Grundlegendes dreidimensionales (3D) Darmmodellsystem mit einer Immunkomponente

Summary

Hier beschreiben wir die Konstruktion eines grundlegenden dreidimensionalen (3D) intestinalen Zelllinienmodellsystems und eines Paraffin-Einbettungsprotokolls für die lichtmikroskopische Bewertung von fixierten intestinalen Äquivalenten. Die Färbung ausgewählter Proteine ermöglicht die Analyse mehrerer visueller Parameter aus einem einzigen Experiment für den potenziellen Einsatz in präklinischen Wirkstoff-Screening-Studien.

Abstract

Die Verwendung von In-vivo – und In-vitro-Darmmodellen zur Untersuchung der Pathophysiologie entzündlicher Darmerkrankungen, zum pharmakologischen Screening potenziell nützlicher Substanzen und zur Toxizitätsuntersuchung potenziell schädlicher Lebensmittelbestandteile hat zugenommen. Relevant ist, dass derzeit ein Bedarf an der Entwicklung von zellbasierten In-vitro-Modellen besteht, um Tiermodelle zu ersetzen. Hier wird ein Protokoll für ein grundlegendes, dreidimensionales (3D) intestinales Äquivalentmodell aus “gesundem Gewebe” unter Verwendung von Zelllinien vorgestellt, das sowohl experimentelle Einfachheit (standardisiertes und leicht wiederholbares System) als auch physiologische Komplexität (Caco-2-Enterozyten mit einer unterstützenden Immunkomponente von U937-Monozyten und L929-Fibroblasten) bietet. Das Protokoll beinhaltet auch eine Paraffineinbettung zur lichtmikroskopischen Auswertung von fixierten Darmäquivalenten, wodurch der Vorteil der Analyse mehrerer visueller Parameter in einem einzigen Experiment geboten wird. Hämatoxylin- und Eosin-gefärbte (H&E)-gefärbte Schnitte, die zeigen, dass die Caco-2-Säulenzellen eine dichte und regelmäßige Monoschicht in Kontrollbehandlungen bilden, werden verwendet, um die Wirksamkeit des Modells als experimentelles System zu überprüfen. Zu den Parametern, die aus den Schnitten analysiert wurden, gehören eine reduzierte Monoschichtdicke sowie eine Störung und Ablösung von der zugrunde liegenden Matrix (H&E), eine verminderte Expression von Tight-Junction-Proteinen, wie sie aus der Occludin-Färbung (statistisch quantifizierbar) hervorgeht, und die Immunaktivierung migrierender U937-Zellen, wie sie durch die Cluster-of-Differentiation 14 (CD14)-Färbung und die CD11b-bezogene Differenzierung in Makrophagen nachgewiesen wird. Wie die Verwendung von Lipopolysaccharid zur Simulation einer Darmentzündung zeigt, sind zusätzliche Parameter, die gemessen werden können, eine erhöhte Schleimfärbung und Zytokinexpression (z. B. Midkin), die vor der Fixierung aus dem Medium extrahiert werden können. Das grundlegende dreidimensionale (3D) Darmschleimhautmodell und die fixierten Schnitte können für Studien zum Entzündungsstatus und zur Barriereintegrität empfohlen werden, wobei die Möglichkeit besteht, mehrere visuell quantifizierbare Parameter zu analysieren.

Introduction

Die intestinale Epithelbarriere, eine eine Zelle dicke innere Auskleidung, die verschiedene Arten von Epithelzellen enthält, stellt die erste physikalische Abwehrbarriere oder Schnittstelle zwischen dem äußeren und dem inneren Milieu des Körpers dar ^1,2. Enterozyten vom Säulentyp stellen die am häufigsten vorkommende Art von Epithelzellen dar. Diese sind für die Aufrechterhaltung der Integrität der epithelialen Barriere durch Wechselwirkungen zwischen mehreren Barrierekomponenten, einschließlich Tight Junctions (TJs), verantwortlich und spielen eine wichtige Rolle bei der Straffung der Barriere ^1,3. Die TJ-Struktur besteht aus intrazellulären Plaqueproteinen wie Zonula occludens (ZO) und Cingulin, die mit Transmembranproteinen zusammenarbeiten, einschließlich Occludinen, Claudinen und junktionalen Adhäsionsmolekülen (JAMs), die eine reißverschlussartige Struktur bilden, die die benachbarten Zellen fest miteinander verbindet ^3,4. Die Transmembranproteine regulieren die passive parazelluläre Diffusion kleiner Verbindungen und schließen toxische große Moleküle aus.

Potenziell toxische Lebensmittelverbindungen und Lebensmittelkontaminanten stimulieren die Produktion von entzündlichen Zytokinen, die die epitheliale Permeabilität stören, Immunzellen aktivieren und chronische Entzündungen des Darmgewebes verursachen ^5,6,7. Im Gegensatz dazu wurde berichtet, dass verschiedene antioxidative und entzündungshemmende Phytochemikalien die inflammatorische Zytokinexpression reduzieren und die Integrität der intestinalen TJ-Barriere durch die Wiederherstellung der TJ-Proteinexpression und -assemblierung verbessern ^4,6,8. Daher hat die Regulierung der Integrität der Epithelbarriere sowohl durch nützliche als auch durch schädliche Verbindungen zu einer Zunahme der Verwendung von In-vivo– und In-vitro-Modellen geführt, die darauf abzielen, die Darmbarriere für pharmazeutische Screening- und Toxizitätsstudien nachzuahmen. Dies ist besonders relevant angesichts des zunehmenden Interesses am Verständnis der Pathophysiologie von Darmerkrankungen (CED), nekrotisierender Enterokolitis und Krebs, die in experimentellen Modellen simuliert werden können ^8,9,10.

Gefragt ist die Entwicklung von zellbasierten In-vitro-Modellen, um das Ziel der “3R” im Tierversuch zu erreichen. Dazu gehören Ersatzalternativen zur Verwendung von Tieren, die Verringerung der Anzahl der verwendeten Tiere und die Verfeinerung der Anwendung von Methoden zur Linderung von Not 11,12,13. Darüber hinaus sind die zugrundeliegenden molekularen, zellulären und physiologischen Mechanismen zwischen menschlichen und murinen Modellen (Nagetiere sind die am weitesten verbreitete Spezies) unterschiedlich, was zu einer Kontroverse über die Wirksamkeit der murinen Modelle als Prädiktoren für menschliche Reaktionen führt^12,13. Zu den zahlreichen Vorteilen von In-vitro-Modellen humaner Zelllinien gehören zielbeschränkte Experimente, direkte Beobachtung und kontinuierliche Analyse¹³.

Einzelzell-Monoschichten in zweidimensionalen (2D) Kulturen haben als leistungsfähige Modelle gedient. Diese können jedoch die physiologische Komplexität menschlicher Gewebe nicht exakt wiedergeben ^8,13,14. Infolgedessen werden 3D-Kultursysteme mit immer besseren Verbesserungen entwickelt, um die physiologische Komplexität sowohl von gesundem als auch von erkranktem Darmgewebe als Risikobewertungs-Toolboxen der nächsten Generation zu rekapitulieren ^13,14. Zu diesen Modellen gehören 3D-Transwell-Gerüste mit verschiedenen Zelllinien, Organoidkulturen und mikrofluidischen Geräten (Intestine-on-Chip), die sowohl Zelllinien als auch Organoide (sowohl aus gesundem als auch aus erkranktem Gewebe) verwenden8,13,14.

Das in der vorliegenden Studie vorgestellte 3D-Protokoll für “gesundes Gewebe” basierte auf der Suche nach einem Gleichgewicht zwischen physiologischer Komplexität und experimenteller Einfachheit¹³. Das Modell ist repräsentativ für ein 3D-Transwell-Gerüst, das aus drei Zelllinien besteht (Enterozyten [die Goldstandard-Caco-2-Linie des Kolon-Adenokarzinoms] mit einer unterstützenden Immunkomponente [U937-Monozyten und L929-Fibroblasten]), die ein standardisiertes und leicht wiederholbares System darstellen, das für das vorläufige Screening von Nahrungsmolekülen von Interesse auf die Integrität der Darmepithelbarriere und die Immunantwort anwendbar ist. Das Protokoll umfasst Paraffineinbettungen zur lichtmikroskopischen Beurteilung der Integrität der Epithelbarriere unter Verwendung von fixierten Darmäquivalenten. Der Vorteil des vorliegenden Ansatzes besteht darin, dass zahlreiche Abschnitte des eingebetteten Gewebes in einem einzigen Experiment für mehrere Parameter gefärbt werden können.

Protocol

1. Erstellung des grundlegenden 3D-rekonstruierten Darmschleimhautmodells HINWEIS: Das gesamte Verfahren muss in einer sterilen Laminar-Flow-Haube durchgeführt werden. Alle Schritte des Verfahrens, bei denen der Zellinkubator verwendet wird, bedeuten, dass die Kulturen bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO2 inkubiert werden (sofern im Protokoll nicht anders angegeben). Vorherige Präparation der im Darmmodellsystem verwendeten Zelllinien<l…

Representative Results

Der erste wichtige Aspekt besteht darin, die Akzeptanz der basischen 3D-Darmäquivalent-Schleimhaut für experimentelle Zwecke zu bestimmen. Dies wird mit der am weitesten verbreiteten Färbung in Histologie- und Histopathologielabors durchgeführt, nämlich Hämatoxylin (färbt Kernmaterial tiefblau-violett) und Eosin (färbt zytoplasmatisches Material in verschiedenen Rosatönen). Die H&E-Färbung wird zunächst an einer unbehandelten Kontrolle durchgeführt, die unter den gleichen Bedingungen und im gleichen Zeitrahme…

Discussion

Das hier vorgestellte grundlegende rekonstruierte Modellsystem der Darmschleimhaut (Abbildung 6) kombiniert physiologische Komplexität (physiologisch relevantere 3D-Zellkulturen, die eine Caco-2-Monoschicht mit einem EZM-reichen Lamina-propria-Träger mit Fibroblasten und Monozyten enthalten) mit experimenteller Einfachheit (Verwendung kommerzieller humaner Zelllinien zur Herstellung eines standardisierten und leicht wiederholbaren Systems)¹³. Daher wird dieses Model…