JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicine

Нарушение гематоэнцефалического барьера мышей мелкими внеклеточными везикулами гипоксической плаценты человека

Published: January 26, 2024
doi:
10.3791/65867
, , , , , , , , ,
1Vascular Physiology Laboratory, Department of Basic Sciences,Universidad del Bío-Bío, Chillan, 2Nursery School, Health Faculty,Universidad Santo Tomás, Los Angeles, 3Obstetrics and Gynecology Department,Herminda Martin Clinical Hospital, Chillan, 4Faculty of Medicine,Universidad Católica de la Santísima Concepción, Concepcion, 5Laboratory of Animal Biotechnology, Department of Animal Science, Faculty of Veterinary Sciences,Universidad de Concepción, Chillan, 6Group of Research and Innovation in Vascular Health (GRIVAS Health), Chillan

Summary

Представлен протокол для оценки того, нарушают ли малые ВВ (sEV), выделенные из плацентарных эксплантов, культивируемых в гипоксических условиях (моделируя один из аспектов преэклампсии), гематоэнцефалический барьер у небеременных взрослых самок мышей.

Abstract

Цереброваскулярные осложнения, включая отек головного мозга и ишемический и геморрагический инсульт, являются основной причиной материнской смертности, связанной с преэклампсией. Механизмы, лежащие в основе этих цереброваскулярных осложнений, остаются неясными. Однако они связаны с плацентарной дисфункцией и нарушением гематоэнцефалического барьера (ГЭБ). Тем не менее, связь между этими двумя отдаленными органами до сих пор выясняется. Все больше данных свидетельствуют о том, что плацента высвобождает сигнальные молекулы, в том числе внеклеточные везикулы, в материнский кровоток. Внеклеточные везикулы классифицируются в соответствии с их размером, при этом небольшие внеклеточные везикулы (sEV менее 200 нм в диаметре) считаются критическими сигнальными частицами как при физиологических, так и при патологических состояниях. При преэклампсии наблюдается повышенное количество циркулирующих sEV в материнском кровотоке, сигнальная функция которых недостаточно изучена. Плацентарные sEV, высвобождаемые при преэклампсии или из нормальной плаценты беременности, подверженной гипоксии, индуцируют эндотелиальную дисфункцию головного мозга и нарушение ГЭБ. В этом протоколе мы оцениваем, нарушают ли sEV, выделенные из эксплантов плаценты, культивируемых в гипоксических условиях (моделируя один из аспектов преэклампсии), ГЭБ in vivo.

Introduction

Примерно 70% случаев материнской смертности вследствие преэклампсии, синдрома гипертонической беременности, характеризующегося нарушением процессов плацентации, системной эндотелиальной дисфункцией матери и, в тяжелых случаях, полиорганной недостаточностью 1,2, связаны с острыми цереброваскулярными осложнениями 3,4. Большинство случаев материнской смертности происходит в странах с низким и средним уровнем дохода5. Однако основные механизмы до сих пор неясны, несмотря на клинико-эпидемиологическую значимость цереброваскулярных осложнений, ассоциированных с преэклампсией.

С другой стороны, внеклеточные везикулы (ВВ) (диаметр ~30-400 нм) являются важными медиаторами межклеточной коммуникации между тканями и органами, включая взаимодействие матери и плаценты6. Помимо белков и липидов на внешней поверхности, ВВ несут внутри себя груз (белки, РНК и липиды). ВВ можно разделить на (1) экзосомы (диаметр ~50-150 нм, также называемые малыми ВВ (sEV)), (2) средние/большие ВВ и (3) апоптотические тела, которые различаются по размеру, биогенезу, содержанию и потенциальной сигнальной функции. Состав ВВ определяется клетками, из которых они происходят, и типом заболевания7. ВВ, полученные из синцитиотрофобласта, экспрессируют плацентарную щелочную фосфатазу (PLAP)8,9, которая выявляет циркулирующие малые ВВ плацентарного происхождения (ПДСВ) во время беременности. Кроме того, PLAP помогает различить изменения в грузе ПДСЭВ и их влияние при преэклампсии по сравнению с нормотензивной беременностью 10,11,12,13,14,15.

Плацента признана необходимым компонентом в патофизиологии преэклампсии16 или церебральных осложнений, связанных с этим заболеванием 17,18,19. Однако неизвестно, как этот удаленный орган может вызывать изменения в мозговом кровообращении. Поскольку sEV играют ключевую роль в межклеточной коммуникации из-за их способности переносить биологически активные компоненты от донорских клеток к клеткам-реципиентам 6,20,21, все большее число исследований связывают плацентарные sEV с генерацией материнской эндотелиальной дисфункции 21,22,23,24, включая эндотелиальные клетки головного мозга25,26у женщин с преэклампсией. Таким образом, нарушение функции эндотелия головного мозга может привести к нарушению гематоэнцефалического барьера (ГЭБ), критического компонента цереброваскулярных осложнений, ассоциированных с преэклампсией 3,27.

Тем не менее, доклинические данные с использованием сосудов головного мозга крыс, подвергшихся воздействию сыворотки крови женщин с преэклампсией28, или эндотелиальных клеток головного мозга человека, подвергшихся воздействию плазмы женщин с преэклампсией29, показали, что циркулирующий фактор (факторы) индуцируют разрушение ГЭБ. Несмотря на наличие нескольких кандидатов, потенциально способных нанести вред ГЭБ, присутствующим в кровотоке матери во время преэклампсии, таких как повышенный уровень провоспалительных цитокинов (т.е. фактора некроза опухоли)18,28 или сосудистых регуляторов (например, фактора роста эндотелия сосудов (VEGF))29,30,31, или окислительных молекул, таких как окисленные липопротеины (оксо-ЛПНП)32,33 и др.34, ни один из них не устанавливает прямой связи между плацентой и ГЭБ. Недавно sEV, выделенные из гипоксической плаценты, показали способность разрушать ГЭБ у небеременных самок мышей25. Поскольку плацентарные sEV могут переносить большинство перечисленных циркулирующих факторов, способных разрушать ГЭБ, sEV считаются подходящими кандидатами для соединения поврежденной плаценты, быть переносчиком вредных циркулирующих факторов и нарушать ГЭБ при преэклампсии.

Этот протокол позволяет исследовать, могут ли sEV, выделенные из плацентарных эксплантов, культивируемых в условиях гипоксии, нарушать ГЭБ у небеременных самок мышей в качестве прокси для понимания патофизиологии церебральных осложнений при преэклампсии.

Protocol

Исследование проводилось в соответствии с принципами, изложенными в Хельсинкской декларации, и с разрешения соответствующих этических наблюдательных советов. Все участники дали свое информированное согласие перед сбором образцов, о чем сообщалосьранее25. Кроме того, Ком?…

Representative Results

Этот протокол оценивает способность sEV, полученных из плаценты, культивируемой в условиях гипоксии, разрушать ГЭБ у небеременных мышей. Этот метод позволяет лучше понять потенциальную связь между плацентой и головным мозгом при нормальных и патологических состояниях. В частности, это?…

Discussion

Это исследование раскрывает новые идеи о потенциальном вреде, наносимом sEV, выделенными из плацентарных эксплантов, культивируемых в гипоксических условиях, на нарушение гематоэнцефалического барьера грызунов. Патологический механизм включает снижение CLND-5 в заднем отделег…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы благодарят исследователей GRIVAS Health за их ценный вклад. Кроме того, акушерки и клинический персонал Службы акушерства и гинекологии входят в состав больницы Чильян, Чили. Основана компанией Fondecyt Regular 1200250.

Materials

Adult mice brain slecer matrice 3D printed Open access file Adult mice Adult mice brain slicer. Printed in PLA filament.
Anti β-Actin primary antibody Sigma-Aldrich Clon AC-74 Antibody for loading control (Western blot)
Anti-Claudin5 primary antibody Santa cruz Biotechnology sc-374221 Primary antibody for tight junction protein CLDN5 of mice BBB (Western blot)
BCA protein kit Thermo Scientific 23225 Kit for measuring protein concentration
Culture media #200 500 mL Thermo Fisher Scientific m200500 Culture media for placental explants
D180 CO2 incubator RWD Life science D180 Standard incubator to estabilize explants and culture sEVs-Nor
Evans blue dye  > 75% 10 g Sigma-Aldrich E2129.10G Dye to analize blood brain barrier disruption IN VIVO
Fetal bovine serum 500 mL Thermo Fisher Scientific 16000044 Additive growth factor for culture media 200
Himac Ultracentrifuge CP100NX Himac eppendorf group 5720410101 Ultracentrifuge for condicioned media > 1,20,000 x g
ImageJ software NIH https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Isoflurane x 100 mL USP Baxter 212-094 Volatile inhalated anaesthesia agent for mice
Kit CellTiter 96 Non-radioactive  Promega 0000105232 In vitro assay for placental explants viability
Mouse IgG Secondary antibody Thermo Fisher Scientific MO 63103 Secondary antibody for CLDN5 (western blot)
NanoSight NS300 Malvern Panalytical 90278090 Nanotracking analysis of particles from placental explants condicioned media
Paraformaldehide E 97% solution 500 mL Thermo Fisher Scientific A11313.22 Fixative solution for brain tissue slices and intracardial perfusion (once diluted)
PBS 1 X pH 7.4 500 mL Thermo Fisher Scientific 10010023 Wash solution for placenta explants
Peniciline-streptomicine 100x 20 mL Thermo Fisher Scientific 10378016 Antiobiotics for placental explants culture media
ProOX C21 Cytocentric O2 and CO2 Subchamber Controller BioSpherix SCR_021131 CO2 regulator to induce Hypoxia in sealed chamber for sEVs-Hyp
Sodium Thiopental 1 g Chemie 7061 humanitarian euthanasia agent
Somnosuite low flow anesthesia system Kent Scientifics SS-01 Isoflurane vaporizer for small rodents
Surgical Warming platform Kent Scientifics A41166 Warming platform for mainteinance anesthesia in mice
Syringe Filters, Polytetrafluoroethylene (PTFE), Hydrophobic, 0.22 µm, Sterile, 25 mm Southern labware 10026 Filtration of condicioned media harvested from placental explants 
Tabletop High-Speed Micro Centrifuges HITACHI himac CT15E/CT15RE Hitachi medical systems 6020 Serial centrifugations of condicioned media < 1,20, 000 x g
Trinocular stereomicroscope transmided and reflective light 10x-160x  Center Medical 2597 Stereomicroscope to register brain slices
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lisonkova, S., Joseph, K. S. Incidence of preeclampsia: risk factors and outcomes associated with early- versus late-onset disease. Am J Obstet Gynecol. 209 (544), 544.e1-544.e12 (2013).
  2. Sibai, B., Dekker, G., Kupferminc, M. Preeclampsia. Lancet. 365 (9461), 785-799 (2005).
  3. Hammer, E. S., Cipolla, M. J. Cerebrovascular dysfunction in preeclamptic pregnancies. Curr Hypertens Rep. 17 (8), 64 (2015).
  4. Okanloma, K. A., Moodley, J. Neurological complications associated with the preeclampsia/eclampsia syndrome. Int J Gynaecol Obstet. 71, 223-225 (2000).
  5. Frias, A. E., Belfort, M. A. Post magpie: how should we be managing severe preeclampsia. Curr Opin Gynecol Obstet. 15 (6), 489-495 (2003).
  6. Familari, M., Cronqvist, T., Masoumi, Z., Hansson, S. R. Placenta-derived extracellular vesicles: Their cargo and possible functions. Reprod Fertil Dev. 29 (3), 433-447 (2017).
  7. Montoro-Garcia, S., Shantsila, E., Marin, F., Blann, A., Lip, G. Y. Circulating microparticles: new insights into the biochemical basis of microparticle release and activity. Basic Res Cardiol. 106, 911-923 (2011).
  8. Germain, S. J., Sacks, G. P., Sooranna, S. R., Sargent, I. L., Redman, C. W. Systemic inflammatory priming in normal pregnancy and preeclampsia: the role of circulating syncytiotrophoblast microparticles. J Immunol. 178 (9), 5949-5956 (2007).
  9. Tannetta, D., Masliukaite, I., Vatish, M., Redman, C., Sargent, I. Update of syncytiotrophoblast derived extracellular vesicles in normal pregnancy and preeclampsia. J Reprod Immunol. 119, 98-106 (2017).
  10. Collett, G. P., Redman, C. W., Sargent, I. L., Vatish, M. Endoplasmic reticulum stress stimulates the release of extracellular vesicles carrying danger-associated molecular pattern (DAMP) molecules. Oncotarget. 9 (6), 6707-6717 (2018).
  11. Cooke, W. R., et al. Maternal circulating syncytiotrophoblast-derived extracellular vesicles contain biologically active 5′-tRNA halves. Biochem Biophys Res Commun. 518 (1), 107-113 (2019).
  12. Gill, M., et al. Placental syncytiotrophoblast-derived extracellular vesicles carry active nep (neprilysin) and are increased in preeclampsia. Hypertension. 73 (5), 1112-1119 (2019).
  13. Kandzija, N., et al. Placental extracellular vesicles express active dipeptidyl peptidase IV; levels are increased in gestational diabetes mellitus. J Extracell Vesicles. 8 (1), 1617000 (2019).
  14. Motta-Mejia, C., et al. Placental vesicles carry active endothelial nitric oxide synthase and their activity is reduced in preeclampsia. Hypertension. 70 (2), 372-381 (2017).
  15. Sammar, M., et al. Reduced placental protein 13 (PP13) in placental derived syncytiotrophoblast extracellular vesicles in preeclampsia – A novel tool to study the impaired cargo transmission of the placenta to the maternal organs. Placenta. 66, 17-25 (2018).
  16. Burton, G. J., Woods, A. W., Jauniaux, E., Kingdom, J. C. Rheological and physiological consequences of conversion of the maternal spiral arteries for uteroplacental blood flow during human pregnancy. Placenta. 30 (6), 473-482 (2009).
  17. Warrington, J. P., et al. Placental ischemia in pregnant rats impairs cerebral blood flow autoregulation and increases blood-brain barrier permeability. Physiological Reports. 2 (8), e12134-e12134 (2014).
  18. Warrington, J. P., Drummond, H. A., Granger, J. P., Ryan, M. J. Placental Ischemia-induced increases in brain water content and cerebrovascular permeability: Role of TNFα. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 309 (11), R1425-R1431 (2015).
  19. Johnson, A. C., et al. Magnesium sulfate treatment reverses seizure susceptibility and decreases neuroinflammation in a rat model of severe preeclampsia. PLoS ONE. 9 (11), e113670 (2014).
  20. Escudero, C. A., et al. Role of extracellular vesicles and microRNAs on dysfunctional angiogenesis during preeclamptic pregnancies. Front Physiol. 7, 1-17 (2016).
  21. Salomon, C., et al. Placental exosomes as early biomarker of preeclampsia: Potential role of exosomalmicrornas across gestation. J Clin Endocrinol Metab. 102 (9), 3182-3194 (2017).
  22. Knight, M., Redman, C. W., Linton, E. A., Sargent, I. L. Shedding of syncytiotrophoblast microvilli into the maternal circulation in pre-eclamptic pregnancies. Br J Obstet Gynaecol. 105 (6), 632-640 (1998).
  23. Gilani, S. I., Weissgerber, T. L., Garovic, V. D., Jayachandran, M. Preeclampsia and extracellular vesicles. Curr Hypertens Rep. 18 (9), 68 (2016).
  24. Dutta, S., et al. Hypoxia-induced small extracellular vesicle proteins regulate proinflammatory cytokines and systemic blood pressure in pregnant rats. Clin Sci (Lond). 134 (6), 593-607 (2020).
  25. Leon, J., et al. Disruption of the blood-brain barrier by extracellular vesicles from preeclampsia plasma and hypoxic placentae: attenuation by magnesium sulfate. Hypertension. 78 (5), 1423-1433 (2021).
  26. Han, C., et al. Placenta-derived extracellular vesicles induce preeclampsia in mouse models. Haematologica. 105 (6), 1686-1694 (2020).
  27. Amburgey, O. A., Chapman, A. C., May, V., Bernstein, I. M., Cipolla, M. J. Plasma from preeclamptic women increases blood-brain barrier permeability: role of vascular endothelial growth factor signaling. Hypertension. 56 (5), 1003-1008 (2010).
  28. Cipolla, M. J., et al. Pregnant serum induces neuroinflammation and seizure activity via TNFalpha. Exp Neurol. 234 (2), 398-404 (2012).
  29. Bergman, L., et al. Preeclampsia and increased permeability over the blood brain barrier – a role of vascular endothelial growth receptor 2. Am J Hypertens. 34 (1), 73-81 (2021).
  30. Torres-Vergara, P., et al. Dysregulation of vascular endothelial growth factor receptor 2 phosphorylation is associated with disruption of the blood-brain barrier and brain endothelial cell apoptosis induced by plasma from women with preeclampsia. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1868 (9), 166451 (2022).
  31. Schreurs, M. P., Houston, E. M., May, V., Cipolla, M. J. The adaptation of the blood-brain barrier to vascular endothelial growth factor and placental growth factor during pregnancy. FASEB J. 26 (1), 355-362 (2012).
  32. Schreurs, M. P., Cipolla, M. J. Cerebrovascular dysfunction and blood-brain barrier permeability induced by oxidized LDL are prevented by apocynin and magnesium sulfate in female rats. J Cardiovasc Pharmacol. 63 (1), 33-39 (2014).
  33. Schreurs, M. P. H., et al. Increased oxidized low-density lipoprotein causes blood-brain barrier disruption in early-onset preeclampsia through LOX-1. FASEB J. 27 (3), 1254-1263 (2013).
  34. Escudero, C., et al. Brain vascular dysfunction in mothers and their children exposed to preeclampsia. Hypertension. 80 (2), 242-256 (2023).
  35. Russell, W. M. S., Burch, R. L. The principles of humane experimental technique. Universities Federation of Animal Welfare. , (1959).
  36. Miller, R. K., et al. Human placental explants in culture: approaches and assessments. Placenta. 26 (6), 439-448 (2005).
  37. Troncoso, F. A. J., Herlitz, K., Ruiz, F., Bertoglia, P., Escudero, C. Elevated pro-angiogenic phenotype in feto-placental tissue from gestational diabetes mellitus. Placenta. 36 (4), 2 (2015).
  38. Zhang, H. C., et al. Microvesicles derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells stimulated by hypoxia promote angiogenesis both in vitro and in vivo. Stem Cells Dev. 21 (18), 3289-3297 (2012).
  39. Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 3 (Unit 3), 22 (2006).
  40. Carroll, R. W., et al. A rapid murine coma and behavior scale for quantitative assessment of murine cerebral malaria. PLoS One. 5 (10), e13124 (2010).
  41. Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio Protoc. 11 (5), e3988 (2021).
  42. Walchli, T., et al. Quantitative assessment of angiogenesis, perfused blood vessels and endothelial tip cells in the postnatal mouse brain. Nat Protoc. 10 (1), 53-74 (2015).
  43. Wang, H. L., Lai, T. W. Optimization of Evans blue quantitation in limited rat tissue samples. Sci Rep. 4, 6588 (2014).
  44. Morita, K., Sasaki, H., Furuse, M., Tsukita, S. Endothelial claudin: claudin-5/TMVCF constitutes tight junction strands in endothelial cells. J Cell Biol. 147 (1), 185-194 (1999).
  45. Lara, E., et al. Abnormal cerebral microvascular perfusion and reactivity in female offspring of reduced uterine perfusion pressure (RUPP) mice model. J Cereb Blood Flow Metab. 42 (12), 2318-2332 (2022).
  46. Chang, X., et al. Exosomes from women with preeclampsia induced vascular dysfunction by delivering sflt (soluble fms-like tyrosine kinase)-1 and seng (soluble endoglin) to endothelial cells. Hypertension. 72, 1381-1390 (2018).
  47. Smarason, A. K., Sargent, I. L., Starkey, P. M., Redman, C. W. The effect of placental syncytiotrophoblast microvillous membranes from normal and pre-eclamptic women on the growth of endothelial cells in vitro. BJOG. 100 (10), 943-949 (1993).

Tags

Extracellular VesiclesBlood-brain BarrierPlacentaPreeclampsiaHypoxiaCerebrovascular ComplicationsMaternal MortalityBrain Endothelial Dysfunction
check_url/65867?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Sandoval, H., León, J., Troncoso, F., de la Hoz, V., Cisterna, A., Contreras, M., Castro, F. O., Ibañez, B., Acurio, J., Escudero, C. Disruption of the Mouse Blood-Brain Barrier by Small Extracellular Vesicles from Hypoxic Human Placentas. J. Vis. Exp. (203), e65867, doi:10.3791/65867 (2024).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image