Summary

Tümör Oluşumu Sırasında Antijene Özgü CD8+ T Hücrelerinin Dinamiğinin Değerlendirilmesi için Drenaj Lenf Nodu Metastazı Modeli

Published: January 26, 2024
doi:

Summary

Burada sunulan deneysel tasarım, lenf nodu (LN) metastazı sırasında antijene özgü CD8+ T hücrelerinin çalışmaları için yararlı bir üreme modeli sağlar, bu da seyirci CD8+ T hücrelerinin bozulmasını dışlar.

Abstract

Drenaj lenf nodlarından tümör antijenine özgü CD8+ T hücreleri, tümör oluşumu sırasında anti-tümör immün yanıtının oluşturulmasında biriken bir önem kazanır. Bununla birlikte, çoğu durumda, kanser hücreleri, uzak organlara daha fazla metastaz yapmadan önce lenf düğümlerinde metastatik lokuslar oluşturur. Lokal ve sistematik CD8+ T hücresi yanıtlarının LN metastazından ne ölçüde etkilendiği belirsizliğini korumaktadır. Bu amaçla, lenfositik koriomenenjit virüsü (LCMV), glikoprotein (GP) ve sınıf I majör histouyumluluk kompleksi (MHC) molekülü H-2Db tarafından sunulan GP kaynaklı peptit GP33-41’e özgü T hücresi reseptörlerini (TCR’ler) barındıran T hücresi reseptörlerini (TCR’ler) barındıran vekil neoantijeni eksprese eden bir B16F10-GP melanom hücre hattı ile birleştirilmiş bir murin LN metastaz modeli oluşturduk. Bu protokol, LN metastazı sırasında antijene özgü CD8+ T hücresi yanıtlarının incelenmesini sağlar. Bu protokolde, C57BL / 6J fareleri deri altına B16F10-GP hücreleri ile implante edildi, ardından saf P14 hücreleri ile evlat edinme transferi yapıldı. Subkutan tümörün çapı yaklaşık 5 mm’ye ulaştığında, primer tümör eksize edildi ve B16F10-GP hücreleri doğrudan tümör drenaj lenf noduna (TdLN) enjekte edildi. Daha sonra, LN metastazı sürecinde CD8+ T hücrelerinin dinamikleri izlendi. Toplu olarak, bu model, LN metastazı sırasında antijene özgü CD8 + T hücresi immün yanıtlarını kesin olarak araştırmak için bir yaklaşım sağlamıştır.

Introduction

Kanser immünoterapisi, özellikle bağışıklık kontrol noktası blokajı (ICB), kanser tedavisinde devrim yarattı1. ICB, tümör mikroçevresindeki (TME) tükenmiş CD8 + T hücrelerinde yüksek oranda eksprese edilen koinhibitör immünoreseptörleri (PD-1, Tim-3, LAG-3 ve TIGIT gibi) bloke eder ve tükenmiş CD8 + T hücrelerinin yeniden canlanmasına yol açar2. Tükenmiş CD8 + T hücrelerinin heterojenliği göz önüne alındığında, biriken kanıtlar, drenaj lenf nodu (dLN) dahil olmak üzere periferden türetilen, ancak TME’de olmayan, tümöre özgü CD8 + T hücrelerinin ICB 3,4,5,6,7,8’in etkinliğine aracılık ettiğini ortaya koymuştur. Son zamanlarda, TdLN’den türetilen TCF-1+TOX tümöre özgü bellek CD8+ T hücrelerinin (TdLN-TTSM), geleneksel bellek T hücrelerinin çeşitli fonksiyonel özelliklerini içeren ve ICB tedavisi üzerine döl tükenmiş hücrelere daha da genişleyebilen ve farklılaşabilen ICB’ye gerçek yanıt verenler olduğu doğrulandı9. Toplamda, bu bulgular anti-tümör bağışıklığının artmasında LN’nin önemini doğruladı.

Lenf nodu, biyolojik sinyallerin yanı sıra yapısal temel sağlayarak tümöre özgü CD8+ T hücrelerinin hazırlanmasını ve aktivasyonunu kolaylaştırmada kritik bir yer olarak işlev görür10. Çeşitli kanser hücreleri, sistematik yayılımdan önce sıklıkla sentinel lenf nodunu (SLN, primer tümörü boşaltan ilk LN) tohumlar11. SLN metastazının varlığı, insan kanserinde kötü sonuçla bağlantılıdır ve klinik öncesi modeller, TdLN’deki tümör hücrelerinin hem lenfatik damarlar hem dedüğüm 12,13,14,15’in kan damarları yoluyla uzak organlara yayılabileceğini göstermiştir. SLN biyopsisi, birçok solid tümör tipinde sonraki tedavi kararlarına rehberlik etmek için standart bir prosedürü temsil etmektedir ve bu da tutulmamış LN’nin gereksiz rezeksiyonunu önleyebilir16,17. İlgili LN’ye bile, cerrahi rezeksiyonun gerekli olup olmadığı ve ne zaman gerekli olduğu tartışmalıdır, çünkü birkaç çalışma, bölgesel LN’nin çıkarılmasının, bölgesel LN rezeksiyonu olmadan radyasyon veya sistemik tedavi alanlara kıyasla genel sağkalımda iyileşme göstermediğini göstermiştir18,19. Bir yorum, mikroskobik hastalığı olan metastatik LN’nin (mLN), bağışıklık hücrelerini eğitmek ve bazı terapötik faydalar sağlamak için bir miktar kapasiteyi koruyabileceğidir. Bu nedenle, LN metastazının anti-tümör immün yanıtını, özellikle TdLN-TTSM’nin özelliklerini ve fonksiyonlarını nasıl etkilediğini aydınlatmak kritik öneme sahiptir.

Şimdiye kadar, hem klinik öncesi hem de klinik veriler mLN20’de bazı yapısal ve hücresel değişiklikler ortaya koymuştur. Bununla birlikte, LN metastazı sırasında tümöre özgü CD8 + T hücrelerinin dinamik değişiklikleri tanımlanmamıştır. Bu nedenle, daha fazla araştırma için zorlayıcı bir LN metastazı modeli geliştirmeye ihtiyaç vardır. Gerçekten de, birkaç çalışma mLN fare modellerini farklı yollarla bildirmiştir 14,21,22. Örneğin, aksiller LN’lerde spontan metastaz, 4T1 meme kanseri hücrelerinin meme yağ yastığı22’ye implantasyonu yoluyla gerçekleştirildi. Başka bir çalışmada, Reticker-Flynn ve ark. ayrışmış mLN dokularından kültürlenen tümör hücrelerinin seri aşılanması yoluyla deri altı primer tümörden LN’lere yüksek yayılma insidansına sahip melanom hücre hatları üretti (dokuz tur)14. Yaygın olarak kullanılan bir diğer model, tümör hücrelerinin ayak tabanına enjeksiyonu ile hazırlandı ve metastatik lokuslar popliteal LN22’de oluşturulacaktı. Özellikle, müdahalenin kesin zaman noktalarını değerlendirmek zordur, çünkü bu modellerde LN metastazı her zaman sadık değildir.

Bu çalışmada, LCMV virüsü glikoprotein (GP) gen dizisinin B16F10 hücre hattı9’un genomuna CRISPR/Cas9 aracılı eklenmesiyle oluşturulan B16F10-GP hücrelerinin23,24 intranodal enjeksiyonu yoluyla bir murin LN metastatik modeli oluşturulmuştur. Daha sonra, bu fareler, transgenik T hücre reseptörlerini (TCR’ler) barındıran P14 hücreleri ile transfer edildi ve spesifik olarak H-2Db GP33-41 epitop25,26’yı tanıdı ve LN metastazı sırasında antijene özgü CD8+ T hücrelerinin sistemik ve lokal dinamikleri araştırılabildi. Deneysel tasarımımız, immün yanıtların, özellikle de LN metastazı sırasında antijene özgü CD8 + T hücrelerinin, seyirci CD8 + T hücrelerinin pertürbasyonunu dışlayan çalışması için yararlı bir model sunmaktadır. Bu sonuçlar, mLN’nin çıkarılması veya saklanması konusundaki klinik tedavi seçeneklerini etkileyecek ve maksimum terapötik fayda elde etmek için mLN’nin manipülasyonuna yeni bir ışık tutacaktır.

Protocol

Kullanılan C57BL/6J fareleri (B6 farelerine atıfta bulunulur) ve saf P14 transgenik fareler 9,27 6-10 haftalıkken 18-22 g ağırlığındaydı. Hem erkek hem de dişi, randomizasyon veya körleme olmadan dahil edildi. Tüm hayvan çalışmaları, Qingdao Ziraat Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi’nin yönergelerine uygun olarak yürütülmüştür. 1. Ortam ve reaktiflerin hazırlanması…

Representative Results

Bu deneysel tasarımın şematik diyagramı Şekil 1A’da gösterilmiştir. 100 μL PBS’de toplam 5 x 105 B16F10-GP hücresi, CD45.2 C57BL/6J farelerinin bilateral kasık bölgesine subkutan olarak (s.c.) implante edildi. 7 gün sonra, bu tümör taşıyan farelere intraperitoneal (i.p.) 4 mg CTX enjekte edildi, ardından kuyruk intravenöz (i.v.) enjeksiyon yoluyla 5 x 105 CD45.1 + P14 hücrelerinin evlat edinici transferi yapıldı. Tümörler yaklaşık 3-5…

Discussion

Tümör oluşumu sırasında, antijen sunan hücreler (APC’ler) tümör antijenlerini yutar ve CD8+ T hücrelerini hazırladıkları TdLN’ye göç eder. Hazırlama ve aktivasyondan sonra, CD8 + T hücreleri TdLN’yi terk eder ve tümör hücrelerini öldürmek için tümöre sızar10. TdLN rezeksiyonu ve lenfoid organlardan bağışıklık hücrelerinin çıkışını bloke eden FTY720’nin uygulanması yoluyla, birkaç çalışma TdLN’nin PD-1/PD-L1 kontrol noktası tedavisini…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma, Çin’in Seçkin Genç Akademisyenleri için Ulusal Bilim Vakfı (No. 82122028’den LX’e), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 82173094’den LX’e), Chong Qing Doğa Bilimleri Vakfı (No. 2023NSCQ-BHX0087’dan SW’ye) tarafından desteklenmiştir.

Materials

1.5 mL centrifuge tube KIRGEN KG2211
100 U insulin syringe BD Biosciences  320310
15 mL conical tube  BEAVER  43008
2,2,2-Tribromoethanol (Avertin)  Sigma  T48402-25G 
2-Methyl-2-butanol Sigma 240486-100ML 
70 μm nylon cell strainer BD Falcon  352350
APC anti-mouse CD45.1  BioLegend  110714 Clone:A20 
B16-GP cell line Beijing Biocytogen Co.Ltd, China Custom
BSA-V (bovine serum albumin)  Bioss bs-0292P
cell culture dish BEAVER  43701/43702/43703 
centrifuge Eppendorf 5810R-A462/5424R 
cyclophosphamide Sigma  C0768-25G 
Cyclophosphamide (CTX) Sigma PHR1404
Dulbecco's Modified Eagle Medium  Gibco  C11995500BT 
EDTA Sigma EDS-500g 
FACS tubes BD Falcon 352052
fetal bovine serum  Gibco 10270-106
flow cytometer BD FACSCanto II
hemocytometer PorLab Scientific HM330
isoflurane RWD life science  R510-22-16 
KHCO3  Sangon Biotech  A501195-0500 
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation  Life Technologies  L10199 
needle carrier  RWD Life Science  F31034-14 
NH4Cl  Sangon Biotech A501569-0500 
paraformaldehyde Beyotime P0099-500ml 
PE anti-mouse TCR Vα2 BioLegend 127808 Clone:B20.1 
Pen Strep Glutamine (100x) Gibco 10378-016
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a  BioLegend 100734 Clone:53-6.7
RPMI-1640 Sigma R8758-500ML
sodium azide Sigma S2002 
surgical forceps RWD Life Science  F12005-10
surgical scissors RWD Life Science  S12003-09 
suture thread RWD Life Science F34004-30 
trypsin-EDTA Sigma T4049-100ml

References

  1. Morad, G., Helmink, B. A., Sharma, P., Wargo, J. A. Hallmarks of response, resistance, and toxicity to immune checkpoint blockade. Cell. 184 (21), 5309-5337 (2021).
  2. Korman, A. J., Garrett-Thomson, S. C., Lonberg, N. The foundations of immune checkpoint blockade and the ipilimumab approval decennial. Nat Rev Drug Discov. 21 (7), 509-528 (2022).
  3. Chamoto, K., et al. Mitochondrial activation chemicals synergize with surface receptor PD-1 blockade for T cell-dependent antitumor activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (5), E761-E770 (2017).
  4. Spitzer, M. H., et al. Systemic immunity is required for effective cancer immunotherapy. Cell. 168 (3), 487-502 (2017).
  5. Yost, K. E., et al. Clonal replacement of tumor-specific T cells following PD-1 blockade. Nat Med. 25 (8), 1251-1259 (2019).
  6. Wu, T. D., et al. Peripheral T cell expansion predicts tumour infiltration and clinical response. Nature. 579 (7798), 274-278 (2020).
  7. Connolly, K. A., et al. A reservoir of stem-like cd8(+) t cells in the tumor-draining lymph node preserves the ongoing antitumor immune response. Sci Immunol. 6 (64), eabg7836 (2021).
  8. Schenkel, J. M., et al. Conventional type I dendritic cells maintain a reservoir of proliferative tumor-antigen specific Tcf-1+ CD8+ T cells in tumor-draining lymph nodes. Immunity. 54 (10), 2338-2353 (2021).
  9. Huang, Q., et al. The primordial differentiation of tumor-specific memory cd8(+) t cells as bona fide responders to pd-1/pd-l1 blockade in draining lymph nodes. Cell. 185 (22), 4049-4066 (2022).
  10. Kanda, Y., Okazaki, T., Katakai, T. Motility dynamics of T cells in tumor-draining lymph nodes: A rational indicator of antitumor response and immune checkpoint blockade. Cancers (Basel). 13 (18), 4616 (2021).
  11. Karaman, S., Detmar, M. Mechanisms of lymphatic metastasis. J Clin Invest. 124 (3), 922-928 (2014).
  12. Pereira, E. R., et al. Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice. Science. 359 (6382), 1403-1407 (2018).
  13. Brown, M., et al. Lymph node blood vessels provide exit routes for metastatic tumor cell dissemination in mice. Science. 359 (6382), 1408-1411 (2018).
  14. Reticker-Flynn, N. E., et al. Lymph node colonization induces tumor-immune tolerance to promote distant metastasis. Cell. 185 (11), 1924-1942 (2022).
  15. Leong, S. P., et al. Impact of nodal status and tumor burden in sentinel lymph nodes on the clinical outcomes of cancer patients. J Surg Oncol. 103 (6), 518-530 (2011).
  16. Lyman, G. H., et al. Sentinel lymph node biopsy for patients with early-stage breast cancer: American society of clinical oncology clinical practice guideline update. J Clin Oncol. 35 (5), 561-564 (2017).
  17. Wong, S. L., et al. Sentinel lymph node biopsy and management of regional lymph nodes in melanoma: American society of clinical oncology and society of surgical oncology clinical practice guideline update. Ann Surg Oncol. 25 (2), 356-377 (2018).
  18. Faries, M. B., et al. Completion dissection or observation for sentinel-node metastasis in melanoma. N Engl J Med. 376 (23), 2211-2222 (2017).
  19. Giuliano, A. E., et al. Effect of axillary dissection vs no axillary dissection on 10-year overall survival among women with invasive breast cancer and sentinel node metastasis: The ACOSOG Z0011 (alliance) randomized clinical trial. JAMA. 318 (10), 918-926 (2017).
  20. du Bois, H., Heim, T. A., Lund, A. W. Tumor-draining lymph nodes: At the crossroads of metastasis and immunity. Sci Immunol. 6 (63), eabg3551 (2021).
  21. An, S., et al. Locally trapping the c-c chemokine receptor type 7 by gene delivery nanoparticle inhibits lymphatic metastasis prior to tumor resection. Small. 15 (9), e1805182 (2019).
  22. Lee, C. K., et al. Tumor metastasis to lymph nodes requires yap-dependent metabolic adaptation. Science. 363 (6427), 644-649 (2019).
  23. Buchwald, Z. S., et al. Tumor-draining lymph node is important for a robust abscopal effect stimulated by radiotherapy. J ImmunoTher Cancer. 8 (2), e000867 (2020).
  24. Siddiqui, I., et al. Intratumoral Tcf1+PD-1+CD8+ T cells with stem-like properties promote tumor control in response to vaccination and checkpoint blockade immunotherapy. Immunity. 50 (1), 195.e10-211.e10 (2019).
  25. Ashton-Rickardt, P. G., et al. Evidence for a differential avidity model of T cell selection in the thymus. Cell. 76 (4), 651-663 (1994).
  26. Manjunath, N., et al. Effector differentiation is not prerequisite for generation of memory cytotoxic T lymphocytes. J Clin Invest. 108 (6), 871-878 (2001).
  27. Khan, O., et al. TOX transcriptionally and epigenetically programs CD8+ T cell exhaustion. Nature. 571 (7764), 211-218 (2019).
  28. North, R. J. Cyclophosphamide-facilitated adoptive immunotherapy of an established tumor depends on elimination of tumor-induced suppressor T cells. J Exp Med. 155 (4), 1063-1074 (1982).
  29. Maine, G. N., Mule, J. J. Making room for T cells. J Clin Invest. 110 (2), 157-159 (2002).
  30. Xue, G., et al. Adoptive cell therapy with tumor-specific th9 cells induces viral mimicry to eliminate antigen-loss-variant tumor cells. Cancer Cell. 39 (12), 1610.e9-1622.e9 (2021).
  31. Prokhnevska, N., et al. CD8+ T cell activation in cancer comprises an initial activation phase in lymph nodes followed by effector differentiation within the tumor. Immunity. 56 (1), 107.e5-124.e5 (2023).
  32. Wang, L., et al. Tumor transplantation for assessing the dynamics of tumor-infiltrating CD8+ T cells in mice. J Vis Exp. (172), e62442 (2021).
  33. Liu, Q., et al. Tumor-specific memory cd8(+) t cells are strictly resident in draining lymph nodes during tumorigenesis. Cell Mol Immunol. 20 (4), 423-426 (2023).
  34. Fransen, M. F., et al. Tumor-draining lymph nodes are pivotal in pd-1/pd-l1 checkpoint therapy. JCI Insight. 3 (23), e124507 (2018).
  35. Francis, D. M., et al. Blockade of immune checkpoints in lymph nodes through locoregional delivery augments cancer immunotherapy. Sci Transl Med. 12 (563), eaay3575 (2020).
  36. Garner, H., de Visser, K. E. Immune crosstalk in cancer progression and metastatic spread: A complex conversation. Nat Rev Immunol. 20 (8), 483-497 (2020).

Play Video

Cite This Article
Zhang, Y., Su, X., Wang, L., Yue, Z., Liu, Q., Ran, L., Lei, S., Hu, J., Xu, L., Ye, L., Ji, P., Li, G., Huang, Q., Wen, S. Draining Lymph Node Metastasis Model for Assessing the Dynamics of Antigen-Specific CD8+ T Cells During Tumorigenesis. J. Vis. Exp. (203), e65646, doi:10.3791/65646 (2024).

View Video