Sistema Modelo Intestinal Tridimensional Básico (3D) con un Componente Inmune

Summary

Aquí describimos la construcción de un sistema modelo básico tridimensional (3D) de líneas celulares intestinales y un protocolo de inclusión de parafina para la evaluación microscópica óptica de equivalentes intestinales fijos. La tinción de proteínas seleccionadas permite el análisis de múltiples parámetros visuales de un solo experimento para su uso potencial en estudios preclínicos de detección de fármacos.

Abstract

Ha aumentado el uso de modelos intestinales in vivo e in vitro para estudiar la fisiopatología de las enfermedades inflamatorias intestinales, para el cribado farmacológico de sustancias potencialmente beneficiosas y para los estudios de toxicidad de componentes alimentarios potencialmente nocivos. Cabe destacar que existe una demanda actual para el desarrollo de modelos in vitro basados en células que sustituyan a los modelos animales. Aquí, se presenta un protocolo para un modelo básico de equivalente intestinal tridimensional (3D) de “tejido sano” utilizando líneas celulares con el doble beneficio de proporcionar simplicidad experimental (sistema estandarizado y fácilmente repetible) y complejidad fisiológica (enterocitos Caco-2 con un componente inmune de soporte de monocitos U937 y fibroblastos L929). El protocolo también incluye la inclusión en parafina para la evaluación microscópica de luz de equivalentes intestinales fijos, lo que proporciona la ventaja de analizar múltiples parámetros visuales a partir de un solo experimento. Para verificar la eficacia del modelo como sistema experimental se utilizan cortes teñidos con hematoxilina y eosina (H&E) que muestran las células cilíndricas de Caco-2 formando una monocapa apretada y regular en tratamientos de control. Utilizando el gluten como componente alimentario proinflamatorio, los parámetros analizados en las secciones incluyen la reducción del grosor de la monocapa, así como la disrupción y el desprendimiento de la matriz subyacente (H&E), la disminución de la expresión de la proteína de unión estrecha como se muestra en la tinción de ocludina (cuantificable estadísticamente) y la activación inmune de las células U937 migratorias como se evidencia en la tinción del grupo de diferenciación 14 (CD14) y la diferenciación relacionada con CD11b en macrófagos. Como se muestra mediante el uso de lipopolisacáridos para simular la inflamación intestinal, los parámetros adicionales que se pueden medir son el aumento de la tinción de moco y la expresión de citocinas (como la midquina) que se pueden extraer del medio antes de la fijación. El modelo básico tridimensional (3D) de la mucosa intestinal y las secciones fijas pueden recomendarse para estudios de estado inflamatorio e integridad de la barrera con la posibilidad de analizar múltiples parámetros visuales cuantificables.

Introduction

La barrera epitelial intestinal, un revestimiento interno de una célula de espesor que contiene diferentes tipos de células epiteliales, constituye la primera barrera o interfaz defensiva física entre el medio externo e interno del cuerpo ^1,2. Los enterocitos de tipo cilíndrico constituyen el tipo más abundante de células epiteliales. Estos son responsables de mantener la integridad de la barrera epitelial a través de las interacciones entre varios componentes de la barrera, incluidas las uniones estrechas (TJ), desempeñando un papel importante en el endurecimiento de la barrera ^1,3. La estructura de la TJ consiste en proteínas de placa intracelular, como la zonula occludens (ZO) y la cingulina, que cooperan con las proteínas transmembrana, incluidas las ocludinas, las claudinas y las moléculas de adhesión de unión (JAM) que forman una estructura similar a una cremallera que une estrechamente a las células vecinas ^3,4. Las proteínas transmembrana regulan la difusión paracelular pasiva de compuestos pequeños y excluyen las moléculas grandes tóxicas.

Los compuestos alimentarios potencialmente tóxicos y los contaminantes alimentarios estimulan la producción de citoquinas inflamatorias que alteran la permeabilidad epitelial, activando las células inmunitarias y causando inflamación crónica del tejido intestinal ^5,6,7. Por el contrario, se ha informado que varios fitoquímicos antioxidantes y antiinflamatorios reducen la expresión de citocinas inflamatorias y mejoran la integridad de la barrera intestinal de TJ a través de la restauración de la expresión y el ensamblaje de la proteína TJ ^4,6,8. Por lo tanto, la regulación de la integridad de la barrera epitelial por compuestos beneficiosos y dañinos ha visto un aumento en el uso de modelos in vivo e in vitro destinados a imitar la barrera intestinal para el cribado farmacéutico y los estudios de toxicidad. Esto es particularmente relevante dado el creciente interés en comprender la fisiopatología de las enfermedades intestinales intestinales (EII), la enterocolitis necrotizante y el cáncer, que pueden ser simuladas en modelos experimentales ^8,9,10.

Ha habido una demanda para el desarrollo de modelos in vitro basados en células con el fin de lograr el objetivo de las “3R” en la experimentación con animales. Estos incluyen alternativas de reemplazo al uso de animales, reducción en el número de animales utilizados y refinamiento en la adopción de métodos que alivian la angustia 11,12,13. Además, los mecanismos moleculares, celulares y fisiológicos subyacentes entre los modelos humanos y murinos (siendo los roedores las especies más utilizadas) son distintivos, lo que lleva a la controversia sobre la eficacia de los modelos murinos como predictores en las respuestas humanas^12,13. Entre las numerosas ventajas de los modelos in vitro de líneas celulares humanas se incluyen la experimentación restringida a objetivos, la observación directa y el análisis continuo¹³.

Las monocapas de tipo unicelular en cultivos bidimensionales (2D) han servido como modelos poderosos. Sin embargo, estos no pueden reproducir con precisión la complejidad fisiológica de los tejidos humanos ^8,13,14. Como resultado, los sistemas de cultivo 3D se están desarrollando con mejoras cada vez mayores para recapitular la complejidad fisiológica de los tejidos intestinales sanos y enfermos como herramientas de evaluación de riesgos de próxima generación^13,14. Estos modelos incluyen andamios 3D Transwell con diversas líneas celulares, cultivos de organoides y dispositivos microfluídicos (intestino en chip) que utilizan tanto líneas celulares como organoides (derivados de tejidos sanos y enfermos)^8,13,14.

El protocolo 3D de “tejido sano” equivalente intestinal presentado en el presente estudio se basó en lograr un equilibrio entre la complejidad fisiológica y la simplicidad experimental¹³. El modelo es representativo de un andamio 3D de Transwell, compuesto por tres líneas celulares (enterocitos [la línea Caco-2 del adenocarcinoma de colon de referencia] con un componente inmune de soporte [monocitos U937 y fibroblastos L929]), constituyendo un sistema estandarizado y fácilmente repetible aplicable para el cribado preliminar de moléculas dietéticas de interés sobre la integridad de la barrera epitelial intestinal y la respuesta inmunitaria. El protocolo incluye la inclusión en parafina para la evaluación microscópica de la luz de la integridad de la barrera epitelial utilizando equivalentes intestinales fijos. La ventaja del enfoque actual es que se pueden teñir numerosas secciones de los tejidos incrustados para múltiples parámetros a partir de un solo experimento.

Protocol

1. Preparación del modelo básico de mucosa intestinal reconstruida en 3D NOTA: Todo el procedimiento debe realizarse en una campana de flujo laminar estéril. Todas las etapas del procedimiento que impliquen el uso de la incubadora celular significan que los cultivos se incuban a 37 °C en una atmósfera humidificada que contiene un 5% deCO2 (a menos que se indique lo contrario en el protocolo). Preparación previa de las líneas celulares utilizadas en el sis…

Representative Results

El primer aspecto importante es determinar la aceptabilidad de la mucosa intestinal equivalente básica en 3D con fines experimentales. Esto se realiza con la tinción más utilizada en los laboratorios de histología e histopatología, a saber, la hematoxilina (tiñe el material nuclear de color azul-púrpura intenso) y la eosina (tiñe el material citoplasmático de diferentes tonos de rosa). La tinción H&E se realiza primero en un control no tratado, que se cultiva en las mismas condiciones y plazos que los tratamien…

Discussion

El sistema modelo básico de mucosa intestinal reconstruida que se presenta aquí (Figura 6) combina la complejidad fisiológica (cultivos celulares 3D más relevantes desde el punto de vista fisiológico que contienen una monocapa de Caco-2 con un soporte de lámina propia rica en MEC que contiene fibroblastos y monocitos) con la simplicidad experimental (utilizando líneas celulares humanas comerciales para producir un sistema estandarizado y fácilmente repetible)^13</sup…