Summary

Modelo de Metástase de Linfonodo Drenante para Avaliação da Dinâmica de Células T CD8+ Antígeno-Específicas Durante a Tumorigênese

Published: January 26, 2024
doi:

Summary

O desenho experimental aqui apresentado fornece um modelo reprodutivo útil para o estudo de células T CD8+ antígeno-específicas durante metástases linfonodais (LN), o que exclui a perturbação de células T CD8+ circunstantes.

Abstract

As células T CD8+ antígeno-específicas tumorais provenientes da drenagem de linfonodos ganham importância acumulada na montagem da resposta imune antitumoral durante a tumorigênese. No entanto, em muitos casos, as células cancerosas formam loci metastáticos nos gânglios linfáticos antes de metastatizar para órgãos distantes. Até que ponto as respostas locais e sistemáticas de células T CD8+ foram influenciadas pela metástase de NL permanece obscura. Para isso, montamos um modelo de metástase de LN murino combinado com uma linhagem celular de melanoma B16F10-GP expressando o neoantígeno substituto derivado do vírus da coriomeningite linfocítica (LCMV), glicoproteína (GP) e camundongos transgênicos P14 que abrigam receptores de células T (TCRs) específicos para o peptídeo GP33-41 derivado da GP apresentado pela molécula H-2Db do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) classe I. Este protocolo permite o estudo da resposta antígeno-específica de células T CD8+ durante metástases de NL. Neste protocolo, camundongos C57BL/6J foram implantados subcutaneamente com células B16F10-GP, seguido de transferência adotiva com células P14 virgens. Quando o tumor subcutâneo crescia para aproximadamente 5 mm de diâmetro, o tumor primário era excisado e as células B16F10-GP eram injetadas diretamente no linfonodo de drenagem tumoral (TdLN). Em seguida, a dinâmica das células T CD8+ foi monitorada durante o processo de metástase do NL. Coletivamente, este modelo forneceu uma abordagem para investigar precisamente as respostas imunes de células T CD8+ antígeno-específicas durante metástases de NL.

Introduction

A imunoterapia do câncer, especialmente o bloqueio do ponto de verificação imune (ICB), revolucionou a terapia do câncer1. O ICB bloqueia os imunorreceptores coinibitórios (como PD-1, Tim-3, LAG-3 e TIGIT), que são altamente expressos em células T CD8+ esgotadas no microambiente tumoral (TME), levando ao revigoramentode células T CD8+ esgotadas2. Considerando a heterogeneidade das células T CD8+ esgotadas, evidências acumuladas revelaram que células T CD8+ tumor-específicas derivadas da periferia, incluindo linfonodos drenantes (dLN), mas não na EMT, medeiam a eficácia do ICB3,4,5,6,7,8. Recentemente, confirmou-se que as células T CD8+ de memória específicas de TdLN TCF-1+TOX (TdLN-TTSM) são os verdadeiros respondedores ao ICB, que incorporam várias propriedades funcionais das células T de memória convencionais e podem expandir e diferenciar-se em células exaustas de progênie após o tratamento com ICB9. Em conjunto, esses achados corroboram a importância do NL na montagem da imunidade antitumoral.

O linfonodo funciona como um local crítico na facilitação do priming e ativação de células T CD8+ tumor-específicas, fornecendo base estrutural e sinais biológicos10. Vários tipos de células cancerosas frequentemente semeiam linfonodo sentinela (LS, o primeiro LN drenando um tumor primário) antes da disseminaçãosistemática11. A presença de metástase no LS está associada a pior evolução no câncer humano e modelos pré-clínicos mostraram que as células tumorais no TdLN poderiam se espalhar para órgãos distantes através dos vasos linfáticos e sanguíneos do nódulo 12,13,14,15. A biópsia do LS representa agora um procedimento padrão para orientar decisões subsequentes de tratamento em muitos tipos de tumores sólidos, o que poderia evitar a ressecção desnecessária de NL não comprometido16,17. Mesmo para o LN envolvido, permanece controverso se e quando a ressecção cirúrgica é necessária, pois vários estudos demonstraram que a remoção do NL regional não apresentou melhora na sobrevida global em comparação com aqueles que receberam radioterapia ou terapia sistêmica sem ressecção regional do NL 18,19. Uma interpretação é que o LN metastático (mLN) com doença microscópica pode reter alguma capacidade de educar células imunes e fornecer alguns benefícios terapêuticos. Assim, é extremamente importante elucidar como a metástase de LN afeta a resposta imune antitumoral, especialmente as propriedades e funções daTSM TdLN-T.

Até o momento, tanto os dados pré-clínicos quanto clínicos têm revelado algumas alterações estruturais e celulares no mLN20. No entanto, as alterações dinâmicas das células T CD8+ tumor-específicas durante a metástase de NL não foram delineadas. Portanto, o desenvolvimento de um modelo convincente de metástase de NL é necessário para uma investigação mais aprofundada. De fato, vários estudos relataram modelos de camundongos mLN de diferentes maneiras 14,21,22. Por exemplo, metástases espontâneas em LNs axilares foram realizadas através do implante de células de câncer de mama 4T1 no coxim gordurosomamário 22. Em outro estudo, Reticker-Flynn e col. geraram linhagens celulares de melanoma com alta incidência de disseminação do tumor primário subcutâneo para LNs por meio da inoculação seriada de células tumorais cultivadas a partir de tecidos mLN dissociados (nove rodadas)14. Outro modelo comumente utilizado foi preparado pela injeção de células tumorais no coxim plantar e os loci metastáticos seriam formados no LN poplíteo22. Notadamente, é difícil avaliar os momentos precisos de intervenção, pois a metástase de NL nesses modelos nem sempre é fiel.

No presente estudo, um modelo metastático de LN murino foi estabelecido através da injeção intranodal de células B16F10-GP23,24, geradas pela inserção mediada por CRISPR/Cas9 da sequência gênica da glicoproteína (GP) do vírus LCMV no genoma da linhagem celular B16F10 9. Em seguida, esses camundongos foram transferidos com células P14 que abrigam receptores transgênicos de células T (TCRs) que reconhecem especificamente o epítopo H-2Db GP33-41 25,26 e a dinâmica sistêmica e local de células T CD8+ antígeno-específicas durante metástases de NL pôde ser investigada. Nosso desenho experimental fornece um modelo útil para o estudo das respostas imunes, especialmente das células T CD8+ antígeno-específicas durante a metástase do LN, o que exclui a perturbação das células T CD8+ circunstantes. Esses resultados afetariam as opções de tratamento clínico de remover ou reter o mLN e lançariam uma nova luz sobre a manipulação do mLN para alcançar o máximo de benefícios terapêuticos.

Protocol

Os camundongos C57BL/6J (referidos a camundongos B6) e os camundongos transgênicos P14 virgens 9,27 utilizados tinham de 6 a 10 semanas de idade, pesando 18-22 g. Homens e mulheres foram incluídos sem randomização ou cegamento. Todos os estudos com animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Agrícola de Qingdao. 1. Preparação do meio e dos reage…

Representative Results

O diagrama esquemático deste desenho experimental é mostrado na Figura 1A. Um total de 5 x 105 células B16F10-GP em 100 μL de PBS foram implantadas por via subcutânea (s.c.) na região inguinal bilateral de camundongos CD45.2 C57BL/6J. Após 7 dias, esses camundongos portadores de tumor foram injetados intraperitonealmente (i.p.) com 4 mg de CTX, seguido pela transferência adotiva de 5 x 105 células CD45.1+P14 através de injeção intravenosa (i.v.) d…

Discussion

Durante a tumorigênese, as células apresentadoras de antígenos (APCs) engolem antígenos tumorais e migram para TdLN, onde formam células T CD8+. Após priming e ativação, as células T CD8+ deixam o TdLN e infiltram o tumor para matar as células tumorais10. Através da ressecção de TdLN e da administração de FTY720, que bloqueiam a saída de células imunes dos órgãos linfoides, vários estudos têm demonstrado o papel fundamental do TdLN em garantir a eficácia…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pela National Science Foundation for Outstanding Young Scholars of China (No. 82122028 to LX), pela National Natural Science Foundation of China (No. 82173094 to LX), Natural Science Foundation of Chong Qing (No. 2023NSCQ-BHX0087 to SW).

Materials

1.5 mL centrifuge tube KIRGEN KG2211
100 U insulin syringe BD Biosciences  320310
15 mL conical tube  BEAVER  43008
2,2,2-Tribromoethanol (Avertin)  Sigma  T48402-25G 
2-Methyl-2-butanol Sigma 240486-100ML 
70 μm nylon cell strainer BD Falcon  352350
APC anti-mouse CD45.1  BioLegend  110714 Clone:A20 
B16-GP cell line Beijing Biocytogen Co.Ltd, China Custom
BSA-V (bovine serum albumin)  Bioss bs-0292P
cell culture dish BEAVER  43701/43702/43703 
centrifuge Eppendorf 5810R-A462/5424R 
cyclophosphamide Sigma  C0768-25G 
Cyclophosphamide (CTX) Sigma PHR1404
Dulbecco's Modified Eagle Medium  Gibco  C11995500BT 
EDTA Sigma EDS-500g 
FACS tubes BD Falcon 352052
fetal bovine serum  Gibco 10270-106
flow cytometer BD FACSCanto II
hemocytometer PorLab Scientific HM330
isoflurane RWD life science  R510-22-16 
KHCO3  Sangon Biotech  A501195-0500 
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation  Life Technologies  L10199 
needle carrier  RWD Life Science  F31034-14 
NH4Cl  Sangon Biotech A501569-0500 
paraformaldehyde Beyotime P0099-500ml 
PE anti-mouse TCR Vα2 BioLegend 127808 Clone:B20.1 
Pen Strep Glutamine (100x) Gibco 10378-016
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a  BioLegend 100734 Clone:53-6.7
RPMI-1640 Sigma R8758-500ML
sodium azide Sigma S2002 
surgical forceps RWD Life Science  F12005-10
surgical scissors RWD Life Science  S12003-09 
suture thread RWD Life Science F34004-30 
trypsin-EDTA Sigma T4049-100ml

References

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Zhang, Y., Su, X., Wang, L., Yue, Z., Liu, Q., Ran, L., Lei, S., Hu, J., Xu, L., Ye, L., Ji, P., Li, G., Huang, Q., Wen, S. Draining Lymph Node Metastasis Model for Assessing the Dynamics of Antigen-Specific CD8+ T Cells During Tumorigenesis. J. Vis. Exp. (203), e65646, doi:10.3791/65646 (2024).

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