Summary

ניקוז גרורות בלוטות הלימפה מודל להערכת הדינמיקה של תאי CD8+ T ספציפיים לאנטיגן במהלך הגידול

Published: January 26, 2024
doi:

Summary

התכנון הניסיוני המוצג כאן מספק מודל רבייה שימושי למחקרים של תאי CD8+ T ספציפיים לאנטיגן במהלך גרורות בלוטות הלימפה (LN), אשר אינו כולל את ההפרעה של תאי CD8+ T עוברי אורח.

Abstract

תאי CD8+ T ספציפיים לאנטיגן הגידול מבלוטות לימפה מתנקזות מקבלים חשיבות מצטברת בהגברת התגובה החיסונית נגד הגידול במהלך הגידול. עם זאת, במקרים רבים, תאים סרטניים יוצרים מוקדים גרורתיים בבלוטות הלימפה לפני גרורות נוספות לאיברים מרוחקים. באיזו מידה התגובות המקומיות והשיטתיות של תאי CD8+ T הושפעו מגרורות LN נותרה מעורפלת. לשם כך, הקמנו מודל גרורות LN מורין בשילוב עם קו תאי מלנומה B16F10-GP המבטא את הניאואנטיגן החלופי הנגזר מנגיף כוריאומנינגיטיס לימפוציטית (LCMV), גליקופרוטאין (GP) ועכברים טרנסגניים P14 בעלי קולטני תאי T (TCRs) ספציפיים לפפטיד GP33-41 שמקורו ב-GP המוצג על ידי מולקולת קומפלקס היסטותאימות גדולה (MHC) מסוג I H-2Db. פרוטוקול זה מאפשר לחקור תגובות ספציפיות לתאי CD8+ T של אנטיגן במהלך גרורות LN. בפרוטוקול זה, עכברי C57BL/6J הושתלו תת עורית עם תאי B16F10-GP, ולאחר מכן העברה מאומצת עם תאי P14 נאיביים. כאשר הגידול התת עורי גדל לקוטר של כ-5 מ”מ, הגידול הראשוני נכרת, ותאי B16F10-GP הוזרקו ישירות לבלוטת הלימפה המנקזת את הגידול (TdLN). לאחר מכן, הדינמיקה של תאי CD8+ T נוטרה במהלך תהליך גרורות LN. באופן קולקטיבי, מודל זה סיפק גישה לחקור במדויק את התגובה החיסונית הספציפית לאנטיגן CD8+ T של תאי T במהלך גרורות LN.

Introduction

אימונותרפיה לסרטן, במיוחד חסימת נקודות בקרה חיסוניות (ICB), חוללה מהפכה בטיפול בסרטן1. ICB חוסם את קולטני החיסון המעכבים (כגון PD-1, Tim-3, LAG-3 ו- TIGIT), אשר באים לידי ביטוי גבוה בתאי CD8+ T מותשים במיקרו-סביבה של הגידול (TME), מה שמוביל להתחדשות של תאי CD8+ T מותשים2. בהתחשב בהטרוגניות של תאי CD8+ T מותשים, עדויות מצטברות גילו כי תאי CD8+ T ספציפיים לגידול שמקורם בפריפריה, כולל ניקוז בלוטת הלימפה (dLN), אך לא ב- TME, מתווכים את היעילות של ICB 3,4,5,6,7,8. לאחרונה, TdLN נגזר TCF-1+TOX זיכרון ספציפי לגידול CD8+ תאי T (TdLN-TTSM) אושר להיות המגיבים המקוריים ICB אשר מגלמים מספר תכונות פונקציונליות של תאי זיכרון T קונבנציונאלי יכול להרחיב עוד יותר להתמיין לתאים מותשים צאצאים עם טיפול ICB9. בסך הכל, ממצאים אלה איששו את החשיבות של LN בהגברת חסינות נגד גידולים.

בלוטת הלימפה מתפקדת כמקום קריטי בהקלת ההכנה וההפעלה של תאי CD8+ T ספציפיים לגידול על ידי מתן בסיס מבני כמו גם אותות ביולוגיים10. מספר סוגים של תאים סרטניים זורעים לעתים קרובות בלוטת לימפה של זקיף (SLN, ה- LN הראשון המנקז גידול ראשוני) לפני הפצה שיטתית11. נוכחות גרורות SLN קשורה לתוצאות גרועות בסרטן אנושי ומודלים פרה-קליניים הראו כי תאי גידול ב- TdLN יכולים להתפשט לאיברים מרוחקים דרך כלי הלימפה וכלי הדם של הצומת 12,13,14,15. ביופסיית SLN מייצגת כעת הליך סטנדרטי המנחה החלטות טיפול עוקבות בסוגי גידולים מוצקים רבים שיכולים למנוע כריתה מיותרת של LN 16,17 בלתי מעורב. אפילו לגבי LN המעורב, זה עדיין שנוי במחלוקת אם ומתי יש צורך בכריתה כירורגית מכיוון שמספר מחקרים הוכיחו כי הסרת LN אזורי לא הציגה הישרדות כוללת משופרת בהשוואה לאלה שקיבלו קרינה או טיפול סיסטמי ללא כריתת LN אזורית 18,19. פרשנות אחת היא כי LN גרורתי (mLN) עם מחלה מיקרוסקופית עשוי לשמור על יכולת מסוימת לחנך תאים חיסוניים ולספק כמה יתרונות טיפוליים. לכן, חשוב ביותר להבהיר כיצד גרורות LN משפיעות על התגובה החיסונית נגד הגידול, במיוחד על התכונות והתפקודים של TdLN-TTSM.

עד כה, נתונים פרה-קליניים וקליניים כאחד חשפו כמה שינויים מבניים ותאיים ב-mLN20. עם זאת, השינויים הדינמיים של תאי CD8+ T ספציפיים לגידול במהלך גרורות LN לא תוארו. לכן, פיתוח מודל משכנע של גרורות LN נדרש לחקירה נוספת. ואכן, מספר מחקרים דיווחו על מודלים של עכברי mLN בדרכים שונות 14,21,22. לדוגמה, גרורות ספונטניות ב- LN בבית השחי בוצעו באמצעות השתלת תאי סרטן שד 4T1 לתוך כרית שומן החלב22. במחקר אחר, Reticker-Flynn et al. יצרו שורות תאי מלנומה עם שכיחות גבוהה של התפשטות מגידול ראשוני תת-עורי ל- LNs באמצעות חיסון סדרתי של תאי גידול בתרבית מרקמות mLN מנותקות (תשעה סבבים)14. מודל נפוץ נוסף הוכן על ידי הזרקת תאי גידול לתוך כרית כף הרגל והמוקדים הגרורתיים ייווצרו בפופליטל LN22. יש לציין כי קשה להעריך את נקודות הזמן המדויקות של ההתערבות מכיוון שגרורות LN במודלים אלה אינן תמיד נאמנות.

במחקר הנוכחי, מודל גרורתי LN מורין הוקם באמצעות הזרקה intranodal של B16F10-GP תאים23,24, שנוצר על ידי החדרה בתיווך CRISPR / Cas9 של רצף הגן גליקופרוטאין וירוס LCMV (GP) לתוך הגנום של B16F10 קותא 9. לאחר מכן, עכברים אלה הועברו עם תאי P14 אשר מכילים קולטני תאי T טרנסגניים (TCRs) לזהות באופן ספציפי את H-2Db GP33-41 אפיטופ25,26 ואת הדינמיקה המערכתית והמקומית של תאי CD8+ T ספציפיים אנטיגן במהלך גרורות LN ניתן לחקור. תכנון הניסוי שלנו מספק מודל שימושי לחקר תגובות חיסוניות, במיוחד תאי CD8+ T ספציפיים לאנטיגן במהלך גרורות LN אשר אינו כולל את ההפרעה של תאי CD8+ T של צופה מהצד. תוצאות אלה ישפיעו על אפשרויות הטיפול הקליני האם להסיר או לשמור את ה- mLN וישפכו אור חדש על המניפולציה של mLN כדי להשיג יתרונות טיפוליים מקסימליים.

Protocol

עכברי C57BL/6J (המכונים עכברי B6) ועכברי P14 טרנסגניים נאיביים 9,27 היו בני 6-10 שבועות במשקל 18-22 גרם. הן זכר והן נקבה נכללו ללא אקראיות או סינוור. כל המחקרים בבעלי חיים נערכו בהתאם להנחיות הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של האוניברסיטה החקלאית של צ’ינגדאו. <p …

Representative Results

התרשים הסכמטי של תכנון ניסויי זה מוצג באיור 1A. סך של 5 x 105 תאי B16F10-GP ב 100 μL של PBS הושתלו תת עורית (s.c.) באזור המפשעה הדו-צדדי של עכברי CD45.2 C57BL/6J. לאחר 7 ימים, עכברים נושאי גידול אלה הוזרקו תוך צפקית (כלומר) עם 4 מ”ג CTX, ולאחר מכן העברה מאומצת של 5 x 105 CD45.1 + P14 תאים באמצעו?…

Discussion

במהלך הגידול, תאים מציגי אנטיגן (APCs) בולעים אנטיגנים סרטניים ונודדים ל- TdLN שם הם ראשונים תאי CD8+ T. לאחר הפריימינג וההפעלה, תאי T CD8+ עוזבים את ה- TdLN וחודרים לגידול כדי להרוג תאי גידול10. באמצעות כריתת TdLN ומתן FTY720 אשר חוסמים את יציאת תאי החיסון מאיברי הלימפה, מספר מחקרים ה…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע לחוקרים צעירים מצטיינים של סין (מס ‘82122028 ל- LX), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס ‘82173094 ל- LX), הקרן למדעי הטבע של צ’ונג צ’ינג (מס ‘2023NSCQ-BHX0087 ל- SW).

Materials

1.5 mL centrifuge tube KIRGEN KG2211
100 U insulin syringe BD Biosciences  320310
15 mL conical tube  BEAVER  43008
2,2,2-Tribromoethanol (Avertin)  Sigma  T48402-25G 
2-Methyl-2-butanol Sigma 240486-100ML 
70 μm nylon cell strainer BD Falcon  352350
APC anti-mouse CD45.1  BioLegend  110714 Clone:A20 
B16-GP cell line Beijing Biocytogen Co.Ltd, China Custom
BSA-V (bovine serum albumin)  Bioss bs-0292P
cell culture dish BEAVER  43701/43702/43703 
centrifuge Eppendorf 5810R-A462/5424R 
cyclophosphamide Sigma  C0768-25G 
Cyclophosphamide (CTX) Sigma PHR1404
Dulbecco's Modified Eagle Medium  Gibco  C11995500BT 
EDTA Sigma EDS-500g 
FACS tubes BD Falcon 352052
fetal bovine serum  Gibco 10270-106
flow cytometer BD FACSCanto II
hemocytometer PorLab Scientific HM330
isoflurane RWD life science  R510-22-16 
KHCO3  Sangon Biotech  A501195-0500 
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation  Life Technologies  L10199 
needle carrier  RWD Life Science  F31034-14 
NH4Cl  Sangon Biotech A501569-0500 
paraformaldehyde Beyotime P0099-500ml 
PE anti-mouse TCR Vα2 BioLegend 127808 Clone:B20.1 
Pen Strep Glutamine (100x) Gibco 10378-016
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a  BioLegend 100734 Clone:53-6.7
RPMI-1640 Sigma R8758-500ML
sodium azide Sigma S2002 
surgical forceps RWD Life Science  F12005-10
surgical scissors RWD Life Science  S12003-09 
suture thread RWD Life Science F34004-30 
trypsin-EDTA Sigma T4049-100ml

References

  1. Morad, G., Helmink, B. A., Sharma, P., Wargo, J. A. Hallmarks of response, resistance, and toxicity to immune checkpoint blockade. Cell. 184 (21), 5309-5337 (2021).
  2. Korman, A. J., Garrett-Thomson, S. C., Lonberg, N. The foundations of immune checkpoint blockade and the ipilimumab approval decennial. Nat Rev Drug Discov. 21 (7), 509-528 (2022).
  3. Chamoto, K., et al. Mitochondrial activation chemicals synergize with surface receptor PD-1 blockade for T cell-dependent antitumor activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (5), E761-E770 (2017).
  4. Spitzer, M. H., et al. Systemic immunity is required for effective cancer immunotherapy. Cell. 168 (3), 487-502 (2017).
  5. Yost, K. E., et al. Clonal replacement of tumor-specific T cells following PD-1 blockade. Nat Med. 25 (8), 1251-1259 (2019).
  6. Wu, T. D., et al. Peripheral T cell expansion predicts tumour infiltration and clinical response. Nature. 579 (7798), 274-278 (2020).
  7. Connolly, K. A., et al. A reservoir of stem-like cd8(+) t cells in the tumor-draining lymph node preserves the ongoing antitumor immune response. Sci Immunol. 6 (64), eabg7836 (2021).
  8. Schenkel, J. M., et al. Conventional type I dendritic cells maintain a reservoir of proliferative tumor-antigen specific Tcf-1+ CD8+ T cells in tumor-draining lymph nodes. Immunity. 54 (10), 2338-2353 (2021).
  9. Huang, Q., et al. The primordial differentiation of tumor-specific memory cd8(+) t cells as bona fide responders to pd-1/pd-l1 blockade in draining lymph nodes. Cell. 185 (22), 4049-4066 (2022).
  10. Kanda, Y., Okazaki, T., Katakai, T. Motility dynamics of T cells in tumor-draining lymph nodes: A rational indicator of antitumor response and immune checkpoint blockade. Cancers (Basel). 13 (18), 4616 (2021).
  11. Karaman, S., Detmar, M. Mechanisms of lymphatic metastasis. J Clin Invest. 124 (3), 922-928 (2014).
  12. Pereira, E. R., et al. Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice. Science. 359 (6382), 1403-1407 (2018).
  13. Brown, M., et al. Lymph node blood vessels provide exit routes for metastatic tumor cell dissemination in mice. Science. 359 (6382), 1408-1411 (2018).
  14. Reticker-Flynn, N. E., et al. Lymph node colonization induces tumor-immune tolerance to promote distant metastasis. Cell. 185 (11), 1924-1942 (2022).
  15. Leong, S. P., et al. Impact of nodal status and tumor burden in sentinel lymph nodes on the clinical outcomes of cancer patients. J Surg Oncol. 103 (6), 518-530 (2011).
  16. Lyman, G. H., et al. Sentinel lymph node biopsy for patients with early-stage breast cancer: American society of clinical oncology clinical practice guideline update. J Clin Oncol. 35 (5), 561-564 (2017).
  17. Wong, S. L., et al. Sentinel lymph node biopsy and management of regional lymph nodes in melanoma: American society of clinical oncology and society of surgical oncology clinical practice guideline update. Ann Surg Oncol. 25 (2), 356-377 (2018).
  18. Faries, M. B., et al. Completion dissection or observation for sentinel-node metastasis in melanoma. N Engl J Med. 376 (23), 2211-2222 (2017).
  19. Giuliano, A. E., et al. Effect of axillary dissection vs no axillary dissection on 10-year overall survival among women with invasive breast cancer and sentinel node metastasis: The ACOSOG Z0011 (alliance) randomized clinical trial. JAMA. 318 (10), 918-926 (2017).
  20. du Bois, H., Heim, T. A., Lund, A. W. Tumor-draining lymph nodes: At the crossroads of metastasis and immunity. Sci Immunol. 6 (63), eabg3551 (2021).
  21. An, S., et al. Locally trapping the c-c chemokine receptor type 7 by gene delivery nanoparticle inhibits lymphatic metastasis prior to tumor resection. Small. 15 (9), e1805182 (2019).
  22. Lee, C. K., et al. Tumor metastasis to lymph nodes requires yap-dependent metabolic adaptation. Science. 363 (6427), 644-649 (2019).
  23. Buchwald, Z. S., et al. Tumor-draining lymph node is important for a robust abscopal effect stimulated by radiotherapy. J ImmunoTher Cancer. 8 (2), e000867 (2020).
  24. Siddiqui, I., et al. Intratumoral Tcf1+PD-1+CD8+ T cells with stem-like properties promote tumor control in response to vaccination and checkpoint blockade immunotherapy. Immunity. 50 (1), 195.e10-211.e10 (2019).
  25. Ashton-Rickardt, P. G., et al. Evidence for a differential avidity model of T cell selection in the thymus. Cell. 76 (4), 651-663 (1994).
  26. Manjunath, N., et al. Effector differentiation is not prerequisite for generation of memory cytotoxic T lymphocytes. J Clin Invest. 108 (6), 871-878 (2001).
  27. Khan, O., et al. TOX transcriptionally and epigenetically programs CD8+ T cell exhaustion. Nature. 571 (7764), 211-218 (2019).
  28. North, R. J. Cyclophosphamide-facilitated adoptive immunotherapy of an established tumor depends on elimination of tumor-induced suppressor T cells. J Exp Med. 155 (4), 1063-1074 (1982).
  29. Maine, G. N., Mule, J. J. Making room for T cells. J Clin Invest. 110 (2), 157-159 (2002).
  30. Xue, G., et al. Adoptive cell therapy with tumor-specific th9 cells induces viral mimicry to eliminate antigen-loss-variant tumor cells. Cancer Cell. 39 (12), 1610.e9-1622.e9 (2021).
  31. Prokhnevska, N., et al. CD8+ T cell activation in cancer comprises an initial activation phase in lymph nodes followed by effector differentiation within the tumor. Immunity. 56 (1), 107.e5-124.e5 (2023).
  32. Wang, L., et al. Tumor transplantation for assessing the dynamics of tumor-infiltrating CD8+ T cells in mice. J Vis Exp. (172), e62442 (2021).
  33. Liu, Q., et al. Tumor-specific memory cd8(+) t cells are strictly resident in draining lymph nodes during tumorigenesis. Cell Mol Immunol. 20 (4), 423-426 (2023).
  34. Fransen, M. F., et al. Tumor-draining lymph nodes are pivotal in pd-1/pd-l1 checkpoint therapy. JCI Insight. 3 (23), e124507 (2018).
  35. Francis, D. M., et al. Blockade of immune checkpoints in lymph nodes through locoregional delivery augments cancer immunotherapy. Sci Transl Med. 12 (563), eaay3575 (2020).
  36. Garner, H., de Visser, K. E. Immune crosstalk in cancer progression and metastatic spread: A complex conversation. Nat Rev Immunol. 20 (8), 483-497 (2020).

Play Video

Cite This Article
Zhang, Y., Su, X., Wang, L., Yue, Z., Liu, Q., Ran, L., Lei, S., Hu, J., Xu, L., Ye, L., Ji, P., Li, G., Huang, Q., Wen, S. Draining Lymph Node Metastasis Model for Assessing the Dynamics of Antigen-Specific CD8+ T Cells During Tumorigenesis. J. Vis. Exp. (203), e65646, doi:10.3791/65646 (2024).

View Video