Количественная оценка выработки глюкозы в печени, уреагенеза и липолиза с использованием модели перфузионной печени мышей

Summary

В данной работе мы представляем надежный метод перфузии печени мышей in situ для изучения острой и прямой регуляции метаболизма печени без нарушения печеночной архитектуры, но при отсутствии внепеченочных факторов.

Abstract

Печень выполняет множество функций, включая метаболизм питательных веществ. В отличие от других моделей исследования печени in vitro и in vivo , изолированная перфузионная печень позволяет изучать биологию и метаболизм печени в целом печени с интактной печеночной архитектурой, отделенной от влияния внепеченочных факторов. Перфузии печени были первоначально разработаны для крыс, но метод был адаптирован и к мышам. Здесь мы опишем протокол перфузии печени мыши in situ . Печень перфузируется антеградно через воротную вену оксигенированным бикарбонатным буфером Кребса-Хензелейта, а выход собирается из надпеченочной нижней полой вены с пережатием подпеченочной нижней полой вены для замыкания контура. С помощью этого метода можно оценить прямое воздействие исследуемого соединения на печень с подробным временным разрешением. Функция и жизнеспособность печени стабильны в течение, по крайней мере, 3 ч, что позволяет включить внутренний контроль в тот же эксперимент. Экспериментальные возможности с использованием этой модели многочисленны и могут помочь понять физиологию печени и ее заболевания.

Introduction

Печень является важным органом в обмене веществ. Он играет ключевую роль в контроле энергетического баланса всего организма, регулируя метаболизм глюкозы, липидов и аминокислот. Рост числа заболеваний печени во всем мире становится серьезным глобальным бременем для здравоохранения, и необходимо больше знаний о патофизиологии и ее последствиях для функций печени.

Для исследований печени были разработаны различные модели in vitro, дополняющие исследования in vivo. Широко используются выделенные и культивируемые первичные гепатоциты грызунов и человека. Непаренхиматозные клетки могут быть отделены от гепатоцитов с помощью дифференциального и градиентного центрифугирования, а совместное культивирование различных типов клеток полезно для изучения межклеточных перекрестных помех¹. Несмотря на то, что первичные гепатоциты человека считаются золотым стандартом для тестирования токсичности лекарств, несколько исследований показали, что гепатоциты быстро дедифференцируются в культуре тканей, что приводит к потере функций печени ^2,3,4. Культивирование гепатоцитов в 3D-сфероидной системе улучшает дифференцировку, более стабильно и, по-видимому, имитирует печень in vivo в большей степени, чем традиционные 2D-системы культивирования. Точно вырезанные срезы печени являются еще одной хорошо зарекомендовавшей себя моделью in vitro, которая сохраняет тканевую архитектуру нетронутой и содержит непаренхиматозные клетки, присутствующие в печени⁶. К более продвинутым моделям in vitro относятся печень на чипе⁷ и органоиды печени⁸. Однако при всех этих подходах происходит потеря структурной целостности и динамики потока, в том числе векторного потока в портально-печеночных венах, что, вероятно, влияет на обобщаемость.

Изолированная перфузионная печень крысы была впервые описана Клодом Бернаром в 1855 году и до сих пор используется в различных научных областях для изучения биологии, токсикологии и патофизиологии печени. Преимущества перфузии печени по сравнению с вышеупомянутыми моделями in vitro включают сохранение печеночной архитектуры, сосудистого потока, полярности и зональности гепатоцитов, а также взаимодействия между гепатоцитами и непаренхиматозными клетками. По сравнению с исследованиями in vivo, перфузионная печень позволяет изучать метаболизм печени изолированно, избегая внепеченочных факторов, переносимых кровью, и с полным контролем над условиями эксперимента. В течение^10,11,12,13 лет было сделано несколько модификаций для улучшения модели перфузии печени крыс. Несмотря на то, что для изолированных исследований перфузионной печени использовались мыши, литературы по ним меньше. В данной работе мы представляем метод перфузии печени мышей in situ путем канюляции воротной вены и надпеченочной полой вены для изучения острых и прямых метаболических реакций на метаболические субстраты и гормоны, измеренных в печеночном венозном стоке из печени мыши в режиме реального времени.

Protocol

Все эксперименты на животных проводились с разрешения Датской инспекции по экспериментам на животных, Министерства окружающей среды и продовольствия Дании (разрешение 2018-15-0201-01397) и местного комитета по этике в соответствии с директивой ЕС 2010/63/EU, Национальными институтами здравоохран…

Representative Results

Устойчивый базовый уровень необходим для того, чтобы определить, приводит ли стимул или субстрат к высвобождению интересующей молекулы. На рисунке 3А показан пример успешного эксперимента. Продукцию мочевины в перфузионной печени измеряют с интервал?…

Discussion

Изолированная перфузионная печень мыши является мощным исследовательским инструментом для изучения динамики и молекулярных механизмов печеночного метаболизма. Возможность поминутного отбора проб обеспечивает детальную оценку непосредственного воздействия исследуемого соединен?…