Grunnleggende tredimensjonalt (3D) tarmmodellsystem med en immunkomponent

Summary

Her beskriver vi konstruksjon av et basalt tredimensjonalt (3D) tarmcellelinjemodellsystem og en parafininnebyggingsprotokoll for lysmikroskopisk evaluering av faste tarmekvivalenter. Farging av utvalgte proteiner tillater analyse av flere visuelle parametere fra et enkelt eksperiment for potensiell bruk i prekliniske legemiddelscreeningsstudier.

Abstract

Det har vært en økning i bruken av in vivo og in vitro intestinale modeller for å studere patofysiologien ved inflammatoriske tarmsykdommer, for farmakologisk screening av potensielt fordelaktige stoffer og for toksisitetsstudier på potensielt skadelige matkomponenter. Av relevans er det en nåværende etterspørsel etter utvikling av cellebaserte in vitro-modeller for å erstatte dyremodeller. Her presenteres en protokoll for en grunnleggende, “sunt vev” tredimensjonal (3D) tarmekvivalent modell ved bruk av cellelinjer med den doble fordelen av å gi både eksperimentell enkelhet (standardisert og lett repeterbart system) og fysiologisk kompleksitet (Caco-2 enterocytter med en støttende immunkomponent av U937-monocytter og L929-fibroblaster). Protokollen inkluderer også parafininnebygging for lysmikroskopisk evaluering av faste tarmekvivalenter, og gir dermed fordelen av å analysere flere visuelle parametere fra et enkelt eksperiment. Hematoksylin- og eosinfargede seksjoner som viser Caco-2-søylecellene som danner et tett og regelmessig monolag i kontrollbehandlinger, brukes til å verifisere effekten av modellen som et eksperimentelt system. Ved bruk av gluten som en pro-inflammatorisk matkomponent, inkluderer parametere analysert fra seksjoner redusert monolagtykkelse, samt forstyrrelse og løsrivelse fra den underliggende matriksen (H &E), redusert tett kryssproteinuttrykk som vist fra okkludinfarging (kvantifiserbar statistisk) og immunaktivering av migrerende U937-celler som vist fra klyngen av differensiering 14 (CD14) farging og CD11b-relatert differensiering i makrofager. Som vist ved bruk av lipopolysakkarid for å simulere tarmbetennelse, er ytterligere parametere som kan måles økt slimfarging og cytokinekspresjon (som midkine) som kan ekstraheres fra mediet før fiksering. Den grunnleggende tredimensjonale (3D) tarmslimhinnemodellen og faste seksjoner kan anbefales for inflammatoriske status- og barriereintegritetsstudier med mulighet for å analysere flere visuelle kvantifiserbare parametere.

Introduction

Tarmepitelbarrieren, en encelletykk indre foring som inneholder forskjellige typer epitelceller, utgjør den første fysiske defensive barrieren eller grensesnittet mellom utsiden og kroppens indre miljø ^1,2. Columnar-type enterocytter utgjør den mest tallrike typen epitelceller. Disse er ansvarlige for å opprettholde epitelbarrierens integritet gjennom interaksjoner mellom flere barrierekomponenter, inkludert tette kryss (TJ), som spiller en betydelig rolle i barrierestramming ^1,3. TJ-strukturen består av intracellulære plakkproteiner, slik som zonula occludens (ZO) og cingulin, som samarbeider med transmembranproteiner, inkludert okkludiner, klaudiner og junctional adhesjonsmolekyler (JAMs) som danner glidelåslignende struktur som tett forbinder nabocellene ^3,4. De transmembrane proteiner regulerer passiv paracellulær diffusjon av små forbindelser og utelukker giftige store molekyler.

Potensielt giftige matforbindelser og matforurensninger stimulerer inflammatorisk cytokinproduksjon som forstyrrer epitelpermeabiliteten, aktiverer immunceller og forårsaker kronisk tarmvevbetennelse ^5,6,7. I motsetning til dette har forskjellige antioksidanter og antiinflammatoriske fytokjemikalier blitt rapportert å redusere inflammatorisk cytokinekspresjon og forbedre intestinal TJ-barriereintegritet gjennom restaurering av TJ-proteinuttrykk og montering ^4,6,8. Derfor har reguleringen av epitelbarriereintegritet av både gunstige og skadelige forbindelser sett en økning i bruken av både in vivo og in vitro-modeller rettet mot å etterligne tarmbarrieren for farmasøytiske screening- og toksisitetsstudier. Dette er spesielt relevant gitt den økende interessen for å forstå patofysiologien ved tarmtarmsykdommer (IBD), nekrotiserende enterokolitt og kreft, som kan simuleres i eksperimentelle modeller ^8,9,10.

Det har vært etterspørsel etter utvikling av cellebaserte in vitro-modeller for å oppnå målet om “3R” i dyreforsøk. Disse inkluderer erstatningsalternativer til bruk av dyr, reduksjon i antall dyr som brukes, og forbedring i å ta i bruk metoder som lindrer nød 11,12,13. Videre er de underliggende molekylære, cellulære og fysiologiske mekanismene mellom humane og murine modeller (gnagere er den mest brukte arten) særegne, noe som fører til kontrovers angående effekten av murine modellene som prediktorer i menneskelige responser^12,13. Mange fordeler med in vitro humane cellelinjemodeller inkluderer målbegrenset eksperimentering, direkte observasjon og kontinuerlig analyse¹³.

Encelle-type monolayers i todimensjonale (2D) kulturer har tjent som kraftige modeller. Disse kan imidlertid ikke nøyaktig reprodusere den fysiologiske kompleksiteten til menneskelig vev ^8,13,14. Som et resultat utvikles 3D-kultursystemer med stadig økende forbedringer for å rekapitulere den fysiologiske kompleksiteten til både sunt og sykt tarmvev som neste generasjons risikovurderingsverktøykasser^13,14. Disse modellene inkluderer 3D Transwell stillas med forskjellige cellelinjer, organoidkulturer og mikrofluidiske enheter (tarm-på-chip) som bruker både cellelinjer og organoider (avledet fra både sunt og sykt vev)^8,13,14.

3D “sunt vev” intestinal ekvivalent protokoll presentert i denne studien var basert på å finne en balanse mellom fysiologisk kompleksitet og eksperimentell enkelhet¹³. Modellen er representativ for et 3D Transwell-stillas, bestående av tre cellelinjer (enterocytter [gullstandardadenokarsinomet Caco-2-linjen] med en støttende immunkomponent [U937-monocytter og L929-fibroblaster]), som utgjør et standardisert og lett repeterbart system som gjelder for foreløpig screening av diettmolekyler av interesse for tarmepitelbarriereintegritet og immunrespons. Protokollen inkluderer parafininnebygging for lysmikroskopisk evaluering av epitelbarriereintegritet ved bruk av faste tarmekvivalenter. Fordelen med den nåværende tilnærmingen er at mange deler av det innebygde vevet kan gjøres for å flekke for flere parametere fra et enkelt eksperiment.

Protocol

1. Utarbeidelse av den grunnleggende 3D rekonstruerte tarmslimhinnemodellen MERK: Hele prosedyren må utføres i en steril laminær strømningshette. Alle trinnene i prosedyren som involverer bruk av celleinkubatoren betyr at kulturer inkuberes ved 37 ° C i en fuktet atmosfære som inneholder 5% CO2 (med mindre annet er angitt i protokollen). Tidligere forberedelse av cellelinjene som brukes i tarmmodellsystemetSeed L929 mus fibroblastceller i en konsen…

Representative Results

Det første viktige aspektet er å bestemme akseptabiliteten til den grunnleggende 3D-tarmekvivalente slimhinnen for eksperimentelle formål. Dette utføres med den mest brukte flekken i histologi- og histopatologilaboratorier, nemlig hematoksylin (flekker kjernefysisk materiale dyp blålilla farge) og eosin (flekker cytoplasmatisk materiale varierende nyanser av rosa). H&E-fargingen utføres først på en ubehandlet kontroll, som dyrkes under de samme forholdene og tidsrammen som de eksperimentelle behandlingene. Fra å…

Discussion

Det grunnleggende rekonstruerte modellsystemet for tarmslimhinner som presenteres her (figur 6) kombinerer fysiologisk kompleksitet (mer fysiologisk relevante 3D-cellekulturer som inneholder et Caco-2-monolag med en ECM-rik lamina propria-støtte som inneholder fibroblaster og monocytter) med eksperimentell enkelhet (ved bruk av kommersielle humane cellelinjer for å produsere standardiserte og lett repeterbare systemer)¹³. Dette modellsystemet anses derfor som et egn…