Produzione di glucosio epatico, ureagenesia e lipolisi quantificate utilizzando il modello di fegato di topo perfuso

Summary

Qui, presentiamo un metodo robusto per la perfusione in situ del fegato di topo per studiare la regolazione acuta e diretta del metabolismo epatico senza disturbare l’architettura epatica ma in assenza di fattori extra-epatici.

Abstract

Il fegato ha numerose funzioni, tra cui il metabolismo dei nutrienti. A differenza di altri modelli di ricerca epatica in vitro e in vivo, il fegato perfuso isolato consente lo studio della biologia e del metabolismo epatico in tutto il fegato con un’architettura epatica intatta, separata dall’influenza di fattori extra-epatici. Le perfusioni epatiche sono state originariamente sviluppate per i ratti, ma il metodo è stato adattato anche ai topi. Qui descriviamo un protocollo per la perfusione in situ del fegato di topo. Il fegato viene perfuso anterogradamente attraverso la vena porta con tampone bicarbonato di Krebs-Henseleit ossigenato e l’output viene raccolto dalla vena cava inferiore sopraepatica con clampaggio della vena cava inferiore infraepatica per chiudere il circuito. Utilizzando questo metodo, gli effetti epatici diretti di un composto in esame possono essere valutati con una risoluzione temporale dettagliata. La funzionalità epatica e la vitalità sono stabili per almeno 3 ore, consentendo l’inclusione di controlli interni nello stesso esperimento. Le possibilità sperimentali che utilizzano questo modello sono numerose e possono dedurre informazioni sulla fisiologia epatica e sulle malattie del fegato.

Introduction

Il fegato è un organo essenziale nel metabolismo. Svolge un ruolo chiave nel controllo dell’equilibrio energetico di tutto il corpo regolando il metabolismo di glucosio, lipidi e aminoacidi. L’aumento delle malattie del fegato in tutto il mondo sta emergendo come un importante onere per la salute globale e sono necessarie maggiori conoscenze sulla fisiopatologia e sulle sue conseguenze per le funzioni epatiche.

Sono stati sviluppati vari modelli in vitro per la ricerca sul fegato a complemento degli studi in vivo. Gli epatociti primari isolati e coltivati da roditori ed esseri umani sono ampiamente utilizzati. Le cellule non parenchimali possono essere separate dagli epatociti utilizzando la centrifugazione differenziale e a gradiente, e la co-coltura di diversi tipi cellulari è utile per studiare il crosstalk intercellulare¹. Sebbene gli epatociti umani primari siano considerati il gold standard per testare la tossicità dei farmaci, diversi studi hanno dimostrato che gli epatociti si dedifferenziano rapidamente in coltura tissutale^con conseguente perdita delle funzioni epatiche ^2,3,4. La coltura di epatociti in un sistema sferoidale 3D migliora la dedifferenziazione, è più stabile e sembra imitare il fegato in vivo in misura maggiore rispetto ai tradizionali sistemi di coltura 2D⁵. Le fette di fegato tagliate con precisione sono un altro modello in vitro ben consolidato che mantiene intatta l’architettura tissutale e contiene le cellule non parenchimali presenti nel fegato⁶. I modelli in vitro più avanzati includono il fegato su chip⁷ e gli organoidi epatici⁸. Tuttavia, con tutti questi approcci, c’è una perdita di integrità strutturale e dinamica del flusso, incluso il flusso vettoriale della vena portale-epatica, che probabilmente influisce sulla generalizzabilità.

Il fegato di ratto perfuso isolato è stato descritto per la prima volta da Claude Bernard nel 1855 ed è ancora utilizzato in vari campi scientifici per studi di biologia epatica, tossicologia e fisiopatologia. I vantaggi del fegato perfuso rispetto ai modelli in vitro sopra menzionati includono il mantenimento dell’architettura epatica, del flusso vascolare, della polarità e della zonazione degli epatociti e delle interazioni tra epatociti e cellule non parenchimali. Rispetto agli studi in vivo, il fegato perfuso permette lo studio del metabolismo epatico in maniera isolata evitando fattori extra-epatici veicolati dal sangue e con un controllo completo sulle condizioni sperimentali. Nel corso degli anni sono state apportate diverse modifiche per migliorare il modello di perfusione epatica di ratto 10,11,12,13. Sebbene i topi siano stati utilizzati per studi isolati sul fegato perfuso, è disponibile meno letteratura. Qui, presentiamo un metodo per la perfusione in situ del fegato di topo mediante incannulamento della vena porta e della vena cava sopraepatica inferiore per studiare le risposte metaboliche acute e dirette ai substrati metabolici e agli ormoni misurate nell’effluente venoso epatico dal fegato di topo in tempo reale.

Protocol

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti con il permesso dell’Ispettorato danese per gli esperimenti sugli animali, del Ministero dell’Ambiente e dell’Alimentazione della Danimarca (permesso 2018-15-0201-01397) e del comitato etico locale in conformità con la direttiva UE 2010/63/UE, del National Institutes of Health (pubblicazione n. 85-3) e seguendo le linee guida della legislazione danese che disciplina la sperimentazione animale (1987). Questa è una procedura terminale e la causa della morte è il di…

Representative Results

È necessaria una linea di base costante per determinare se uno stimolo o un substrato porta al rilascio della molecola di interesse. La Figura 3A mostra un esempio di esperimento riuscito. La produzione di urea nel fegato perfuso viene misurata a intervalli di 2 minuti e indicata come media ± SEM. I periodi basali che precedono ciascuno dei due periodi di stimolazione sono costanti. La produzione media di urea durante i due periodi di stimolazione e le risp…

Discussion

Il fegato di topo perfuso isolato è un forte strumento di ricerca per lo studio delle dinamiche e dei meccanismi molecolari del metabolismo epatico. La possibilità di prelevare campioni minuto per minuto fornisce una valutazione dettagliata dell’effetto diretto di un composto in esame sul fegato. Rispetto agli studi in vivo, il fegato perfuso permette di studiare il metabolismo epatico in maniera isolata evitando fattori extra-epatici veicolati dal sangue e con un controllo completo sulle condizioni sperimenta…