Isolierung von reinen Astrozyten und Mikroglia aus dem Rückenmark adulter Mäuse für In-vitro-Assays und Transkriptomstudien
Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von gereinigten Astrozyten und Mikroglia aus dem Rückenmark der erwachsenen Maus und erleichtert spätere Anwendungen wie RNA-Analyse und Zellkultur. Es umfasst detaillierte Zelldissoziationsmethoden und -verfahren, die darauf ausgelegt sind, sowohl die Qualität als auch die Ausbeute isolierter Zellen zu verbessern.
Abstract
Astrozyten und Mikroglia spielen eine zentrale Rolle bei der Entwicklung des zentralen Nervensystems, bei Verletzungsreaktionen und bei neurodegenerativen Erkrankungen. Diese hochdynamischen Zellen reagieren schnell auf Umweltveränderungen und weisen eine signifikante Heterogenität in Bezug auf Morphologie, Transkriptionsprofile und Funktionen auf. Während unser Verständnis der Funktionen von Gliazellen in Gesundheit und Krankheit erheblich fortgeschritten ist, besteht nach wie vor Bedarf an zellspezifischen In-vitro-Analysen, die im Zusammenhang mit Beleidigungen oder Verletzungen durchgeführt werden, um unterschiedliche Zellpopulationen umfassend zu charakterisieren. Die Isolierung von Zellen aus der adulten Maus bietet mehrere Vorteile gegenüber Zelllinien oder neonatalen Tieren, da sie die Analyse von Zellen unter pathologischen Bedingungen und zu bestimmten Zeitpunkten ermöglicht. Darüber hinaus ermöglicht die Fokussierung auf die rückenmarksspezifische Isolierung unter Ausschluss der Hirnbeteiligung die Erforschung von Rückenmarkspathologien, einschließlich experimenteller autoimmuner Enzephalomyelitis, Rückenmarksverletzungen und amyotropher Lateralsklerose. Dieses Protokoll stellt eine effiziente Methode zur Isolierung von Astrozyten und Mikroglia aus dem Rückenmark der erwachsenen Maus dar und erleichtert die unmittelbare oder zukünftige Analyse mit potenziellen Anwendungen in funktionellen, molekularen oder proteomischen Downstream-Studien.
Introduction
Astrozyten und Mikroglia sind vielseitige Gliazellen, die eine wichtige Rolle im zentralen Nervensystem (ZNS) spielen und Aufgaben wie die Regulierung der neuronalen Funktion, den Beitrag zur Entwicklung des ZNS, die Aufrechterhaltung der Blut-Hirn-Schranke und die Beteiligung an anderen kritischen Prozessen übernehmen 1,2,3,4 . Neben ihrer Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase spielen diese Gliazellen auch eine zentrale Rolle bei Verletzungs- und Reparaturmechanismen. Mikroglia sind bekannt für ihre phagozytären, entzündlichen und migrierenden Fähigkeiten nach Beleidigungen oder Verletzungen 5,6,7. Die Reaktionen von Astrozyten auf Krankheiten sind ebenso vielfältig und umfassen Beiträge zu Entzündungen, zur Bildung von Glianarben und zur Beeinträchtigung der Blut-Hirn-Schranke 8,9. Obwohl unser Verständnis der schädlichen und reparierenden Rolle von Mikroglia und Astrozyten im ZNS gewachsen ist, erfordert die inhärente Heterogenität sowohl in ihrer Struktur als auch in ihrer Funktion robuste Werkzeuge, um sie in verschiedenen Kontexten zu untersuchen.
Um weitere Einblicke in die Rolle von Mikroglia und Astrozyten in Gesundheit und Krankheit zu gewinnen, ist ein kombinierter Ansatz von In-vivo – und In-vitro-Untersuchungen erforderlich. In-vivo-Techniken nutzen die komplizierte Kommunikation zwischen Gliazellen und Neuronen innerhalb des ZNS, während sich In-vitro-Methoden als wertvoll erweisen, wenn es darum geht, Einzelzellfunktionen oder -reaktionen unter bestimmten Stimuli zu beurteilen. Jede Methode bietet einzigartige Vorteile; In-vitro-Studien sind unerlässlich, um die spezifischen Rollen dieser Zelltypen ohne direkten oder indirekten Input von benachbarten Zellen zu verstehen. Darüber hinaus bieten In-vitro-Assays mit unsterblichen Zelllinien bestimmte Vorteile, darunter die Fähigkeit, sich unbegrenzt zu vermehren, Kosteneffizienz und einfache Wartung. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass Primärzellen im Vergleich zu Zelllinien normale physiologische Reaktionen besser nachahmen. Diese physiologische Relevanz ist bei funktionellen Assays und transkriptomischen Analysen von entscheidender Bedeutung.
Eine der Herausforderungen bei der Gewinnung von Primärzellen, insbesondere aus dem Rückenmark adulter Mäuse, liegt in der Menge und Lebensfähigkeit der Proben. Das Rückenmark von Erwachsenen ist kleiner als das Gehirn und enthält eine beträchtliche Menge an Myelin und stellt einzigartige Schwierigkeiten dar. Es gibt zwar mehrere veröffentlichte Protokolle, die die Isolierung reiner, lebensfähiger Gliazellen aus neugeborenen Tieren oder dem erwachsenen Mäusegehirn beschreiben 10,11,12,13, aber diese Methoden sind möglicherweise nicht für die Untersuchung von Erkrankungen und Verletzungen geeignet, die spezifisch für das Rückenmark sind. In diesem Protokoll bieten wir ein umfassendes Verfahren zur effizienten Isolierung reiner, lebensfähiger Mikroglia und Astrozyten aus dem Rückenmark der adulten Maus an, was nachgelagerte Anwendungen in Zellkulturen und transkriptomischen Analysen erleichtert. Dieses Protokoll wurde erfolgreich eingesetzt, um diese Zellen aus erwachsenen Mäusen im Alter von 10 Wochen bis 5 Monaten zu isolieren, was seine Nützlichkeit in verschiedenen Kontexten unter Beweis stellte, einschließlich Studien mit konditionalen Knockout-Mäusen, Arzneimittelreaktionen, Entwicklungsforschung und altersbezogenen Modellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Isolierung reiner, lebensfähiger Primärzellen ist von größter Bedeutung, um die Struktur und Funktion bestimmter Zelltypen zu untersuchen. Bei der adulten Maus, insbesondere im Rückenmark, stellt diese Aufgabe erhebliche Herausforderungen dar, da bestehende Protokolle oft nicht auf das adulte Rückenmark zugeschnitten sind10,17. Dieses Protokoll stellt eine effiziente und kostengünstige Methode dar, die für verschiedene nachgelagerte Anwendungen anwend…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Castle Raley vom George Washington University Genomics Core für RNA-Analysen und Q2 Lab Solutions für RNA-Sequenzierungsanalysen. Diese Arbeit wurde vom National Institute of Neurological Disorders and Stroke [Fördernummer F31NS117085] und dem Vivian Gill Research Endowment an Dr. Robert H. Miller unterstützt. Abbildung 1 wurde mit BioRender.com erstellt.
Materials
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma Aldrich | T48402 | |
| 24 well tissue culture plate | Avantor | 10861-558 | |
| 2-Methyl-2-butanol, 98% | Thermo Fisher | A18304-0F | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride | Invitrogen | D1306 | 1:1000 |
| 45% glucose solution | Corning | 25-037-CI | |
| 5 mL capped tubes | Eppendorf | 30122305 | |
| Acetic acid | Sigma-Adlrich | A6283 | |
| Adult Brain Dissociation Kit | Miltenyi | 103-107-677 | |
| Anti-ACSA2 Microbead Kit | Miltenyi | 130-097-679 | |
| Anti-Iba1 | Wako | 019-1974 | |
| Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | |
| C57BL/6J wild-type (WT) mice | Jackson Laboratories | ||
| CD11b (Microglia) MicroBeads | Miltenyi | 130-093-634 | |
| Celltrics 30 µm filter | Sysmex Partec | 04-004-2326 | |
| Counting Chamber (Hemacytometer) | Hausser Scientific Co | 3200 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma Aldrich | D4527-40KU | |
| Distilled water | TMO | 15230001 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher | 11320074 | |
| DNase for RNA purification | Qiagen | 79254 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Thermo Fisher | 14040117 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | A5209401 | |
| GFAP antibody (mouse) | Santa Cruz | sc-33673 | 1:500 |
| GFAP antibody (rabbit) | Dako | Z0334 | 1:500 |
| Goat anti-mouse 594 IgG | Invitrogen | a11032 | 1:500 |
| Goat anti-mouse 594 IgM | Invitrogen | a21044 | 1:300 |
| Goat anti-Rabbit 488 IgG | Invitrogen | a11008 | 1:500 |
| Iba1 antibody (rabbit) | Wako | 019-1974 | 1:500 |
| MACS Separator | Miltenyi | 130-042-303 | |
| Masterflex C/L Pump System | Thermo Fisher | 77122-22 | |
| MEM | Corning | 15-015-CV | |
| Methanol | Sigma-Adlrich | 439193 | |
| Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000-10 | |
| MS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| O4 Antibody | R&D | MAB1326 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| Plugged 9" glass pasteur pipette | VWR | 14672-412 | |
| RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| Royal-tek Surgical scalpel blade no. 10 | Fisher scientific | 22-079-683 | |
| Small Vein Infusion Set, 23 G x 19 mm | Kawasumi | D3K2-23G |
References
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