ECM опорой из собственной пл…