نظام نموذج الأمعاء الأساسي ثلاثي الأبعاد (3D) مع مكون مناعي
Summary
هنا نصف بناء نظام نموذج خط الخلايا المعوية الأساسي ثلاثي الأبعاد (3D) وبروتوكول تضمين البارافين للتقييم المجهري الضوئي لمكافئات الأمعاء الثابتة. يسمح تلطيخ البروتينات المختارة بتحليل معلمات بصرية متعددة من تجربة واحدة للاستخدام المحتمل في دراسات فحص الأدوية قبل السريرية.
Abstract
كانت هناك زيادة في استخدام النماذج المعوية في الجسم الحي وفي المختبر لدراسة الفيزيولوجيا المرضية للأمراض المعوية الالتهابية ، للفحص الدوائي للمواد المفيدة المحتملة ، ولدراسات السمية على المكونات الغذائية التي يحتمل أن تكون ضارة. ومما له صلة بالموضوع أن هناك طلبا حاليا على تطوير نماذج في المختبر تعتمد على الخلايا لتحل محل النماذج الحيوانية. هنا ، يتم تقديم بروتوكول لنموذج مكافئ معوي ثلاثي الأبعاد (3D) أساسي “الأنسجة السليمة” باستخدام خطوط الخلايا مع فائدة مزدوجة تتمثل في توفير كل من البساطة التجريبية (نظام موحد وقابل للتكرار بسهولة) والتعقيد الفسيولوجي (الخلايا المعوية Caco-2 مع مكون مناعي داعم من الخلايا الوحيدة U937 والخلايا الليفية L929). يتضمن البروتوكول أيضا تضمين البارافين للتقييم المجهري الضوئي للمكافئات المعوية الثابتة ، وبالتالي توفير ميزة تحليل المعلمات البصرية المتعددة من تجربة واحدة. يتم استخدام مقاطع ملطخة بالهيماتوكسيلين ويوزين (H&E) تظهر الخلايا العمودية Caco-2 التي تشكل طبقة أحادية ضيقة ومنتظمة في معالجات التحكم للتحقق من فعالية النموذج كنظام تجريبي. باستخدام الغلوتين كمكون غذائي مؤيد للالتهابات ، تشمل المعلمات التي تم تحليلها من الأقسام انخفاض سمك الطبقة الأحادية ، بالإضافة إلى الاضطراب والانفصال عن المصفوفة الأساسية (H&E) ، وانخفاض تعبير بروتين الوصلة الضيقة كما هو موضح من تلطيخ الأوكلودين (قابل للقياس الكمي إحصائيا) ، والتنشيط المناعي لخلايا U937 المهاجرة كما يتضح من مجموعة التمايز 14 (CD14) والتمايز المرتبط ب CD11b إلى البلاعم. كما هو موضح باستخدام عديد السكاريد الدهني لمحاكاة التهاب الأمعاء ، فإن المعلمات الإضافية التي يمكن قياسها هي زيادة تلطيخ المخاط وتعبير السيتوكين (مثل midkine) الذي يمكن استخلاصه من الوسط قبل التثبيت. يمكن التوصية بنموذج الغشاء المخاطي المعوي الأساسي ثلاثي الأبعاد (3D) والأقسام الثابتة لدراسات الحالة الالتهابية وسلامة الحاجز مع إمكانية تحليل معلمات بصرية متعددة قابلة للقياس الكمي.
Introduction
يشكل الحاجز الظهاري المعوي ، وهو بطانة داخلية بسمك خلية واحدة تحتوي على أنواع مختلفة من الخلايا الظهارية ، أول حاجز دفاعي مادي أو واجهة بين الخارج والوسط الداخلي للجسم 1,2. تشكل الخلايا المعوية من النوع العمودي النوع الأكثر وفرة من الخلايا الظهارية. هذه هي المسؤولة عن الحفاظ على سلامة الحاجز الظهاري من خلال التفاعلات بين العديد من مكونات الحاجز ، بما في ذلك التقاطعات الضيقة (TJs) ، وتلعب دورا مهما في تشديد الحاجز 1,3. يتكون هيكل TJ من بروتينات البلاك داخل الخلايا ، مثل انسداد المنطقة (ZO) والسينغولين ، بالتعاون مع البروتينات عبر الغشاء ، بما في ذلك الإطباق ، والكلاودين ، وجزيئات الالتصاق الموصلية (JAMs) التي تشكل بنية تشبه السوستة تربط بإحكام الخلايا المجاورة 3,4. تنظم البروتينات عبر الغشاء الانتشار السلبي للمركبات الصغيرة وتستبعد الجزيئات الكبيرة السامة.
تحفز المركبات الغذائية السامة المحتملة وملوثات الطعام إنتاج السيتوكين الالتهابي الذي يعطل نفاذية الظهارة ، وينشط الخلايا المناعية ويسبب التهاب الأنسجة المعوية المزمن5،6،7. في المقابل ، تم الإبلاغ عن العديد من المواد الكيميائية النباتية المضادة للأكسدة والمضادة للالتهابات لتقليل تعبير السيتوكين الالتهابي وتعزيز سلامة حاجز TJ المعوي من خلال استعادة تعبير بروتين TJ وتجميعه4،6،8. ومن ثم ، فإن تنظيم سلامة الحاجز الظهاري بواسطة كل من المركبات المفيدة والضارة قد شهد زيادة في استخدام كل من النماذج في الجسم الحي وفي المختبر التي تهدف إلى محاكاة الحاجز المعوي للفحص الصيدلاني ودراسات السمية. هذا مهم بشكل خاص بالنظر إلى الاهتمام المتزايد بفهم الفيزيولوجيا المرضية لأمراض الأمعاء المعوية (IBD) ، والتهاب الأمعاء والقولون الناخر ، والسرطان ، والتي يمكن محاكاتها في النماذج التجريبية8،9،10.
كان هناك طلب على تطوير نماذج قائمة على الخلايا في المختبر من أجل تحقيق هدف “3Rs” في التجارب على. وتشمل هذه بدائل بديلة لاستخدام ، والحد من عدد المستخدمة ، والصقل في اعتماد الأساليب التي تخفف من الضيق11،12،13. علاوة على ذلك ، فإن الآليات الجزيئية والخلوية والفسيولوجية الأساسية بين النماذج البشرية والفئران (القوارض هي الأنواع الأكثر استخداما) مميزة ، مما يؤدي إلى جدل حول فعالية نماذج الفئران كتنبؤات في الاستجابات البشرية12,13. تشمل المزايا العديدة لنماذج خط الخلايا البشرية في المختبر التجريب المقيد بالهدف والملاحظة المباشرة والتحليل المستمر13.
كانت الطبقات الأحادية من نوع الخلية الواحدة في الثقافات ثنائية الأبعاد (2D) بمثابة نماذج قوية. ومع ذلك ، لا يمكن لهذه إعادة إنتاج التعقيد الفسيولوجي للأنسجة البشريةبدقة 8،13،14. نتيجة لذلك ، يتم تطوير أنظمة زراعة ثلاثية الأبعاد مع تحسينات متزايدة باستمرار لتلخيص التعقيد الفسيولوجي لكل من الأنسجة المعوية السليمة والمريضة كأدوات تقييم المخاطر من الجيل التالي13،14. تشمل هذه النماذج سقالات 3D Transwell ذات خطوط الخلايا المتنوعة ، والثقافات العضوية ، وأجهزة الموائع الدقيقة (الأمعاء على الرقاقة) باستخدام كل من خطوط الخلايا والمواد العضوية (المشتقة من الأنسجة السليمة والمريضة)8،13،14.
استند بروتوكول المكافئ المعوي ثلاثي الأبعاد “الأنسجة السليمة” المقدم في الدراسة الحالية إلى تحقيق توازن بين التعقيد الفسيولوجي والبساطة التجريبية13. يمثل النموذج سقالة 3D Transwell ، التي تتألف من ثلاثة خطوط خلوية (الخلايا المعوية [خط سرطان القولون الغدي القياسي الذهبي Caco-2] مع مكون مناعي داعم [الخلايا الوحيدة U937 والخلايا الليفية L929]) ، مما يشكل نظاما موحدا وقابلا للتكرار بسهولة ينطبق على الفحص الأولي للجزيئات الغذائية ذات الأهمية على سلامة الحاجز الظهاري المعوي والاستجابة المناعية. يتضمن البروتوكول تضمين البارافين للتقييم المجهري الضوئي لسلامة الحاجز الظهاري باستخدام مكافئات معوية ثابتة. ميزة النهج الحالي هي أنه يمكن جعل أقسام عديدة من الأنسجة المدمجة تلطخ لمعلمات متعددة من تجربة واحدة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يجمع نظام نموذج الغشاء المخاطي المعوي الأساسي المعاد بناؤه المعروض هنا (الشكل 6) بين التعقيد الفسيولوجي (ثقافات خلايا ثلاثية الأبعاد أكثر صلة من الناحية الفسيولوجية تحتوي على طبقة أحادية Caco-2 مع دعم الصفيحة المخصوصة الغنية ب ECM التي تحتوي على الخلايا الليفية والوحيدات) مع ا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
شكرا لمؤسسة أمبرتو فيرونيسي على الزمالة التي تدعم عمل الباحث.
References
- Chelakkot, C., Ghim, J., Ryu, S. H. Mechanisms regulating intestinal barrier integrity and its pathological implications. Experimental & Molecular Medicine. 50 (8), 1-9 (2018).
- Schoultz, I., Keita, &. #. 1. 9. 7. ;. V. The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability. Cells. 9 (8), 1909 (1909).
- Bednarek, R. In vitro methods for measuring the permeability of cell monolayers. Methods and Protocols. 5 (1), 17 (2022).
- Suzuki, T. Regulation of the intestinal barrier by nutrients: The role of tight junctions. Animal Science Journal. 91 (1), e13357 (2020).
- Guibourdenche, M., et al. Food contaminants effects on an in vitro model of human intestinal epithelium. Toxics. 9 (6), 135 (2021).
- Panwar, S., Sharma, S., Tripathi, P. Role of barrier integrity and dysfunctions in maintaining the healthy gut and their health outcomes. Frontiers in Physiology. 12, 715611 (2021).
- Truzzi, F., et al. Pro-inflammatory effect of gliadins and glutenins extracted from different wheat cultivars on an in vitro 3D intestinal epithelium model. International Journal of Molecular Sciences. 22 (1), 172 (2020).
- Fedi, A., et al. In vitro models replicating the human intestinal epithelium for absorption and metabolism studies: A systematic review. Journal of Controlled Release. 335, 247-268 (2021).
- De Fazio, L., et al. Necrotizing enterocolitis: Overview on in vitro models. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761 (2021).
- Jubelin, C., et al. Three-dimensional in vitro culture models in oncology research. Cell & Bioscience. 12 (1), 155 (2022).
- Russell, W., Burch, R. The principles of humane experimental technique. Available online. , (2023).
- Ingber, D. E. Is it time for reviewer 3 to request human organ chip experiments instead of animal validation studies. Advanced Science. 7 (22), 2002030 (2020).
- Jung, S. M., Kim, S. In vitro models of the small intestine for studying intestinal diseases. Frontiers in Microbiology. 12, 767038 (2022).
- Nitsche, K. S., Müller, I., Malcomber, S., Carmichael, P. L., Bouwmeester, H. Implementing organ-on-chip in a next-generation risk assessment of chemicals: a review. Archives of Toxicology. 96 (3), 711-741 (2022).
- Kekilli, M., et al. Midkine level may be used as a noninvasive biomarker in Crohn’s disease. Turkish Journal of Medical Sciences. 50, 324-329 (2020).
- Truzzi, F., et al. Spermidine-eugenol supplement preserved inflammation-challenged intestinal cells by stimulating autophagy. International Journal of Molecular Sciences. 24 (4), 4131 (2023).
- Truzzi, F., et al. Are supplements safe? Effects of gallic and ferulic acids on in vitro cell models. Nutrients. 12 (6), 1591 (2020).
- Buckley, A. G., et al. Visualisation of multiple tight junctional complexes in human airway epithelial cells. Biological Procedures. Online. 20, 3 (2018).
- Ghosh, R., Gilda, J. E., Gomes, A. V. The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots. Expert Review of Proteomics. 11 (5), 549-560 (2014).
