عزل الخلايا النجمية النقية والدبقية الصغيرة من الحبل الشوكي للفأر البالغ للمقايسات المختبرية والدراسات النسخية
Summary
يحدد هذا البروتوكول عزل الخلايا النجمية المنقاة والخلايا الدبقية الصغيرة من الحبل الشوكي للفأر البالغ ، مما يسهل التطبيقات اللاحقة مثل تحليل الحمض النووي الريبي وزراعة الخلايا. ويشمل طرق وإجراءات تفكك الخلايا التفصيلية المصممة لتحسين جودة وإنتاجية الخلايا المعزولة.
Abstract
تلعب الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة أدوارا محورية في تطوير الجهاز العصبي المركزي ، واستجابات الإصابات ، والأمراض التنكسية العصبية. تظهر هذه الخلايا الديناميكية للغاية استجابات سريعة للتغيرات البيئية وتظهر عدم تجانس كبير من حيث التشكل وملامح النسخ والوظائف. في حين أن فهمنا لوظائف الخلايا الدبقية في الصحة والمرض قد تقدم بشكل كبير ، لا تزال هناك حاجة إلى تحليلات مخبرية خاصة بالخلايا يتم إجراؤها في سياق الإهانات أو الإصابات لتوصيف مجموعات الخلايا المتميزة بشكل شامل. يوفر عزل الخلايا من الفأر البالغ العديد من المزايا على خطوط الخلايا أو الوليدية ، لأنه يسمح بتحليل الخلايا في ظل الظروف المرضية وفي نقاط زمنية محددة. علاوة على ذلك ، فإن التركيز على العزلة الخاصة بالحبل الشوكي ، باستثناء مشاركة الدماغ ، يمكن من إجراء أبحاث في أمراض الحبل الشوكي ، بما في ذلك التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي ، وإصابة الحبل الشوكي ، والتصلب الجانبي الضموري. يقدم هذا البروتوكول طريقة فعالة لعزل الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة من الحبل الشوكي للفأر البالغ ، مما يسهل التحليل الفوري أو المستقبلي مع التطبيقات المحتملة في الدراسات الوظيفية أو الجزيئية أو البروتينية.
Introduction
الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة هي خلايا دبقية متعددة الاستخدامات تلعب أدوارا حيوية في الجهاز العصبي المركزي (CNS) ، وتشمل مسؤوليات مثل تنظيم وظيفة الخلايا العصبية ، والمساهمة في تطوير الجهاز العصبي المركزي ، والحفاظ على الحاجز الدموي الدماغي ، والمشاركة في العمليات الحرجة الأخرى1،2،3،4. إلى جانب دورها في الحفاظ على الاتزان الداخلي، تلعب هذه الخلايا الدبقية أيضا دورا محوريا في آليات الإصابة والإصلاح. تشتهر الخلايا الدبقية الصغيرة بقدراتها البلعمية والالتهابية والمهاجرة بعد الإهانات أو الإصابات5،6،7. تتنوع استجابات الخلايا النجمية في المرض بنفس القدر ، وتشمل المساهمات في الالتهاب ، وتشكيل الندوب الدبقية ، وتسوية الحاجز الدموي الدماغي 8,9. على الرغم من أن فهمنا للأدوار الضارة والتعويضية للخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا النجمية في الجهاز العصبي المركزي قد نما ، إلا أن عدم التجانس المتأصل في كل من هيكلها ووظيفتها يتطلب أدوات قوية لدراستها في سياقات مختلفة.
يتطلب اكتساب مزيد من التبصر في أدوار الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا النجمية في الصحة والمرض اتباع نهج مشترك للتحقيقات في الجسم الحي وفي المختبر . تستفيد التقنيات في الجسم الحي من الحديث المتبادل المعقد بين الخلايا الدبقية والخلايا العصبية داخل الجهاز العصبي المركزي ، بينما تثبت المنهجيات في المختبر قيمتها عند تقييم وظائف الخلية الواحدة أو الاستجابات تحت محفزات محددة. كل طريقة تقدم مزايا فريدة ؛ تعد الدراسات في المختبر ضرورية لفهم الأدوار المحددة لأنواع الخلايا هذه دون مدخلات مباشرة أو غير مباشرة من الخلايا المجاورة. بالإضافة إلى ذلك ، تقدم المقايسات في المختبر التي تستخدم خطوط الخلايا الخالدة فوائد معينة ، بما في ذلك القدرة على التكاثر إلى أجل غير مسمى ، وفعالية التكلفة ، وسهولة الصيانة. لكن من المهم ملاحظة أن الخلايا الأولية تحاكي الاستجابات الفسيولوجية الطبيعية بشكل أوثق مقارنة بخطوط الخلايا. هذه الأهمية الفسيولوجية حاسمة في المقايسات الوظيفية والتحليلات النسخية.
يكمن أحد التحديات في الحصول على الخلايا الأولية ، خاصة من الحبل الشوكي للفأر البالغ ، في كمية العينات وصلاحيتها. الحبل الشوكي البالغ ، كونه أصغر من الدماغ ويحتوي على كمية كبيرة من المايلين ، يشكل صعوبات فريدة. في حين أن هناك العديد من البروتوكولات المنشورة التي توضح بالتفصيل عزل الخلايا الدبقية النقية القابلة للحياة من الوليدية أو دماغ الفأر البالغ10،11،12،13 ، قد لا تكون هذه المنهجيات مناسبة لدراسة الأمراض والإصابات الخاصة بالحبل الشوكي. في هذا البروتوكول ، نقدم إجراء شاملا لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا النجمية النقية والقابلة للحياة بكفاءة من الحبل الشوكي للفأر البالغ ، مما يسهل التطبيقات النهائية في زراعة الخلايا وتحليلات النسخ. تم استخدام هذا البروتوكول بنجاح لعزل هذه الخلايا عن الفئران البالغة التي تتراوح أعمارها بين 10 أسابيع و 5 أشهر ، مما يدل على فائدتها عبر سياقات مختلفة ، بما في ذلك الدراسات التي تشمل الفئران بالضربة القاضية المشروطة ، والاستجابات الدوائية ، والبحوث التنموية ، والنماذج المرتبطة بالعمر.
Protocol
Representative Results
Discussion
يعد عزل الخلايا الأولية النقية القابلة للحياة أمرا بالغ الأهمية لدراسة بنية ووظيفة أنواع معينة من الخلايا. في الفأر البالغ ، وخاصة في الحبل الشوكي ، تشكل هذه المهمة تحديات كبيرة ، حيث أن البروتوكولات الحالية غالبا ما تكون غير مصممة للحبل الشوكي البالغ10,17. ي…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر Castle Raley في مركز الجينوم بجامعة جورج واشنطن لتحليلات الحمض النووي الريبي وحلول Q2 Lab لتحليلات تسلسل الحمض النووي الريبي. تم دعم هذا العمل من قبل المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية [رقم المنحة F31NS117085] ووقف أبحاث فيفيان جيل للدكتور روبرت إتش ميلر. تم إنشاء الشكل 1 باستخدام BioRender.com.
Materials
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma Aldrich | T48402 | |
| 24 well tissue culture plate | Avantor | 10861-558 | |
| 2-Methyl-2-butanol, 98% | Thermo Fisher | A18304-0F | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride | Invitrogen | D1306 | 1:1000 |
| 45% glucose solution | Corning | 25-037-CI | |
| 5 mL capped tubes | Eppendorf | 30122305 | |
| Acetic acid | Sigma-Adlrich | A6283 | |
| Adult Brain Dissociation Kit | Miltenyi | 103-107-677 | |
| Anti-ACSA2 Microbead Kit | Miltenyi | 130-097-679 | |
| Anti-Iba1 | Wako | 019-1974 | |
| Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | |
| C57BL/6J wild-type (WT) mice | Jackson Laboratories | ||
| CD11b (Microglia) MicroBeads | Miltenyi | 130-093-634 | |
| Celltrics 30 µm filter | Sysmex Partec | 04-004-2326 | |
| Counting Chamber (Hemacytometer) | Hausser Scientific Co | 3200 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma Aldrich | D4527-40KU | |
| Distilled water | TMO | 15230001 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher | 11320074 | |
| DNase for RNA purification | Qiagen | 79254 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Thermo Fisher | 14040117 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | A5209401 | |
| GFAP antibody (mouse) | Santa Cruz | sc-33673 | 1:500 |
| GFAP antibody (rabbit) | Dako | Z0334 | 1:500 |
| Goat anti-mouse 594 IgG | Invitrogen | a11032 | 1:500 |
| Goat anti-mouse 594 IgM | Invitrogen | a21044 | 1:300 |
| Goat anti-Rabbit 488 IgG | Invitrogen | a11008 | 1:500 |
| Iba1 antibody (rabbit) | Wako | 019-1974 | 1:500 |
| MACS Separator | Miltenyi | 130-042-303 | |
| Masterflex C/L Pump System | Thermo Fisher | 77122-22 | |
| MEM | Corning | 15-015-CV | |
| Methanol | Sigma-Adlrich | 439193 | |
| Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000-10 | |
| MS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| O4 Antibody | R&D | MAB1326 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| Plugged 9" glass pasteur pipette | VWR | 14672-412 | |
| RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| Royal-tek Surgical scalpel blade no. 10 | Fisher scientific | 22-079-683 | |
| Small Vein Infusion Set, 23 G x 19 mm | Kawasumi | D3K2-23G |
References
- Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nat Rev Neurosci. 7, 41-53 (2006).
- Heithoff, B. P., et al. Astrocytes are necessary for blood-brain barrier maintenance in the adult mouse brain. Glia. 69 (2), 436-472 (2021).
- Badimon, A., et al. Negative feedback control of neuronal activity by microglia. Nature. 586, 417-423 (2020).
- Yanuck, S. F. Microglial phagocytosis of neurons: diminishing neuronal loss in traumatic, infectious, inflammatory, and autoimmune CNS disorders. Front Psychiatry. 10, 712 (2019).
- Xu, Y. J., Au, N. P. B., Ma, C. H. E. Functional and phenotypic diversity of microglia: implication for microglia-based therapies for alzheimer’s disease. Front Aging Neurosci. 14, 896852 (2022).
- Song, S., et al. Microglial-oligodendrocyte interactions in myelination and neurological function recovery after traumatic brain injury. J Neuroinflammation. 19 (1), 246 (2022).
- Butler, C. A., et al. Microglial phagocytosis of neurons in neurodegeneration, and its regulation. J Neurochem. 158 (3), 621-639 (2021).
- Voskuhl, R. R., et al. Reactive astrocytes form scar-like perivascular barriers to leukocytes during adaptive immune inflammation of the CNS. J Neurosci. 29 (37), 11511-11522 (2009).
- Bordon, Y. MAFG activity in astrocytes drives CNS inflammation. Nature Reviews Immunology. 20, 205 (2020).
- Agalave, N. M., Lane, B. T., Mody, P. H., Szabo-Pardi, T. A., Burton, M. D. Isolation, culture, and downstream characterization of primary microglia and astrocytes from adult rodent brain and spinal cord. J Neurosci Methods. 340, 108742 (2020).
- Kerstetter, A. E., Miller, R. H. Isolation and culture of spinal cord astrocytes. Methods in Molecular Biology. 814, 93-104 (2012).
- Hersbach, B. A., Simon, T., Masserdotti, G. Isolation and direct neuronal reprogramming of mouse astrocytes. J Vis Exp. (185), 64175 (2022).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. J Neuroinflammation. 9, 147 (2012).
- Richner, M., Jager, S. B., Siupka, P., Vaegter, C. B. Hydraulic extrusion of the spinal cord and isolation of dorsal root ganglia in rodents. J Vis Exp. (119), e55226 (2017).
- Davies, J., Denyer, T., Hadfield, J. Bioanalyzer chips can be used interchangeably for many analyses of DNA or RNA. Biotechniques. 60 (4), 197-199 (2016).
- Ahn, J. J., Islam, Y., Miller, R. H. Cell type specific isolation of primary astrocytes and microglia from adult mouse spinal cord. J Neurosci Methods. 375, 109599 (2022).
- Pan, J., Wan, J. Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain. J Immunol Methods. 486, 112834 (2020).
- Neuschulz, A., et al. A single-cell RNA labeling strategy for measuring stress response upon tissue dissociation. Mol Syst Biol. 19, 11147 (2023).
- CB, S., et al. One brain-all cells: a comprehensive protocol to isolate all principal cns-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice. Cells. 10 (3), 1-25 (2021).
