Sistema Modelo Intestinal Tridimensional Básico (3D) com um Componente Imunológico

Summary

Aqui descrevemos a construção de um sistema básico de linhagem celular intestinal tridimensional (3D) e um protocolo de inclusão em parafina para avaliação microscópica de luz de equivalentes intestinais fixos. A coloração de proteínas selecionadas permite a análise de múltiplos parâmetros visuais de um único experimento para uso potencial em estudos pré-clínicos de triagem de drogas.

Abstract

Tem havido um aumento no uso de modelos intestinais in vivo e in vitro para estudar a fisiopatologia de doenças inflamatórias intestinais, para a triagem farmacológica de substâncias potencialmente benéficas e para estudos de toxicidade de componentes alimentares potencialmente nocivos. De relevância, existe uma demanda atual para o desenvolvimento de modelos in vitro baseados em células para substituir modelos animais. Aqui, um protocolo para um modelo básico de equivalente intestinal tridimensional (3D) de “tecido saudável” usando linhagens celulares é apresentado com o duplo benefício de fornecer simplicidade experimental (sistema padronizado e facilmente repetível) e complexidade fisiológica (enterócitos Caco-2 com um componente imune de suporte de monócitos U937 e fibroblastos L929). O protocolo também inclui a inclusão em parafina para avaliação microscópica de luz de equivalentes intestinais fixos, proporcionando assim a vantagem de analisar múltiplos parâmetros visuais de um único experimento. Cortes corados pela hematoxilina e eosina (H&E) mostrando as células colunares do Caco-2 formando uma monocamada apertada e regular nos tratamentos controle são usados para verificar a eficácia do modelo como sistema experimental. Usando glúten como um componente alimentar pró-inflamatório, os parâmetros analisados a partir de cortes incluem espessura reduzida da monocamada, bem como ruptura e desprendimento da matriz subjacente (H&E), diminuição da expressão de proteínas de junção apertada como mostrado a partir da coloração de ocludina (quantificável estatisticamente) e ativação imunológica de células U937 migratórias, como evidenciado a partir da coloração de cluster de diferenciação 14 (CD14) e diferenciação relacionada a CD11b em macrófagos. Como demonstrado pelo uso de lipopolissacarídeo para simular a inflamação intestinal, parâmetros adicionais que podem ser medidos são o aumento da coloração de muco e a expressão de citocinas (como midkine) que podem ser extraídas do meio antes da fixação. O modelo básico tridimensional (3D) da mucosa intestinal e cortes fixos podem ser recomendados para estudos do estado inflamatório e integridade da barreira, com a possibilidade de analisar múltiplos parâmetros visuais quantificáveis.

Introduction

A barreira epitelial intestinal, um revestimento interno de uma célula de espessura contendo diferentes tipos de células epiteliais, constitui a primeira barreira ou interface física defensiva entre o meio externo e o meio interno do corpo ^1,2. Os enterócitos do tipo colunar constituem o tipo mais abundante de células epiteliais. Estes são responsáveis pela manutenção da integridade da barreira epitelial por meio de interações entre vários componentes da barreira, incluindo as tight junctions (TJs), desempenhando um papel significativo no aperto da barreira ^1,3. A estrutura do TJ consiste em proteínas da placa intracelular, como zonula occludens (ZO) e cingulina, cooperando com proteínas transmembrana, incluindo oclusinas, claudinas e moléculas de adesão juncional (JAMs) que formam uma estrutura semelhante a um zíper ligando firmemente as células vizinhas ^3,4. As proteínas transmembrana regulam a difusão paracelular passiva de pequenos compostos e excluem moléculas grandes tóxicas.

Compostos alimentares potencialmente tóxicos e contaminantes alimentares estimulam a produção de citocinas inflamatórias que interrompem a permeabilidade epitelial, ativando células imunes e causando inflamação crônica do tecido intestinal ^5,6,7. Em contraste, vários fitoquímicos antioxidantes e anti-inflamatórios têm sido relatados para reduzir a expressão de citocinas inflamatórias e aumentar a integridade da barreira intestinal de TJ através da restauração da expressão e montagem da proteína TJ ^4,6,8. Assim, a regulação da integridade da barreira epitelial por compostos benéficos e nocivos tem visto um aumento no uso de modelos in vivo e in vitro com o objetivo de mimetizar a barreira intestinal para triagem farmacêutica e estudos de toxicidade. Isso é particularmente relevante dado o crescente interesse na compreensão da fisiopatologia das doenças intestinais intestinais (DII), enterocolite necrosante e câncer, que podem ser simuladas em modelos experimentais8,9,10.

Tem havido uma demanda para o desenvolvimento de modelos in vitro baseados em células, a fim de atingir o objetivo dos “3Rs” em testes com animais. Entre elas, alternativas de substituição ao uso de animais, redução do número de animais utilizados e refinamento na adoção de métodos que aliviem o sofrimento 11,12,13. Além disso, os mecanismos moleculares, celulares e fisiológicos subjacentes entre modelos humanos e murinos (sendo os roedores a espécie mais utilizada) são distintos, levando a controvérsias quanto à eficácia dos modelos murinos como preditores de respostas humanas^12,13. Inúmeras vantagens dos modelos in vitro de linhagem celular humana incluem experimentação com restrição de alvo, observação direta e análise contínua¹³.

Monocamadas do tipo célula única em culturas bidimensionais (2D) têm servido como modelos poderosos. No entanto, estes não conseguem reproduzir com precisão a complexidade fisiológica dos tecidos humanos ^8,13,14. Como resultado, sistemas de cultura 3D estão sendo desenvolvidos com melhorias cada vez maiores para recapitular a complexidade fisiológica de tecidos intestinais saudáveis e doentes como caixas de ferramentas de avaliação de risco de última geração^13,14. Esses modelos incluem scaffolds 3D Transwell com diversas linhagens celulares, culturas organoides e dispositivos microfluídicos (intestino-sobre-chip) usando linhagens celulares e organoides (derivados de tecidos saudáveis e doentes)^8,13,14.

O protocolo 3D de “tecido saudável” equivalente intestinal apresentado no presente estudo baseou-se no equilíbrio entre complexidade fisiológica e simplicidade experimental¹³. O modelo é representativo de um arcabouço Transwell 3D, composto por três linhagens celulares (enterócitos [linhagem Caco-2 do adenocarcinoma de cólon padrão-ouro] com componente imune de suporte [monócitos U937 e fibroblastos L929]), constituindo um sistema padronizado e facilmente repetível aplicável para a triagem preliminar de moléculas dietéticas de interesse na integridade da barreira epitelial intestinal e resposta imune. O protocolo inclui a inclusão em parafina para avaliação microscópica da luz da integridade da barreira epitelial usando equivalentes intestinais fixos. A vantagem da presente abordagem é que numerosos cortes dos tecidos embutidos podem ser feitos para corar para múltiplos parâmetros a partir de um único experimento.

Protocol

1. Preparação do modelo básico de mucosa intestinal reconstruída em 3D OBS: Todo o procedimento deve ser realizado em capela de fluxo laminar estéril. Todas as etapas do procedimento que envolvem o uso da incubadora de células significam que as culturas são incubadas a 37 °C em uma atmosfera umidificada contendo 5% de CO2 (salvo indicação em contrário no protocolo). Preparo prévio das linhagens celulares utilizadas no sistema modelo intestinal<li…

Representative Results

O primeiro aspecto importante é determinar a aceitabilidade da mucosa intestinal equivalente 3D básica para fins experimentais. Esta é realizada com a coloração mais utilizada nos laboratórios de histologia e histopatologia, a saber, hematoxilina (cora material nuclear de cor azul-púrpura profunda) e eosina (cora material citoplasmático variando tons de rosa). A coloração H&E é realizada primeiramente em um controle não tratado, que é cultivado nas mesmas condições e prazos dos tratamentos experimentais. A…

Discussion

O sistema modelo básico de mucosa intestinal reconstruída aqui apresentado (Figura 6) combina complexidade fisiológica (culturas de células 3D mais relevantes fisiologicamente contendo uma monocamada de Caco-2 com um suporte de lâmina própria rico em MEC contendo fibroblastos e monócitos) com simplicidade experimental (usando linhagens celulares humanas comerciais para produzir um sistema padronizado e facilmente repetível)¹³. Como tal, este sistema modelo é …