Summary
Ici, nous présentons une méthode de purification par affinité d’une enzyme fibrinolytique de Sipunculus nudus qui est simple, peu coûteuse et efficace.
Abstract
L’enzyme fibrinolytique de Sipunculus nudus (sFE) est un nouvel agent fibrinolytique qui peut à la fois activer le plasminogène en plasmine et dégrader directement la fibrine, montrant de grands avantages par rapport aux agents thrombolytiques traditionnels. Cependant, en raison du manque d’informations structurelles, tous les programmes de purification de la sFE sont basés sur des purifications chromatographiques en plusieurs étapes, trop compliquées et coûteuses. Ici, un protocole de purification d’affinité de sFE est développé pour la première fois basé sur une structure cristalline de sFE; il comprend la préparation de l’échantillon brut et de la colonne de chromatographie d’affinité matricielle lysine/arginine-agarose, la purification par affinité et la caractérisation de la sFE purifiée. En suivant ce protocole, un lot de sFE peut être purifié en 1 jour. De plus, la pureté et l’activité de la sFE purifiée augmentent à 92% et 19 200 U/mL, respectivement. Il s’agit donc d’une approche simple, peu coûteuse et efficace pour la purification de la sFE. Le développement de ce protocole est d’une grande importance pour l’utilisation ultérieure de la sFE et d’autres agents similaires.
Introduction
La thrombose est une menace majeure pour la santé publique, en particulier suite à la pandémie mondiale de Covid-19 1,2. Cliniquement, de nombreux activateurs du plasminogène (AP), tels que l’activateur du plasminogène de type tissulaire (tPA) et l’urokinase (Royaume-Uni), ont été largement utilisés comme médicaments thrombolytiques. Les AP peuvent activer le plasminogène des patients en plasmine active pour dégrader la fibrine. Ainsi, leur efficacité thrombolytique est fortement limitée par le statut plasminogènedes patients 3,4. Les agents fibrinolytiques, tels que la plasmine métalloprotéinase et la sérine plasmine, sont un autre type de médicament thrombolytique clinique qui comprend également des enzymes fibrinolytiques (FE) telles que la plasmine, qui peuvent dissoudre directement les caillots mais sont rapidement inactivées par divers inhibiteurs de la plasmine5. Par la suite, un nouveau type d’agent fibrinolytique a été signalé qui peut dissoudre le thrombus non seulement en activant le plasminogène en plasmine, mais aussi en dégradant directement la fibrine 6-l’enzyme fibrinolytique de l’ancien ver d’arachide Sipunculus nudus (sFE)6. Cette bifonction confère à la sFE d’autres avantages par rapport aux médicaments thrombolytiques traditionnels, en particulier en termes de statut plasminogène anormal. Par rapport à d’autres agents fibrinolytiques bifonctionnels 7,8,9, la sFE présente plusieurs avantages, y compris la sécurité, par rapport aux agents dérivés non alimentaires pour le développement de médicaments, en particulier pour les médicaments oraux. En effet, la biosécurité et la biocompatibilité de Sipunculus nudus ont été bien établies10.
Semblable aux autres agents fibrinolytiques naturels isolés à partir de micro-organismes, de vers de terre et de champignons, la purification de la sFE de S. nudus est très compliquée et comprend plusieurs étapes, telles que l’homogénéisation des tissus, la précipitation du sulfate d’ammonium, le dessalement, la chromatographie par échange d’anions, la chromatographie d’interaction hydrophobe et le tamisage moléculaire10,11,12. Un tel système de purification dépend non seulement de compétences compétentes et de matériaux coûteux, mais nécessite également plusieurs jours pour terminer l’ensemble de la procédure. Par conséquent, un programme de purification simple de la sFE est d’une grande importance pour le développement ultérieur de la sFE. Heureusement, deux cristaux de sFE (PDB: 8HZP; PDB : 8HZO) ont été obtenus avec succès (voir Fichier supplémentaire 1 et Fichier supplémentaire 2). Grâce à des analyses structurelles et à des expériences d’amarrage moléculaire, nous avons constaté que le noyau catalytique de la sFE pouvait spécifiquement se lier à des cibles contenant des résidus d’arginine ou de lysine.
Ici, un système de purification par affinité a été proposé pour la première fois, basé sur la structure cristalline de la sFE. En suivant ce protocole, la sFE hautement pure et hautement active pourrait être purifiée à partir des extraits bruts en une seule étape de purification par affinité. Le protocole développé ici est non seulement important pour la préparation à grande échelle de sFE, mais peut également être appliqué pour la purification d’autres agents fibrinolytiques.
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Protocol
1. Préparation
- Traitement des échantillons
- Disséquer soigneusement S. nudus frais (100 g) et recueillir l’intestin et son liquide interne.
- Ajouter 300 mL de tampon Tris-HCl (0,02 M, pH 7,4) pour l’homogénéisation (1 000 tr/min, 60 s).
- Congeler-décongeler l’homogénat 3x.
- Centrifuger l’échantillon (10,956 × g, 0,5 h, 4 °C) et prélever le surnageant. Conserver l’échantillon à 4 °C jusqu’à nouvelle utilisation.
- Précipitation des protéines
- Mélanger le surnageant avec une solution saturée de sulfate d’ammonium (neuf volumes) et laisser reposer le mélange pendant 12 h à 4 °C.
REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici et poursuivi plus tard. - Centrifugeuse (10 956 × g, 0,5 h, 4 °C) pour obtenir le précipité protéique ; Conservez-le à 4 °C pour une utilisation ultérieure.
- Mélanger le surnageant avec une solution saturée de sulfate d’ammonium (neuf volumes) et laisser reposer le mélange pendant 12 h à 4 °C.
- Suspension protéique
- Resuspendre le précipité protéique avec 30 mL de tampon Tris-HCl (0,02 M, pH 7,4). Conservez cette solution de protéines brutes à 4 °C pour une utilisation ultérieure.
2. Chromatographie d’affinité
- Filtration en solution
- Filtrer la solution de protéines brutes à travers une membrane filtrante de 0,22 μm. Conserver cet échantillon à 4 °C pour une utilisation ultérieure.
- Garnissage de colonne
- Emballer la colonne de chromatographie matricielle arginine-agarose et la colonne de chromatographie matricielle lysine-agarose en chargeant une quantité appropriée de milieu matriciel lysine-agarose et de milieu matriciel arginine-agarose dans des colonnes de chromatographie vides de 5 mL.
REMARQUE: La colonne peut être stockée à 2-8 °C, avec la matrice immergée dans le tampon de stockage (20% d’éthanol).
- Emballer la colonne de chromatographie matricielle arginine-agarose et la colonne de chromatographie matricielle lysine-agarose en chargeant une quantité appropriée de milieu matriciel lysine-agarose et de milieu matriciel arginine-agarose dans des colonnes de chromatographie vides de 5 mL.
- Purification par affinité
- Équilibrer d’abord la colonne de chromatographie d’affinité avec ddH2O(1 mL/min, 10 volumes sur colonne), suivie d’un tampon Tris-HCl (0,02 M, pH 8,0, 1 mL/min, 5 volumes de colonne).
- Charger l’échantillon de solution protéique sur la colonne prééquilibrée (1 mL/min, 1/3 de volume de colonne).
NOTE: Le volume de chargement de l’échantillon dépend de la concentration de sFE. - Lavez la colonne avec un tampon Tris-HCl (0,02 M, pH 8,0, cinq volumes de colonne).
- Éluer successivement la colonne avec 0,15 M, 0,25 M, 0,35 M, 0,45 M, 0,55 M et 0,65 M NaCl (1 mL/min, cinq volumes de colonne).
- Recherchez le pic d’élution qui devrait apparaître dans l’élution de NaCl de 0,15 M, puis recueillez les fractions dans des tubes de 5 mL.
- Concentrer l’échantillon d’élution à l’aide d’un filtre ultracentrifuge de 3 kD (3 944 × g, 1,5 h, 4 °C). Conservez cet échantillon à -80 °C pour une utilisation ultérieure.
3. Évaluation de la pureté
- Préparation de gel d’électrophorèse sur gel de polyacrylamide de dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE)
- Préparer le gel SDS-PAGE selon la méthode de Laemmli en utilisant 5% de gel concentré et 12% de gel de séparation13.
- Électrophorèse
- Mélanger l’échantillon (15 μL) avec 5x tampon de charge protéique SDS-PAGE (1/4 de volume), chauffer dans de l’eau bouillante pendant 5 min, charger sur le gel SDS-PAGE et faire fonctionner le gel à 80 V, 60 mA pendant 1,5 h.
- Analyse
- Après l’électrophorèse, colorez le gel avec un kit de coloration d’argent, selon le protocole du fabricant, et observez le gel coloré à l’aide d’un système d’imagerie chimiluminescent.
- Analysez la pureté de la protéine cible à l’aide de la formule suivante : pureté de la protéine cible = valeur d’intensité de la protéine cible/valeur d’intensité de la protéine totale.
4. Évaluation de l’activité fibrinolytique
- Préparation de plaque de fibrine
- Préparer la solution de fibrinogène en mélangeant 25 mg de fibrinogène avec 1,25 mL de solution saline physiologique.
- Préparer la solution de thrombine en mélangeant complètement 100 U de thrombine avec 1,05 mL de solution saline physiologique.
- Préparer la solution d’agarose en ajoutant 0,5 g d’agarose à 22,5 mL de tampon Tris-HCl (0,02 mol/L, pH 7,4). Mélanger et chauffer la solution d’agarose à 100 °C jusqu’à dissolution complète.
- Refroidir la solution d’agarose jusqu’à environ 50 °C et ajouter la solution de fibrinogène. Ensuite, ajoutez immédiatement la solution de thrombine, mélangez-les rapidement et versez-les dans un plat de culture de 60 mm.
- Chargement
- Poinçonner des puits de 3 mm sur les plaques de fibrine préparées à l’aide d’un foreur stérile et remplir les puits avec des échantillons de 10 μL.
- Analyse
- Après 18 h d’incubation à 37 °C, mesurer l’activité fibrinolytique en calculant la taille de leurs zones de dégradation. Activité fibrinolytique = (taille de la zone de l’échantillon / taille de la zone de l’urokinase) x 100 U. Taille de la zone = diamètre x diamètre.
REMARQUE : Un tampon physiologique salin, une protéine brute (échantillon obtenu à l’étape 1.3.1 du protocole) et l’urokinase ont été utilisés respectivement pour le témoin blanc, le témoin négatif et le témoin positif. Par rapport à l’urokinase, nous avons constaté que l’activité fibrinolytique de la sFE purifiée était de ~19 200 U/mL.
- Après 18 h d’incubation à 37 °C, mesurer l’activité fibrinolytique en calculant la taille de leurs zones de dégradation. Activité fibrinolytique = (taille de la zone de l’échantillon / taille de la zone de l’urokinase) x 100 U. Taille de la zone = diamètre x diamètre.
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Representative Results
À la suite de ce protocole, des lysats tissulaires bruts ont été extraits, des colonnes de chromatographie de chromatographie matricielle arginine-agarose et lysine-agarose ont été construites, du sFE purifié a été obtenu et la pureté et l’activité fibrinolytique de la sFE purifiée ont été mesurées par SDS-PAGE et des plaques de fibrine, respectivement.
Après centrifugation, le surnageant recueilli était un liquide visqueux transparent bronzé. Les précipitations ont commencé lorsque ce surnageant a été mélangé à une solution saturée de sulfate d’ammonium (neuf volumes). Après 12 heures d’arrêt, un précipité lourd s’est formé au fond du tube. Lorsqu’il a été remis en suspension avec un tampon Tris-HCl, le précipité protéique a disparu rapidement et s’est dissous dans le tampon, apparaissant comme un liquide jaune pâle transparent.
Lorsque la solution protéique a été chargée sur la colonne d’affinité de la matrice arginine-agarose, un pic évident (pic 1, pic traversant) est apparu à ~40 min et a cessé d’éluer à ~66 min. Dans l’étape d’élution du gradient, lorsqu’il est élué avec 0,15 M NaCl, un pic évident (pic 2, pic d’élution) apparaît à ~94 min et cesse d’éluer à ~110 min. Aucun pic d’élution évident n’est apparu dans les autres stades d’élution (0,25 M, 0,35 M, 0,45 M, 0,55 M et 0,65 M NaCl) (figure 1A). Dans cette étude, nous avons réutilisé la colonne d’affinité de la matrice arginine-agarose jusqu’à 10 fois et constaté que la performance de la colonne n’était pas significativement modifiée.
Lorsque la solution protéique a été chargée dans la colonne d’affinité de la matrice lysine-agarose, un pic évident (pic 1, pic traversant) est apparu à ~38 min et a cessé d’éluer à ~60 min. Dans l’étape d’élution du gradient, lorsqu’il est élué avec 0,15 M NaCl, un pic évident (pic 2, pic d’élution) apparaît à ~80 min et cesse d’éluer à ~86 min. Aucun pic d’élution évident n’est apparu dans les autres stades d’élution (0,25 M, 0,35 M, 0,45 M, 0,55 M et 0,65 M NaCl (figure 1B). Les profils d’élution de la colonne d’affinité de la matrice arginine-agarose et de la colonne d’affinité de la matrice lysine-agarose étaient similaires. Comme mentionné précédemment, la réutilisation de la colonne d’affinité de la matrice arginine-agarose jusqu’à 10 fois n’a pas modifié les performances de cette colonne.
De la sFE purifiée (10 μL, échantillon de pic d’élution, pic 2) a été ajoutée à la plaque de fibrine préparée. De plus, 10 μL d’urokinase (100 U), 10 μL de tampon physiologique saline et 10 μL de protéines brutes (échantillon obtenu à l’étape 1.3.1 du protocole) ont été utilisés pour le témoin positif, le témoin blanc et le témoin négatif, respectivement. Après 18 h d’incubation, deux plaques de fibrine ont présenté des résultats similaires : une zone de lyse (1,3 cm de diamètre) est apparue dans le témoin urokinase ; Aucune zone de lyse n’a été observée dans le tampon physiologique salin; une zone de lyse (2,1 cm de diamètre) est apparue dans le puits de protéines brutes; et une zone de lyse (1,8 cm de diamètre) est apparue dans le puits sFE purifié (Figure 2). Par rapport à l’urokinase, nous avons constaté que l’activité fibrinolytique de la sFE purifiée était de ~19 200 U/mL. Comme l’échantillon de pic d’élution a été ajusté au même volume que celui de l’échantillon chargé sur la colonne d’affinité, le taux de récupération de la colonne d’affinité est indiqué par la taille (diamètre x diamètre) de la zone de lyse sur la plaque de fibrine. Le taux de récupération de la colonne affinité était de ~73,5 %.
La protéine brute (échantillon obtenu à l’étape 1.3.1 du protocole) et la sFE purifiée (échantillon de pic d’élution, pic 2) ont été utilisées pour l’analyse de la pureté. Après SDS-PAGE et la coloration, trois bandes protéiques majeures (25, 26 et 27 kD) et six bandes mineures (20, 24, 28, 35, 40 et 45 kD) ont été présentées dans la protéine brute. Une bande majeure (27 kD) et deux bandes mineures (26 et 28 kD) ont été présentées dans la sFE purifiée (Figure 3). Grâce à l’analyse des valeurs de gris, nous avons constaté que la pureté de la sFE purifiée était aussi élevée que ~92%.
Figure 1 : Le profil de purification par affinité. (A) L’échantillon brut de sFE a été purifié par purification par affinité de matrice arginine-agarose. Un pic d’écoulement évident est apparu à ~40 min et a cessé d’éluer à ~66 min. Un pic d’élution évident est apparu à ~94 min et a cessé d’éluer à ~110 min. (B) L’échantillon brut de sFE a été purifié par purification par affinité de matrice lysine-agarose. Un pic d’écoulement évident est apparu à ~38 min et a cessé d’éluer à ~60 min. Un pic d’élution évident est apparu à ~80 min et a cessé d’éluer à ~86 min. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Évaluation de l’activité fibrinolytique. Des échantillons ont été ajoutés à la plaque de fibrine et leur activité fibrinolytique a été mesurée et évaluée par leurs zones de dégradation sur la plaque après 18 h. Les échantillons traités différemment sont indiqués par des chiffres arabes rouges. (A) L’activité fibrinolytique de la sFE purifiée par colonne d’affinité matricielle arginine-agarose. #1, 100 U d’urokinase; #2, tampon physiologique salin; #3, protéine brute (échantillon obtenu à l’étape 1.3.1 du protocole); #4, sFE purifiée (échantillon de pic d’élution, pic 2). (B) L’activité fibrinolytique de la sFE purifiée par la colonne d’affinité matricielle lysine-agarose. #1, 100 U d’urokinase; #2, tampon physiologique salin; #3, protéine brute (échantillon obtenu à l’étape 1.3.1 du protocole); #4, sFE purifiée (échantillon de pic d’élution, pic 2). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Analyse de la pureté. La pureté de la sFE purifiée a été analysée par SDS-PAGE. (A) La pureté de la sFE purifiée par la colonne d’affinité de matrice arginine-agarose. M : marqueur protéique ; Voie 1 : protéines brutes (échantillon obtenu à l’étape 1.3.1 du protocole); voie 2: sFE purifiée (échantillon de pic d’élution, pic 2). (B) La pureté de la sFE purifiée par la colonne d’affinité de la matrice lysine-agarose. M : marqueur protéique ; Voie 1 : protéines brutes (échantillon obtenu à l’étape 1.3.1 du protocole); voie 2: sFE purifiée (échantillon de pic d’élution, pic 2). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Fichier supplémentaire 1: 8ZHP: Structure cristalline de snFPITE-n1. Un rapport de validation structurelle par rayons X PDB. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Fichier supplémentaire 2: 8ZHO: Structure cristalline de snFPITE-n2. Un rapport de validation structurelle par rayons X PDB. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
En raison de l’indisponibilité de la séquence génétique exacte de la sFE, la sFE actuellement utilisée a été extraite de S. nudus14 frais. De plus, les procédures de purification de la sFE rapportées dans la littérature étaient compliquées et coûteuses, car elles étaient basées sur certaines caractéristiques générales de la sFE, telles que le poids moléculaire, le point isoélectrique, la force ionique et la polarité15,16. Aucun protocole de purification par affinité de la sFE n’a été signalé à ce jour. Dans cette étude, un protocole de purification par affinité de la sFE a été développé avec succès sur la base de la connaissance de sa structure cristalline. Comparée aux méthodes de purification rapportées, cette méthode de purification par affinité était facile à utiliser, peu coûteuse et conviviale. De plus, un taux de récupération considérablement plus élevé de la sFE active a été observé en utilisant cette méthode.
Bien que de nombreuses méthodes de purification par affinité des enzymes fibrinolytiques aient été rapportées, elles étaient basées sur les anticorps17, les inhibiteurs 18, les ligands et les récepteurs16. La préparation de ces anticorps, inhibiteurs, ligands et récepteurs est techniquement difficile et laborieuse. De plus, des efforts supplémentaires sont nécessaires pour conjuguer ces molécules à la matrice. En revanche, la matrice arginine-agarose et la matrice lysine-agarose sont des matériaux commerciaux, prêts à l’emploi, très stables et faciles à mettre à l’échelle19. Récemment, la matrice lysine-agarose a été utilisée pour la purification par affinité du plasminogène20,21; Cependant, le plasminogène est la pro-enzyme de la plasmine, pas une forme active15. Il n’est pas certain que la matrice lysine-agarose soit adaptée à la purification par affinité de la plasmine. Théoriquement, la sFE purifiée en utilisant la matrice arginine-agarose et la matrice lysine-agarose dans cette étude n’est que la forme active, car le modèle cristallin a indiqué que seules les triades catalytiques de sFE peuvent interagir avec les résidus d’arginine et de lysine. Par conséquent, ce protocole pourrait être appliqué à la purification d’autres sérines plasmines, accélérant ainsi le développement d’autres médicaments à base de sérine plasmine.
Parce que la liaison entre sFE et la colonne d’affinité n’est pas très forte, le maintien d’une concentration exacte de NaCl et d’une vitesse d’élution appropriée est très critique pour une purification réussie. Un autre facteur clé est le pH du système, qui affecte gravement la purification. Ces trois paramètres ont été optimisés par nos soins. Certes, le taux de récupération de la sFE active dans cette étude était relativement faible et peut avoir été limité par le faible nombre de résidus d’arginine ou de résidus de lysine disponibles à la surface de la matrice d’agarose. Par conséquent, le lien entre la matrice lysine/arginine et l’agarose doit être allongé pour améliorer son taux de récupération. En attendant, nous ne pouvions pas exclure la possibilité que d’autres protéines de sérine avec une triade catalytique similaire à celle de la sFE soient éluées sous ce système. Il est donc préférable d’ajouter une technologie de purification basée sur le poids moléculaire, telle que l’ultrafiltration, pour séparer les autres protéines de sérine de la sFE. De même, de nombreux autres problèmes tels que l’amélioration de la capacité de liaison, la prolongation de la durée de vie et la simplification de la procédure devraient être abordés dans les travaux futurs par des stratégies correspondantes (par exemple, le remplacement de l’arginine/lysine par la poly arginine/lysine et la modification de l’agent de liaison).
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
Cette recherche a été financée par le Bureau de la science et de la technologie de la ville de Xiamen (3502Z20227197) et le Bureau de la science et de la technologie de la province du Fujian (n ° 2019J01070, n ° 2021Y0027).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30% Acrylamide-Bisacrylamide (29:1) | Biosharp | ||
| 2-Mercaptoethanol | Solarbio | ||
| Agarose G-10 | Biowest | ||
| Ammonium persulfate | SINOPHARM | ||
| Ammonium sulfate | SINOPHARM | ||
| Arginine-Sepharose 4B | Solarbio | Arginine-agarose matrix | |
| Bromoxylenol Blue (BPB) | Solarbio | ||
| Fast Silver Stain Kit | Beyotime | ||
| Fibrinogen | Merck | ||
| Glycine | Solarbio | ||
| Hydrochloric acid | SINOPHARM | ||
| Kinase | RHAWN | ||
| Lysine-Sepharose 4B | Solarbio | Lysine-agarose matrix | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | ||
| Prestained Color Protein Marker (10-170 kD) | Beyotime | ||
| Sodium chloride | SINOPHARM | ||
| Sodium Dodecyl Sulfonate (SDS) | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium hydroxide | SINOPHARM | ||
| Thrombin | Meilunbio | ||
| Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane | Solarbio | ||
| Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane Hydrochloride | Solarbio | ||
| Equipment | |||
| AKT Aprotein Purification System pure | GE | ||
| Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer MLS-3750 | SANYO | ||
| Chemiluminescence Imaging System | GE | ||
| Constant Flow Pump BT-100 | QITE | ||
| Constant Temperature Incubator | JINGHONG | ||
| Desktop Refrigerated Centrifuge 3-30KS | SIGMA | ||
| DHG Series Heating and Drying Oven DGG-9140AD | SENXIN | ||
| Electric Glass Homogenizer DY89-II | SCIENTZ | ||
| Electronic Analytical Balance | DENVER | ||
| Electro-Thermostatic Water Bath DK-S12 | SENXIN | ||
| Horizontal Decolorization Shaker | Kylin-Bell | ||
| Ice Machine AF 103 | Scotsman | ||
| KQ-500E Ultrasonic Cleaner | ShuMei | ||
| Magnetic Stirrer | Zhi wei | ||
| Micro Refrigerated Centrifuge H1650-W | Cence | ||
| Microwave Oven | Galanz | ||
| Milli-Q Reference | Millipore | ||
| Pipettor | Thermo Fisher Scientific | ||
| Precision Desktop pH Meter | Sartorious | ||
| Small-sized Vortex Oscillator | Kylin-Bell | ||
| Vertical Electrophoresis System | Bio-Rad | ||
| Consumable Material | |||
| 200 µL PCR Tube (200 µL) | Axygene | ||
| Centrifuge Tube (1.5 mL) | Biosharp | ||
| Centrifuge Tube (5 mL) | Biosharp | ||
| Centrifuge Tube (50 mL) | NEST | ||
| Centrifuge Tube (7 mL) | Biosharp | ||
| Culture Dish (60 mm) | NEST | ||
| Filter Membrane (0.22 µm) | Millex GP | ||
| Parafilm | Bemis | ||
| Pipette Tip (1 mL ) | KIRGEN | ||
| Pipette Tip (10 µL) | Axygene | ||
| Pipette Tip (200 µL) | Axygene | ||
| Special Indicator Paper | TZAKZY | ||
| Ultra Centrifugal Filter Unit (15 mL 3 KDa) | Millipore | ||
| Ultra Centrifugal Filter Unit (4 mL 3 KDa) | Millipore | ||
| Universal pH Indicator | SSS Reagent |
References
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