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Medicine

Störung der Blut-Hirn-Schranke der Maus durch kleine extrazelluläre Vesikel aus hypoxischen menschlichen Plazenta

Published: January 26, 2024
doi:
10.3791/65867
, , , , , , , , ,
1Vascular Physiology Laboratory, Department of Basic Sciences,Universidad del Bío-Bío, Chillan, 2Nursery School, Health Faculty,Universidad Santo Tomás, Los Angeles, 3Obstetrics and Gynecology Department,Herminda Martin Clinical Hospital, Chillan, 4Faculty of Medicine,Universidad Católica de la Santísima Concepción, Concepcion, 5Laboratory of Animal Biotechnology, Department of Animal Science, Faculty of Veterinary Sciences,Universidad de Concepción, Chillan, 6Group of Research and Innovation in Vascular Health (GRIVAS Health), Chillan

Summary

Es wird ein Protokoll vorgestellt, um zu evaluieren, ob kleine EVs (sEVs), die aus Plazenta-Explantaten isoliert wurden, die unter hypoxischen Bedingungen kultiviert wurden (ein Aspekt der Präeklampsie modellierend), die Blut-Hirn-Schranke bei nicht schwangeren erwachsenen weiblichen Mäusen stören.

Abstract

Zerebrovaskuläre Komplikationen, einschließlich Hirnödeme sowie ischämischer und hämorrhagischer Schlaganfall, sind die Hauptursache für die mütterliche Sterblichkeit im Zusammenhang mit Präeklampsie. Die zugrundeliegenden Mechanismen dieser zerebrovaskulären Komplikationen sind noch unklar. Sie werden jedoch mit Plazentafunktionsstörungen und einer Störung der Blut-Hirn-Schranke (BHS) in Verbindung gebracht. Dennoch wird die Verbindung zwischen diesen beiden entfernten Organen noch ermittelt. Immer mehr Hinweise deuten darauf hin, dass die Plazenta Signalmoleküle, einschließlich extrazellulärer Vesikel, in den mütterlichen Kreislauf abgibt. Extrazelluläre Vesikel werden nach ihrer Größe kategorisiert, wobei kleine extrazelluläre Vesikel (sEVs mit einem Durchmesser von weniger als 200 nm) sowohl unter physiologischen als auch unter pathologischen Bedingungen als kritische Signalpartikel gelten. Bei der Präeklampsie kommt es zu einer erhöhten Anzahl zirkulierender sEVs im mütterlichen Kreislauf, deren Signalfunktion nicht gut verstanden ist. Plazenta-sEVs, die bei Präeklampsie oder aus einer normalen Schwangerschaftsplazenta freigesetzt werden, die einer Hypoxie ausgesetzt sind, induzieren eine endotheliale Dysfunktion des Gehirns und eine Störung der BHS. In diesem Protokoll untersuchen wir, ob sEVs, die aus plazentaren Explantaten isoliert wurden, die unter hypoxischen Bedingungen kultiviert wurden (die einen Aspekt der Präeklampsie modellieren), die BHS in vivo stören.

Introduction

Etwa 70 % der mütterlichen Todesfälle aufgrund von Präeklampsie, einem hypertensiven Schwangerschaftssyndrom, das durch gestörte Plazentationsprozesse, mütterliche systemische endotheliale Dysfunktion und in schweren Fällen durch Multiorganversagen 1,2 gekennzeichnet ist, sind mit akuten zerebrovaskulären Komplikationen assoziiert 3,4. Die meisten Todesfälle von Müttern treten in Ländern mit niedrigem und mittlerem Einkommen auf5. Die zugrundeliegenden Mechanismen sind jedoch trotz der klinischen und epidemiologischen Relevanz zerebrovaskulärer Komplikationen im Zusammenhang mit Präeklampsie noch unklar.

Auf der anderen Seite sind extrazelluläre Vesikel (EVs) (Durchmesser ~30-400 nm) essentielle Mediatoren der interzellulären Kommunikation zwischen Geweben und Organen, einschließlich der mütterlich-plazentaren Interaktion6. Zusätzlich zu Proteinen und Lipiden auf der äußeren Oberfläche transportieren EVs Fracht (Proteine, RNA und Lipide). EVs können in (1) Exosomen (Durchmesser ~50-150 nm, auch kleine EVs (sEVs) genannt), (2) mittlere/große EVs und (3) apoptotische Körper eingeteilt werden, die sich durch Größe, Biogenese, Inhalt und potenzielle Signalfunktion unterscheiden. Die Zusammensetzung von EVs wird durch die Zellen, aus denen sie stammen, und den Krankheitstyp7 bestimmt. Syncytiotrophoblasten-abgeleitete EVs exprimieren plazentare alkalische Phosphatase (PLAP)8,9, die Plazenta-abgeleitete zirkulierende kleine EVs (PDsEVs) in der Schwangerschaft nachweist. Außerdem hilft PLAP dabei, Veränderungen in der PDsEV-Fracht und deren Auswirkungen bei Präeklampsie im Vergleich zu normotensiven Schwangerschaften zu erkennen 10,11,12,13,14,15.

Die Plazenta wurde als notwendige Komponente in der Pathophysiologie der Präeklampsie16 oder der zerebralen Komplikationen im Zusammenhang mit dieser Erkrankung anerkannt 17,18,19. Es ist jedoch nicht bekannt, wie dieses entfernte Organ Veränderungen in der Gehirnzirkulation hervorrufen könnte. Da sEVs aufgrund ihrer Fähigkeit, bioaktive Komponenten von Spender- auf Empfängerzellen zu übertragen, eine zentrale Rolle in der Zell-zu-Zell-Kommunikation spielen 6,20,21, haben eine wachsende Anzahl von Studien plazentare sEVs mit der Entstehung von mütterlicher endothelialer Dysfunktion in Verbindung gebracht 21,22,23,24, einschließlich Gehirnendothelzellen 25,26bei Frauen mit Präeklampsie. Daher kann die Beeinträchtigung der Endothelfunktion des Gehirns zu einer Störung der Blut-Hirn-Schranke (BHS) führen, einer kritischen Komponente bei zerebrovaskulären Komplikationen im Zusammenhang mit Präeklampsie 3,27.

Nichtsdestotrotz berichteten präklinische Befunde mit Hirngefäßen von Ratten, die dem Serum von Frauen mit Präeklampsie28 ausgesetzt waren, oder menschlichen Gehirnendothelzellen, die dem Plasma von Frauen mit Präeklampsie29 ausgesetzt waren, dass zirkulierende Faktoren eine Störung der BHS induzieren. Trotz mehrerer Kandidaten, die das Potenzial haben, die BHS zu schädigen, die während der Präeklampsie im mütterlichen Kreislauf vorhanden sind, wie z. B. erhöhte Spiegel von proinflammatorischen Zytokinen (d. h. Tumornekrosefaktor)18,28 oder vaskulären Regulatoren (d. h. vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor (VEGF))29,30,31 oder oxidativen Molekülen wie oxidierten Lipoproteinen (Oxo-LDL)32,33, unter anderem34stellt keine von ihnen eine direkte Verbindung zwischen der Plazenta und der BHS her. Kürzlich haben sEVs, die aus hypoxischen Plazenten isoliert wurden, gezeigt, dass sie die BHS bei nicht schwangeren weiblichen Mäusen störenkönnen 25. Da plazentare sEVs die meisten der aufgeführten zirkulierenden Faktoren mit der Fähigkeit tragen können, die BHS zu stören, gelten sEVs als geeignete Kandidaten, um die verletzte Plazenta zu verbinden, Träger schädlicher zirkulierender Faktoren zu sein und die BHS bei Präeklampsie zu stören.

Dieses Protokoll ermöglicht es uns, zu untersuchen, ob sEVs, die aus Plazenta-Explantaten isoliert wurden, die unter hypoxischen Bedingungen kultiviert wurden, die BHS in nicht schwangeren weiblichen Mäusen stören können, um die Pathophysiologie von zerebralen Komplikationen während der Präeklampsie zu verstehen.

Protocol

Die Forschung wurde nach den in der Deklaration von Helsinki formulierten Prinzipien und mit Genehmigung der jeweiligen Ethik-Prüfungsausschüsse durchgeführt. Alle menschlichen Teilnehmer gaben vor der Probenentnahme ihre Einverständniserklärung, wie bereits berichtet25. Darüber hinaus hat die Kommission für Bioethik und Biosicherheit der Universität Bío-Bío dieses Projekt genehmigt (Fondecyt-Stipendium 1200250). Die Tierarbeit wurde in Übereinstimmung mit den Grundprinzipien der drei R…

Representative Results

Dieses Protokoll bewertet die Fähigkeit von sEVs, die aus Plazenten gewonnen werden, die in Hypoxie kultiviert wurden, die BHS bei nicht schwangeren Mäusen zu stören. Diese Methode ermöglicht es, die mögliche Verbindung zwischen der Plazenta und dem Gehirn unter normalen und pathologischen Bedingungen besser zu verstehen. Insbesondere kann diese Methode einen Proxy für die Analyse der Beteiligung von plazentaren sEVs am Auftreten von zerebralen Komplikationen bei Präeklampsie darstellen. <p class="jove_content…

Discussion

Diese Studie enthüllt neue Erkenntnisse über mögliche Schäden, die sich aus Plazenta-Explantaten isolieren, die unter hypoxischen Bedingungen kultiviert wurden, auf die Störung der Blut-Hirn-Schranke von Nagetieren ergeben. Der pathologische Mechanismus beinhaltet eine Reduktion von CLND-5 in der hinteren Hirnregion25.

Frühere Untersuchungen haben gezeigt, dass Plasma-sEVs von Personen mit Präeklampsie eine endotheliale Dysfunktion in verschiedenen Organen unter …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken den Forscherinnen und Forschern von GRIVAS Health für ihren wertvollen Input. Auch Hebammen und klinisches Personal des Geburtshilfe- und Gynäkologiedienstes gehören zum Hospital de Chillan, Chile. Gegründet von Fondecyt Regular 1200250.

Materials

Adult mice brain slecer matrice 3D printed Open access file Adult mice Adult mice brain slicer. Printed in PLA filament.
Anti β-Actin primary antibody Sigma-Aldrich Clon AC-74 Antibody for loading control (Western blot)
Anti-Claudin5 primary antibody Santa cruz Biotechnology sc-374221 Primary antibody for tight junction protein CLDN5 of mice BBB (Western blot)
BCA protein kit Thermo Scientific 23225 Kit for measuring protein concentration
Culture media #200 500 mL Thermo Fisher Scientific m200500 Culture media for placental explants
D180 CO2 incubator RWD Life science D180 Standard incubator to estabilize explants and culture sEVs-Nor
Evans blue dye  > 75% 10 g Sigma-Aldrich E2129.10G Dye to analize blood brain barrier disruption IN VIVO
Fetal bovine serum 500 mL Thermo Fisher Scientific 16000044 Additive growth factor for culture media 200
Himac Ultracentrifuge CP100NX Himac eppendorf group 5720410101 Ultracentrifuge for condicioned media > 1,20,000 x g
ImageJ software NIH https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Isoflurane x 100 mL USP Baxter 212-094 Volatile inhalated anaesthesia agent for mice
Kit CellTiter 96 Non-radioactive  Promega 0000105232 In vitro assay for placental explants viability
Mouse IgG Secondary antibody Thermo Fisher Scientific MO 63103 Secondary antibody for CLDN5 (western blot)
NanoSight NS300 Malvern Panalytical 90278090 Nanotracking analysis of particles from placental explants condicioned media
Paraformaldehide E 97% solution 500 mL Thermo Fisher Scientific A11313.22 Fixative solution for brain tissue slices and intracardial perfusion (once diluted)
PBS 1 X pH 7.4 500 mL Thermo Fisher Scientific 10010023 Wash solution for placenta explants
Peniciline-streptomicine 100x 20 mL Thermo Fisher Scientific 10378016 Antiobiotics for placental explants culture media
ProOX C21 Cytocentric O2 and CO2 Subchamber Controller BioSpherix SCR_021131 CO2 regulator to induce Hypoxia in sealed chamber for sEVs-Hyp
Sodium Thiopental 1 g Chemie 7061 humanitarian euthanasia agent
Somnosuite low flow anesthesia system Kent Scientifics SS-01 Isoflurane vaporizer for small rodents
Surgical Warming platform Kent Scientifics A41166 Warming platform for mainteinance anesthesia in mice
Syringe Filters, Polytetrafluoroethylene (PTFE), Hydrophobic, 0.22 µm, Sterile, 25 mm Southern labware 10026 Filtration of condicioned media harvested from placental explants 
Tabletop High-Speed Micro Centrifuges HITACHI himac CT15E/CT15RE Hitachi medical systems 6020 Serial centrifugations of condicioned media < 1,20, 000 x g
Trinocular stereomicroscope transmided and reflective light 10x-160x  Center Medical 2597 Stereomicroscope to register brain slices
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Sandoval, H., León, J., Troncoso, F., de la Hoz, V., Cisterna, A., Contreras, M., Castro, F. O., Ibañez, B., Acurio, J., Escudero, C. Disruption of the Mouse Blood-Brain Barrier by Small Extracellular Vesicles from Hypoxic Human Placentas. J. Vis. Exp. (203), e65867, doi:10.3791/65867 (2024).
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