Um protocolo é apresentado para avaliar se pequenos EVs (sEVs) isolados de explantes placentários cultivados sob condições hipóxicas (modelando um aspecto da pré-eclâmpsia) rompem a barreira hematoencefálica em camundongos fêmeas adultas não grávidas.
As complicações cerebrovasculares, incluindo edema cerebral e acidente vascular cerebral isquêmico e hemorrágico, constituem a principal causa de mortalidade materna associada à pré-eclâmpsia. Os mecanismos subjacentes dessas complicações cerebrovasculares permanecem obscuros. No entanto, eles estão ligados à disfunção placentária e à interrupção da barreira hematoencefálica (BHE). No entanto, a conexão entre esses dois órgãos distantes ainda está sendo determinada. Evidências crescentes sugerem que a placenta libera moléculas sinalizadoras, incluindo vesículas extracelulares, na circulação materna. As vesículas extracelulares são categorizadas de acordo com seu tamanho, sendo que pequenas vesículas extracelulares (sEVs menores que 200 nm de diâmetro) são consideradas partículas sinalizadoras críticas em condições fisiológicas e patológicas. Na pré-eclâmpsia, há um aumento do número de EVs circulantes na circulação materna, cuja função de sinalização não é bem compreendida. Os EVs placentários liberados na pré-eclâmpsia ou em placentas gestacionais normais expostas à hipóxia induzem disfunção endotelial cerebral e interrupção da BHE. Neste protocolo, avaliamos se sEVs isolados de explantes placentários cultivados sob condições hipóxicas (modelando um aspecto da pré-eclâmpsia) interrompem a BHE in vivo.
Aproximadamente 70% das mortes maternas por pré-eclâmpsia, síndrome hipertensiva da gravidez caracterizada por processos de placentação prejudicados, disfunção endotelial sistêmica materna e, em casos graves, falência de múltiplos órgãos 1,2, estão associadas a complicações cerebrovasculares agudas 3,4. A maioria das mortes maternas ocorre em países de baixa e médiarenda5. No entanto, os mecanismos subjacentes ainda não estão claros, apesar da relevância clínica e epidemiológica das complicações cerebrovasculares associadas à pré-eclâmpsia.
Por outro lado, as vesículas extracelulares (EVs) (diâmetro ~30-400 nm) são mediadores essenciais da comunicação intercelular entre tecidos e órgãos, incluindo a interação materno-placentária6. Além de proteínas e lipídios na superfície externa, os EVs carregam carga dentro (proteínas, RNA e lipídios). Os EVs podem ser categorizados em (1) exossomos (diâmetro ~50-150 nm, também chamados de EVs pequenos (sEVs)), (2) EVs médios/grandes e (3) corpos apoptóticos, que diferem pelo tamanho, biogênese, conteúdo e função de sinalização potencial. A composição dos EVs é determinada pelas células de onde se originam e pelo tipo de doença7. Os EVs derivados de sinciciotrofoblastos expressam fosfatase alcalina placentária (PLAP)8,9, que detecta pequenas EVs circulantes derivadas da placenta (PDsEVs) na gravidez. Além disso, o PLAP ajuda a discernir mudanças na carga de PDsEVs e seus efeitos na pré-eclâmpsia versus gestações normotensas 10,11,12,13,14,15.
A placenta tem sido reconhecida como o componente necessário na fisiopatologia da pré-eclâmpsia16 ou complicações cerebrais associadas a esta doença 17,18,19. No entanto, não se sabe como esse órgão distante pode induzir alterações na circulação cerebral. Uma vez que as EVs desempenham papéis fundamentais na comunicação célula-célula devido à sua capacidade de transferir componentes bioativos das células doadoras para as receptoras 6,20,21, um número crescente de estudos tem associado as EVs placentárias à geração de disfunção endotelial materna 21,22,23,24, incluindo células endoteliais cerebrais 25,26em mulheres com pré-eclâmpsia. Assim, o comprometimento da função endotelial cerebral pode levar à ruptura da barreira hematoencefálica (BHE), componente crítico nas complicações cerebrovasculares associadas à pré-eclâmpsia 3,27.
No entanto, achados pré-clínicos utilizando vasos cerebrais de ratas expostos ao soro de mulheres com pré-eclâmpsia28 ou células endoteliais cerebrais humanas expostas ao plasma de mulheres com pré-eclâmpsia29 relataram que o(s) fator(es) circulante(s) induz(em) a interrupção da BHE. Apesar de vários candidatos com potencial para prejudicar a BHE presente na circulação materna durante a pré-eclâmpsia, como níveis elevados de citocinas pró-inflamatórias (i.e., fator de necrose tumoral)18,28 ou reguladores vasculares (i.e., fator de crescimento endotelial vascular (VEGF))29,30,31, ou moléculas oxidativas como lipoproteínas oxidadas (oxo-LDL)32,33, entre outras34, nenhum deles estabelece uma conexão direta entre a placenta e o BBB. Recentemente, sEVs isolados de placentas hipóxicas mostraram a capacidade de interromper a BBB em camundongos fêmeas não gestantes25. Uma vez que os sEVs placentários podem carregar a maioria dos fatores circulantes listados com a capacidade de interromper o BBB, os sEVs são considerados candidatos adequados para conectar a placenta lesionada, ser o portador de fatores circulantes prejudiciais e interromper o BBB na pré-eclâmpsia.
Este protocolo permite investigar se sEVs isolados de explantes placentários cultivados sob condições hipóxicas podem interromper a BHE em camundongos fêmeas não gestantes como proxy para a compreensão da fisiopatologia das complicações cerebrais durante a pré-eclâmpsia.
Este estudo revela novos insights sobre danos potenciais resultantes de sEVs isolados de explantes placentários cultivados em condições hipóxicas sobre o rompimento da barreira hematoencefálica de roedores. O mecanismo patológico envolve a redução do CLND-5 na região posterior do cérebro25.
Investigações prévias revelaram que os sEVs plasmáticos de indivíduos com pré-eclâmpsia induzem disfunção endotelial em vários órgãos usando modelos in vitr…
The authors have nothing to disclose.
Os autores agradecem aos pesquisadores da GRIVAS Health pela valiosa contribuição. Além disso, as parteiras e o corpo clínico do Serviço de Obstetrícia e Ginecologia pertencem ao Hospital de Chillán, Chile. Fundada por Fondecyt Regular 1200250.
Adult mice brain slecer matrice 3D printed | Open access file | Adult mice | Adult mice brain slicer. Printed in PLA filament. |
Anti β-Actin primary antibody | Sigma-Aldrich | Clon AC-74 | Antibody for loading control (Western blot) |
Anti-Claudin5 primary antibody | Santa cruz Biotechnology | sc-374221 | Primary antibody for tight junction protein CLDN5 of mice BBB (Western blot) |
BCA protein kit | Thermo Scientific | 23225 | Kit for measuring protein concentration |
Culture media #200 500 mL | Thermo Fisher Scientific | m200500 | Culture media for placental explants |
D180 CO2 incubator | RWD Life science | D180 | Standard incubator to estabilize explants and culture sEVs-Nor |
Evans blue dye > 75% 10 g | Sigma-Aldrich | E2129.10G | Dye to analize blood brain barrier disruption IN VIVO |
Fetal bovine serum 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | Additive growth factor for culture media 200 |
Himac Ultracentrifuge CP100NX | Himac eppendorf group | 5720410101 | Ultracentrifuge for condicioned media > 1,20,000 x g |
ImageJ software | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
Isoflurane x 100 mL | USP Baxter | 212-094 | Volatile inhalated anaesthesia agent for mice |
Kit CellTiter 96 Non-radioactive | Promega | 0000105232 | In vitro assay for placental explants viability |
Mouse IgG Secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | MO 63103 | Secondary antibody for CLDN5 (western blot) |
NanoSight NS300 | Malvern Panalytical | 90278090 | Nanotracking analysis of particles from placental explants condicioned media |
Paraformaldehide E 97% solution 500 mL | Thermo Fisher Scientific | A11313.22 | Fixative solution for brain tissue slices and intracardial perfusion (once diluted) |
PBS 1 X pH 7.4 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | Wash solution for placenta explants |
Peniciline-streptomicine 100x 20 mL | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | Antiobiotics for placental explants culture media |
ProOX C21 Cytocentric O2 and CO2 Subchamber Controller | BioSpherix | SCR_021131 | CO2 regulator to induce Hypoxia in sealed chamber for sEVs-Hyp |
Sodium Thiopental 1 g | Chemie | 7061 | humanitarian euthanasia agent |
Somnosuite low flow anesthesia system | Kent Scientifics | SS-01 | Isoflurane vaporizer for small rodents |
Surgical Warming platform | Kent Scientifics | A41166 | Warming platform for mainteinance anesthesia in mice |
Syringe Filters, Polytetrafluoroethylene (PTFE), Hydrophobic, 0.22 µm, Sterile, 25 mm | Southern labware | 10026 | Filtration of condicioned media harvested from placental explants |
Tabletop High-Speed Micro Centrifuges HITACHI himac CT15E/CT15RE | Hitachi medical systems | 6020 | Serial centrifugations of condicioned media < 1,20, 000 x g |
Trinocular stereomicroscope transmided and reflective light 10x-160x | Center Medical | 2597 | Stereomicroscope to register brain slices |