בידוד אסטרוציטים טהורים ותאי מיקרוגליה מחוט השדרה של העכבר הבוגר עבור בדיקות חוץ גופיות ומחקרי שעתוק
Summary
פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של אסטרוציטים מטוהרים ותאי מיקרוגליה מחוט השדרה של העכבר הבוגר, ומקל על יישומים עתידיים כגון ניתוח RNA ותרבית תאים. הוא כולל שיטות ונהלים מפורטים לדיסוציאציה של תאים שנועדו לשפר הן את האיכות והן את התפוקה של תאים מבודדים.
Abstract
אסטרוציטים ותאי מיקרוגליה ממלאים תפקידים מרכזיים בהתפתחות מערכת העצבים המרכזית, תגובות פציעה ומחלות נוירודגנרטיביות. תאים דינמיים מאוד אלה מפגינים תגובות מהירות לשינויים סביבתיים ומפגינים הטרוגניות משמעותית במונחים של מורפולוגיה, פרופילי שעתוק ופונקציות. בעוד שהבנתנו את תפקודם של תאי גלייה בבריאות ובמחלות התקדמה באופן משמעותי, עדיין יש צורך בניתוחים חוץ-גופיים, ספציפיים לתאים שנערכו בהקשר של עלבונות או פציעות כדי לאפיין באופן מקיף אוכלוסיות תאים נפרדות. בידוד תאים מהעכבר הבוגר מציע מספר יתרונות על פני קווי תאים או בעלי חיים בילוד, שכן הוא מאפשר ניתוח של תאים בתנאים פתולוגיים ובנקודות זמן ספציפיות. יתר על כן, התמקדות בבידוד ספציפי לחוט השדרה, למעט מעורבות מוחית, מאפשרת מחקר על פתולוגיות של חוט השדרה, כולל אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית, פגיעה בחוט השדרה וטרשת אמיוטרופית צידית. פרוטוקול זה מציג שיטה יעילה לבידוד אסטרוציטים ותאי מיקרוגליה מחוט השדרה של העכבר הבוגר, ומאפשר ניתוח מיידי או עתידי עם יישומים פוטנציאליים במחקרים פונקציונליים, מולקולריים או פרוטאומיים במורד הזרם.
Introduction
אסטרוציטים ותאי מיקרוגליה הם תאי גלייה רב-תכליתיים הממלאים תפקידים חיוניים במערכת העצבים המרכזית (CNS), וכוללים תחומי אחריות כגון ויסות התפקוד העצבי, תרומה להתפתחות מערכת העצבים המרכזית, שמירה על מחסום הדם-מוח והשתתפות בתהליכים קריטיים אחרים 1,2,3,4 . מלבד תפקידם בשמירה על הומאוסטזיס, תאי גלייה אלה ממלאים גם תפקיד מרכזי במנגנוני פציעה ותיקון. תאי מיקרוגליה ידועים ביכולות הפאגוציטיות, הדלקתיות והנדידה שלהם בעקבות עלבונות או פציעות 5,6,7. תגובות אסטרוציטים במחלות מגוונות באותה מידה, וכוללות תרומות לדלקת, להיווצרות צלקות גלייה ולפשרה של מחסום הדם-מוח 8,9. למרות שהבנתנו את התפקידים המזיקים והמשניים של מיקרוגליה ואסטרוציטים במערכת העצבים המרכזית גדלה, ההטרוגניות המובנית הן במבנה והן בתפקוד שלהם מחייבת כלים חזקים לחקור אותם בהקשרים שונים.
השגת תובנה נוספת לגבי תפקידם של מיקרוגליה ואסטרוציטים בבריאות ובמחלות דורשת גישה משולבת של חקירות in vivo ו – in vitro . טכניקות In vivo ממנפות את האינטראקציה המורכבת בין תאי גלייה ונוירונים בתוך מערכת העצבים המרכזית, בעוד שמתודולוגיות in vitro מוכיחות ערך בעת הערכת תפקודים או תגובות של תא בודד תחת גירויים ספציפיים. כל שיטה מציעה יתרונות ייחודיים; מחקרי מבחנה חיוניים להבנת התפקידים הספציפיים של סוגי תאים אלה ללא קלט ישיר או עקיף מתאים שכנים. בנוסף, בדיקות במבחנה המשתמשות בקווי תאים בני אלמוות מציגות יתרונות מסוימים, כולל היכולת להתרבות ללא הגבלת זמן, יעילות כלכלית וקלות תחזוקה. עם זאת, חשוב לציין כי תאים ראשוניים מחקים באופן הדוק יותר תגובות פיזיולוגיות נורמליות בהשוואה לקווי תאים. רלוונטיות פיזיולוגית זו חיונית בבדיקות תפקודיות ובניתוחים תעתיקים.
אחד האתגרים בהשגת תאים ראשוניים, במיוחד מחוט השדרה של עכבר בוגר, טמון בכמות ובכדאיות הדגימות. חוט השדרה הבוגר, בהיותו קטן יותר מהמוח ומכיל כמות משמעותית של מיאלין, מציב קשיים ייחודיים. בעוד שישנם מספר פרוטוקולים שפורסמו המפרטים את הבידוד של תאי גלייה טהורים וברי קיימא מבעלי חיים בילודים או ממוח העכבר הבוגר 10,11,12,13, מתודולוגיות אלה עשויות שלא להתאים לחקר מחלות ופציעות ספציפיות לחוט השדרה. בפרוטוקול זה, אנו מציעים הליך מקיף לבידוד יעיל של מיקרוגליה ואסטרוציטים טהורים וברי קיימא מחוט השדרה של העכבר הבוגר, מה שמקל על יישומים במורד הזרם בתרביות תאים ובניתוחי שעתוק. פרוטוקול זה שימש בהצלחה לבידוד תאים אלה מעכברים בוגרים בגילאי 10 שבועות עד 5 חודשים, והדגים את יעילותו בהקשרים שונים, כולל מחקרים שכללו עכברי נוקאאוט מותנה, תגובות לתרופות, מחקר התפתחותי ומודלים הקשורים לגיל.
Protocol
Representative Results
Discussion
הבידוד של תאים ראשוניים טהורים וברי קיימא הוא בעל חשיבות עליונה לחקר המבנה והתפקוד של סוגי תאים ספציפיים. בעכבר בוגר, במיוחד בחוט השדרה, משימה זו מציבה אתגרים משמעותיים, מכיוון שהפרוטוקולים הקיימים לרוב אינם מותאמים לחוט השדרה הבוגר10,17. פרוטוקול זה מציג שי?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לקאסל ראלי ב-George Washington University Genomics Core עבור ניתוחי RNA ול-Q2 Lab Solutions עבור ניתוחי ריצוף RNA. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ מוחי [מענק מספר F31NS117085] וקרן המחקר ע”ש ויויאן גיל לד”ר רוברט ה. מילר. איור 1 נוצר באמצעות BioRender.com.
Materials
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma Aldrich | T48402 | |
| 24 well tissue culture plate | Avantor | 10861-558 | |
| 2-Methyl-2-butanol, 98% | Thermo Fisher | A18304-0F | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride | Invitrogen | D1306 | 1:1000 |
| 45% glucose solution | Corning | 25-037-CI | |
| 5 mL capped tubes | Eppendorf | 30122305 | |
| Acetic acid | Sigma-Adlrich | A6283 | |
| Adult Brain Dissociation Kit | Miltenyi | 103-107-677 | |
| Anti-ACSA2 Microbead Kit | Miltenyi | 130-097-679 | |
| Anti-Iba1 | Wako | 019-1974 | |
| Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | |
| C57BL/6J wild-type (WT) mice | Jackson Laboratories | ||
| CD11b (Microglia) MicroBeads | Miltenyi | 130-093-634 | |
| Celltrics 30 µm filter | Sysmex Partec | 04-004-2326 | |
| Counting Chamber (Hemacytometer) | Hausser Scientific Co | 3200 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma Aldrich | D4527-40KU | |
| Distilled water | TMO | 15230001 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher | 11320074 | |
| DNase for RNA purification | Qiagen | 79254 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Thermo Fisher | 14040117 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | A5209401 | |
| GFAP antibody (mouse) | Santa Cruz | sc-33673 | 1:500 |
| GFAP antibody (rabbit) | Dako | Z0334 | 1:500 |
| Goat anti-mouse 594 IgG | Invitrogen | a11032 | 1:500 |
| Goat anti-mouse 594 IgM | Invitrogen | a21044 | 1:300 |
| Goat anti-Rabbit 488 IgG | Invitrogen | a11008 | 1:500 |
| Iba1 antibody (rabbit) | Wako | 019-1974 | 1:500 |
| MACS Separator | Miltenyi | 130-042-303 | |
| Masterflex C/L Pump System | Thermo Fisher | 77122-22 | |
| MEM | Corning | 15-015-CV | |
| Methanol | Sigma-Adlrich | 439193 | |
| Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000-10 | |
| MS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| O4 Antibody | R&D | MAB1326 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| Plugged 9" glass pasteur pipette | VWR | 14672-412 | |
| RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| Royal-tek Surgical scalpel blade no. 10 | Fisher scientific | 22-079-683 | |
| Small Vein Infusion Set, 23 G x 19 mm | Kawasumi | D3K2-23G |
References
- Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nat Rev Neurosci. 7, 41-53 (2006).
- Heithoff, B. P., et al. Astrocytes are necessary for blood-brain barrier maintenance in the adult mouse brain. Glia. 69 (2), 436-472 (2021).
- Badimon, A., et al. Negative feedback control of neuronal activity by microglia. Nature. 586, 417-423 (2020).
- Yanuck, S. F. Microglial phagocytosis of neurons: diminishing neuronal loss in traumatic, infectious, inflammatory, and autoimmune CNS disorders. Front Psychiatry. 10, 712 (2019).
- Xu, Y. J., Au, N. P. B., Ma, C. H. E. Functional and phenotypic diversity of microglia: implication for microglia-based therapies for alzheimer’s disease. Front Aging Neurosci. 14, 896852 (2022).
- Song, S., et al. Microglial-oligodendrocyte interactions in myelination and neurological function recovery after traumatic brain injury. J Neuroinflammation. 19 (1), 246 (2022).
- Butler, C. A., et al. Microglial phagocytosis of neurons in neurodegeneration, and its regulation. J Neurochem. 158 (3), 621-639 (2021).
- Voskuhl, R. R., et al. Reactive astrocytes form scar-like perivascular barriers to leukocytes during adaptive immune inflammation of the CNS. J Neurosci. 29 (37), 11511-11522 (2009).
- Bordon, Y. MAFG activity in astrocytes drives CNS inflammation. Nature Reviews Immunology. 20, 205 (2020).
- Agalave, N. M., Lane, B. T., Mody, P. H., Szabo-Pardi, T. A., Burton, M. D. Isolation, culture, and downstream characterization of primary microglia and astrocytes from adult rodent brain and spinal cord. J Neurosci Methods. 340, 108742 (2020).
- Kerstetter, A. E., Miller, R. H. Isolation and culture of spinal cord astrocytes. Methods in Molecular Biology. 814, 93-104 (2012).
- Hersbach, B. A., Simon, T., Masserdotti, G. Isolation and direct neuronal reprogramming of mouse astrocytes. J Vis Exp. (185), 64175 (2022).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. J Neuroinflammation. 9, 147 (2012).
- Richner, M., Jager, S. B., Siupka, P., Vaegter, C. B. Hydraulic extrusion of the spinal cord and isolation of dorsal root ganglia in rodents. J Vis Exp. (119), e55226 (2017).
- Davies, J., Denyer, T., Hadfield, J. Bioanalyzer chips can be used interchangeably for many analyses of DNA or RNA. Biotechniques. 60 (4), 197-199 (2016).
- Ahn, J. J., Islam, Y., Miller, R. H. Cell type specific isolation of primary astrocytes and microglia from adult mouse spinal cord. J Neurosci Methods. 375, 109599 (2022).
- Pan, J., Wan, J. Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain. J Immunol Methods. 486, 112834 (2020).
- Neuschulz, A., et al. A single-cell RNA labeling strategy for measuring stress response upon tissue dissociation. Mol Syst Biol. 19, 11147 (2023).
- CB, S., et al. One brain-all cells: a comprehensive protocol to isolate all principal cns-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice. Cells. 10 (3), 1-25 (2021).
