Isolamento de Astrócitos Puros e Microglia da Medula Espinhal de Camundongos Adultos para Ensaios In Vitro e Estudos Transcriptômicos
Summary
Este protocolo descreve o isolamento de astrócitos purificados e microglia da medula espinhal de camundongos adultos, facilitando aplicações subsequentes, como análise de RNA e cultura celular. Inclui métodos e procedimentos detalhados de dissociação celular projetados para melhorar a qualidade e o rendimento das células isoladas.
Abstract
Astrócitos e micróglia desempenham papéis fundamentais no desenvolvimento do sistema nervoso central, respostas a lesões e doenças neurodegenerativas. Essas células altamente dinâmicas exibem respostas rápidas às mudanças ambientais e exibem significativa heterogeneidade em termos de morfologia, perfis transcricionais e funções. Embora nossa compreensão das funções das células gliais na saúde e na doença tenha avançado substancialmente, permanece a necessidade de análises in vitro, células-específicas conduzidas no contexto de insultos ou lesões para caracterizar de forma abrangente populações celulares distintas. O isolamento de células do camundongo adulto oferece várias vantagens sobre linhagens celulares ou animais neonatais, pois permite a análise de células em condições patológicas e em momentos específicos. Além disso, o foco no isolamento específico da medula espinhal, excluindo o envolvimento cerebral, permite a pesquisa de patologias da medula espinhal, incluindo encefalomielite autoimune experimental, lesão medular e esclerose lateral amiotrófica. Este protocolo apresenta um método eficiente para isolar astrócitos e micróglias da medula espinhal de camundongos adultos, facilitando análises imediatas ou futuras com potenciais aplicações em estudos funcionais, moleculares ou proteômicos a jusante.
Introduction
Os astrócitos e a microglia são células gliais versáteis que desempenham papéis vitais no sistema nervoso central (SNC), englobando responsabilidades como regular a função neuronal, contribuir para o desenvolvimento do SNC, manter a barreira hematoencefálica e participar de outros processos críticos 1,2,3,4 . Além de seu papel na manutenção da homeostase, essas células gliais também desempenham um papel fundamental nos mecanismos de lesão e reparo. As microglias são bem conhecidas por suas capacidades fagocíticas, inflamatórias e migratórias após insultos ou lesões 5,6,7. As respostas astrocitárias na doença são igualmente diversas, englobando contribuições para a inflamação, a formação de cicatrizes gliais e o comprometimento da barreira hematoencefálica 8,9. Embora nossa compreensão dos papéis prejudiciais e reparadores da micróglia e dos astrócitos no SNC tenha crescido, a heterogeneidade inerente em sua estrutura e função requer ferramentas robustas para estudá-los em vários contextos.
Obter mais informações sobre os papéis da micróglia e dos astrócitos na saúde e na doença requer uma abordagem combinada de investigações in vivo e in vitro . Técnicas in vivo alavancam o intrincado crosstalk entre células gliais e neurônios dentro do SNC, enquanto metodologias in vitro mostram-se valiosas ao avaliar funções ou respostas unicelulares sob estímulos específicos. Cada método oferece vantagens únicas; Estudos in vitro são essenciais para a compreensão dos papéis específicos desses tipos celulares sem a entrada direta ou indireta de células vizinhas. Além disso, ensaios in vitro utilizando linhagens celulares imortais apresentam certos benefícios, incluindo a capacidade de proliferação indefinida, custo-benefício e facilidade de manutenção. No entanto, é importante notar que as células primárias imitam mais de perto as respostas fisiológicas normais em comparação com as linhagens celulares. Essa relevância fisiológica é crucial em ensaios funcionais e análises transcriptômicas.
Um dos desafios na obtenção de células primárias, particularmente da medula espinhal de camundongos adultos, está na quantidade e viabilidade das amostras. A medula espinhal adulta, sendo menor que o cérebro e contendo uma quantidade significativa de mielina, apresenta dificuldades únicas. Embora existam vários protocolos publicados detalhando o isolamento de células gliais puras e viáveis de animais neonatais ou do cérebro de camundongos adultos 10,11,12,13, essas metodologias podem não ser adequadas para o estudo de doenças e lesões específicas da medula espinhal. Neste protocolo, oferecemos um procedimento abrangente para isolar eficientemente a micróglia e os astrócitos puros e viáveis da medula espinhal de camundongos adultos, facilitando aplicações a jusante em cultura de células e análises transcriptômicas. Este protocolo tem sido empregado com sucesso para isolar essas células de camundongos adultos com idade entre 10 semanas e 5 meses, demonstrando sua utilidade em vários contextos, incluindo estudos envolvendo camundongos knockout condicionais, respostas a drogas, pesquisa de desenvolvimento e modelos relacionados à idade.
Protocol
Representative Results
Discussion
O isolamento de células primárias puras e viáveis é fundamental para investigar a estrutura e função de tipos celulares específicos. Em camundongos adultos, particularmente na medula espinhal, essa tarefa apresenta desafios significativos, pois os protocolos existentes muitas vezes não são adaptados à medula espinhaladulta10,17. Este protocolo apresenta um método eficiente e custo-efetivo aplicável a várias aplicações a jusante, incluindo cultura c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Castle Raley no George Washington University Genomics Core pelas análises de RNA e ao Q2 Lab Solutions pelas análises de sequenciamento de RNA. Este trabalho foi apoiado pelo National Institute of Neurological Disorders and Stroke [bolsa número F31NS117085] e pelo Vivian Gill Research Endowment ao Dr. Robert H. Miller. A Figura 1 foi criada com BioRender.com.
Materials
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma Aldrich | T48402 | |
| 24 well tissue culture plate | Avantor | 10861-558 | |
| 2-Methyl-2-butanol, 98% | Thermo Fisher | A18304-0F | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride | Invitrogen | D1306 | 1:1000 |
| 45% glucose solution | Corning | 25-037-CI | |
| 5 mL capped tubes | Eppendorf | 30122305 | |
| Acetic acid | Sigma-Adlrich | A6283 | |
| Adult Brain Dissociation Kit | Miltenyi | 103-107-677 | |
| Anti-ACSA2 Microbead Kit | Miltenyi | 130-097-679 | |
| Anti-Iba1 | Wako | 019-1974 | |
| Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | |
| C57BL/6J wild-type (WT) mice | Jackson Laboratories | ||
| CD11b (Microglia) MicroBeads | Miltenyi | 130-093-634 | |
| Celltrics 30 µm filter | Sysmex Partec | 04-004-2326 | |
| Counting Chamber (Hemacytometer) | Hausser Scientific Co | 3200 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma Aldrich | D4527-40KU | |
| Distilled water | TMO | 15230001 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher | 11320074 | |
| DNase for RNA purification | Qiagen | 79254 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Thermo Fisher | 14040117 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | A5209401 | |
| GFAP antibody (mouse) | Santa Cruz | sc-33673 | 1:500 |
| GFAP antibody (rabbit) | Dako | Z0334 | 1:500 |
| Goat anti-mouse 594 IgG | Invitrogen | a11032 | 1:500 |
| Goat anti-mouse 594 IgM | Invitrogen | a21044 | 1:300 |
| Goat anti-Rabbit 488 IgG | Invitrogen | a11008 | 1:500 |
| Iba1 antibody (rabbit) | Wako | 019-1974 | 1:500 |
| MACS Separator | Miltenyi | 130-042-303 | |
| Masterflex C/L Pump System | Thermo Fisher | 77122-22 | |
| MEM | Corning | 15-015-CV | |
| Methanol | Sigma-Adlrich | 439193 | |
| Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000-10 | |
| MS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| O4 Antibody | R&D | MAB1326 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| Plugged 9" glass pasteur pipette | VWR | 14672-412 | |
| RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| Royal-tek Surgical scalpel blade no. 10 | Fisher scientific | 22-079-683 | |
| Small Vein Infusion Set, 23 G x 19 mm | Kawasumi | D3K2-23G |
References
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