Grundläggande tredimensionellt (3D) tarmmodellsystem med en immunkomponent

Summary

Här beskriver vi hur man konstruerar ett grundläggande tredimensionellt (3D) testinalt cellinjemodellsystem och ett paraffininbäddningsprotokoll för ljusmikroskopisk utvärdering av fasta tarmekvivalenter. Färgning av utvalda proteiner möjliggör analys av flera visuella parametrar från ett enda experiment för potentiell användning i prekliniska läkemedelsscreeningstudier.

Abstract

Det har skett en ökad användning av in vivo – och in vitro-tarmmodeller för att studera patofysiologin vid inflammatoriska tarmsjukdomar, för farmakologisk screening av potentiellt fördelaktiga ämnen och för toxicitetsstudier av potentiellt skadliga livsmedelskomponenter. Av relevans finns det för närvarande en efterfrågan på utveckling av cellbaserade in vitro-modeller för att ersätta djurmodeller. Här presenteras ett protokoll för en grundläggande, “frisk vävnad” tredimensionell (3D) tarmekvivalent modell med hjälp av cellinjer med den dubbla fördelen att den ger både experimentell enkelhet (standardiserat och lätt repeterbart system) och fysiologisk komplexitet (Caco-2-enterocyter med en stödjande immunkomponent av U937-monocyter och L929-fibroblaster). Protokollet inkluderar också paraffininbäddning för ljusmikroskopisk utvärdering av fasta tarmekvivalenter, vilket ger fördelen att analysera flera visuella parametrar från ett enda experiment. Hematoxylin och eosin (H&E) färgade snitt som visar Caco-2 kolonnceller som bildar ett tätt och regelbundet monolager i kontrollbehandlingar används för att verifiera modellens effektivitet som ett experimentellt system. Genom att använda gluten som en proinflammatorisk livsmedelskomponent inkluderar parametrar som analyseras från sektioner minskad tjocklek på monolager, såväl som störning och avlossning från den underliggande matrisen (H&E), minskat tight junction-proteinuttryck som visas från ockludinfärgning (kvantifierbart statistiskt) och immunaktivering av migrerande U937-celler som framgår av kluster av differentiering 14 (CD14) färgning och CD11b-relaterad differentiering till makrofager. Som visats genom att använda lipopolysackarid för att simulera tarminflammation, är ytterligare parametrar som kan mätas ökad slemfärgning och cytokinuttryck (såsom midkine) som kan extraheras från mediet före fixering. Den grundläggande tredimensionella (3D) tarmslemhinnemodellen och fixerade sektioner kan rekommenderas för studier av inflammatorisk status och barriärintegritet med möjlighet att analysera flera visuella kvantifierbara parametrar.

Introduction

Tarmepitelbarriären, en encellig tjock inre beklädnad som innehåller olika typer av epitelceller, utgör den första fysiska försvarsbarriären eller gränssnittet mellan kroppens yttre och inre miljö ^1,2. Enterocyter av kolumntyp utgör den vanligaste typen av epitelceller. Dessa är ansvariga för att upprätthålla epitelbarriärens integritet genom interaktioner mellan flera barriärkomponenter, inklusive täta korsningar (TJ), som spelar en viktig roll vid barriäråtdragning ^1,3. TJ-strukturen består av intracellulära plackproteiner, såsom zonula occludens (ZO) och cingulin, som samarbetar med transmembranproteiner, inklusive ockludiner, claudiner och junctional adhesion molecules (JAMs) som bildar blixtlåsliknande struktur som tätt förbinder de närliggande cellerna ^3,4. De transmembrana proteinerna reglerar den passiva paracellulära diffusionen av små föreningar och utesluter giftiga stora molekyler.

Potentiellt giftiga livsmedelsföreningar och livsmedelsföroreningar stimulerar inflammatorisk cytokinproduktion som stör epitelpermeabiliteten, aktiverar immunceller och orsakar kronisk tarmvävnadsinflammation ^5,6,7. Däremot har olika antioxidanter och antiinflammatoriska fytokemikalier rapporterats minska inflammatoriskt cytokinuttryck och förbättra tarmens TJ-barriärintegritet genom återställande av TJ-proteinuttryck och sammansättning ^4,6,8. Därför har regleringen av epitelbarriärens integritet av både fördelaktiga och skadliga föreningar lett till en ökad användning av både in vivo– och in vitro-modeller som syftar till att efterlikna tarmbarriären för läkemedelsscreening och toxicitetsstudier. Detta är särskilt relevant med tanke på det ökande intresset för att förstå patofysiologin för tarmsjukdomar (IBD), nekrotiserande enterokolit och cancer, som kan simuleras i experimentella modeller ^8,9,10.

Det har funnits en efterfrågan på utveckling av cellbaserade in vitro-modeller för att uppnå målet med “3R” i djurförsök. Det handlar bland annat om ersättningsalternativ till användning av djur, minskning av antalet djur som används och förfining när det gäller att införa metoder som lindrar lidande 11,12,13. Dessutom är de underliggande molekylära, cellulära och fysiologiska mekanismerna mellan mänskliga och murina modeller (gnagare är den mest använda arten) distinkta, vilket leder till kontroverser om murina modellers effektivitet som prediktorer för mänskliga svar^12,13. Många fördelar med in vitro-modeller av humana cellinjer inkluderar målbegränsade experiment, direkt observation och kontinuerlig analys¹³.

Monolager av encellig typ i tvådimensionella (2D) kulturer har fungerat som kraftfulla modeller. Dessa kan dock inte exakt reproducera den fysiologiska komplexiteten hos mänskliga vävnader ^8,13,14. Som ett resultat av detta utvecklas 3D-odlingssystem med ständigt ökande förbättringar för att rekapitulera den fysiologiska komplexiteten hos både friska och sjuka tarmvävnader som nästa generations verktygslådor för riskbedömning^13,14. Dessa modeller inkluderar 3D Transwell-ställningar med olika cellinjer, organoidkulturer och mikrofluidiska enheter (intestine-on-chip) med både cellinjer och organoider (härledda från både friska och sjuka vävnader)^8,13,14.

Det 3D-protokoll för tarmekvivalent “frisk vävnad” som presenterades i den aktuella studien baserades på att hitta en balans mellan fysiologisk komplexitet och experimentell enkelhet¹³. Modellen är representativ för en 3D Transwell-struktur, bestående av tre cellinjer (enterocyter [guldstandarden kolonadenokarcinom Caco-2-linjen] med en stödjande immunkomponent [U937-monocyter och L929-fibroblaster]), som utgör ett standardiserat och lätt repeterbart system som är tillämpligt för preliminär screening av dietmolekyler av intresse för tarmepitelbarriärens integritet och immunsvar. Protokollet inkluderar paraffininbäddning för ljusmikroskopisk utvärdering av epitelbarriärens integritet med hjälp av fasta tarmekvivalenter. Fördelen med det nuvarande tillvägagångssättet är att många sektioner av de inbäddade vävnaderna kan fås att färgas för flera parametrar från ett enda experiment.

Protocol

1. Förberedelse av den grundläggande 3D-rekonstruerade tarmslemhinnemodellen OBS: Hela proceduren måste utföras i en steril laminär flödeshuv. Alla steg i förfarandet med användning av cellinkubatorn innebär att odlingarna inkuberas vid 37 °C i en fuktad atmosfär som innehåller 5 % CO2 (om inte annat anges i protokollet). Förberedelse av de cellinjer som används i tarmmodellsystemetFrö L929 musfibroblastceller i en koncentration av 5 x 10<…

Representative Results

Den första viktiga aspekten är att bestämma acceptansen av den grundläggande 3D-tarmekvivalenta slemhinnan för experimentella ändamål. Detta utförs med den mest använda fläcken i histologiska och histopatologiska laboratorier, nämligen hematoxylin (fläckar kärnmaterial djupt blålila färg) och eosin (fläckar cytoplasmatiskt material i olika nyanser av rosa). H&E-färgningen utförs först på en obehandlad kontroll, som odlas under samma förhållanden och tidsram som de experimentella behandlingarna. Frå…

Discussion

Det grundläggande rekonstruerade modellsystemet för tarmslemhinnan som presenteras här (Figur 6) kombinerar fysiologisk komplexitet (mer fysiologiskt relevanta 3D-cellkulturer som innehåller ett Caco-2-monolager med ett ECM-rikt lamina propria-stöd som innehåller fibroblaster och monocyter) med experimentell enkelhet (med hjälp av kommersiella mänskliga cellinjer för att producera standardiserade och lätt repeterbara system)¹³. Som sådant anses detta modell…