इन विट्रो परख और ट्रांसक्रिप्टोमिक अध्ययन के लिए वयस्क माउस रीढ़ की हड्डी से शुद्ध एस्ट्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिया का अलगाव
Summary
यह प्रोटोकॉल वयस्क माउस रीढ़ की हड्डी से शुद्ध एस्ट्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिया के अलगाव की रूपरेखा तैयार करता है, जिससे आरएनए विश्लेषण और सेल संस्कृति जैसे बाद के अनुप्रयोगों की सुविधा मिलती है। इसमें विस्तृत सेल पृथक्करण विधियों और प्रक्रियाओं को शामिल किया गया है जो पृथक कोशिकाओं की गुणवत्ता और उपज दोनों को बढ़ाने के लिए डिज़ाइन किया गया है।
Abstract
एस्ट्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिया केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के विकास, चोट प्रतिक्रियाओं और न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। ये अत्यधिक गतिशील कोशिकाएं पर्यावरणीय परिवर्तनों के लिए तेजी से प्रतिक्रिया प्रदर्शित करती हैं और आकृति विज्ञान, ट्रांसक्रिप्शनल प्रोफाइल और कार्यों के संदर्भ में महत्वपूर्ण विविधता प्रदर्शित करती हैं। जबकि स्वास्थ्य और बीमारी में ग्लियल कोशिकाओं के कार्यों के बारे में हमारी समझ काफी हद तक उन्नत हो गई है, इन विट्रो की आवश्यकता बनी हुई है, अपमान या चोटों के संदर्भ में किए गए सेल-विशिष्ट विश्लेषण व्यापक रूप से अलग-अलग सेल आबादी को चिह्नित करने के लिए। वयस्क माउस से कोशिकाओं को अलग करना सेल लाइनों या नवजात जानवरों पर कई फायदे प्रदान करता है, क्योंकि यह रोग स्थितियों के तहत और विशिष्ट समय बिंदुओं पर कोशिकाओं के विश्लेषण की अनुमति देता है। इसके अलावा, रीढ़ की हड्डी-विशिष्ट अलगाव पर ध्यान केंद्रित करना, मस्तिष्क की भागीदारी को छोड़कर, रीढ़ की हड्डी के विकृति में अनुसंधान को सक्षम बनाता है, जिसमें प्रयोगात्मक ऑटोइम्यून एन्सेफैलोमाइलाइटिस, रीढ़ की हड्डी की चोट और एमियोट्रोफिक पार्श्व स्क्लेरोसिस शामिल हैं। यह प्रोटोकॉल वयस्क माउस रीढ़ की हड्डी से एस्ट्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिया को अलग करने के लिए एक कुशल तरीका प्रस्तुत करता है, कार्यात्मक, आणविक, या प्रोटिओमिक डाउनस्ट्रीम अध्ययनों में संभावित अनुप्रयोगों के साथ तत्काल या भविष्य के विश्लेषण की सुविधा प्रदान करता है।
Introduction
एस्ट्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिया बहुमुखी ग्लियाल कोशिकाएं हैं जो केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं, जिसमें न्यूरोनल फ़ंक्शन को विनियमित करने, सीएनएस विकास में योगदान देने, रक्त-मस्तिष्क बाधा को बनाए रखने और अन्यमहत्वपूर्ण प्रक्रियाओं में भाग लेने जैसी जिम्मेदारियां शामिल हैं 1,2,3,4 . होमियोस्टैसिस को बनाए रखने में उनकी भूमिका के अलावा, ये ग्लियल कोशिकाएं चोट और मरम्मत तंत्र में भी महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं। माइक्रोग्लिया अपमान या चोटों 5,6,7 के बाद अपने फागोसाइटिक, भड़काऊ और प्रवासी क्षमताओं के लिए अच्छी तरह से जाना जाता है। रोग में एस्ट्रोसाइट प्रतिक्रियाएं समान रूप से विविध हैं, जिसमें सूजन में योगदान, ग्लियल निशान का गठन और रक्त-मस्तिष्क बाधा 8,9 का समझौता शामिल है। यद्यपि सीएनएस में माइक्रोग्लिया और एस्ट्रोसाइट्स की हानिकारक और पुनरावर्ती भूमिकाओं की हमारी समझ बढ़ी है, उनकी संरचना और कार्य दोनों में अंतर्निहित विविधता को विभिन्न संदर्भों में उनका अध्ययन करने के लिए मजबूत उपकरणों की आवश्यकता होती है।
स्वास्थ्य और रोग में माइक्रोग्लिया और एस्ट्रोसाइट्स की भूमिकाओं में और अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए इन विवो और इन विट्रो जांच में एक संयुक्त दृष्टिकोण की आवश्यकता होती है। विवो तकनीकों में सीएनएस के भीतर ग्लियल कोशिकाओं और न्यूरॉन्स के बीच जटिल क्रॉसस्टॉक का लाभ उठाते हैं, जबकि इन विट्रो कार्यप्रणाली विशिष्ट उत्तेजनाओं के तहत एकल-कोशिका कार्यों या प्रतिक्रियाओं का आकलन करते समय मूल्यवान साबित होती है। प्रत्येक विधि अद्वितीय लाभ प्रदान करती है; इन विट्रो अध्ययन पड़ोसी कोशिकाओं से प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष इनपुट के बिना इन सेल प्रकारों की विशिष्ट भूमिकाओं को समझने के लिए आवश्यक हैं। इसके अतिरिक्त, अमर सेल लाइनों का उपयोग करने वाले इन विट्रो परख कुछ लाभ प्रस्तुत करते हैं, जिसमें अनिश्चित काल तक प्रसार करने की क्षमता, लागत-दक्षता और रखरखाव में आसानी शामिल है। हालांकि, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि प्राथमिक कोशिकाएं सेल लाइनों की तुलना में सामान्य शारीरिक प्रतिक्रियाओं की अधिक बारीकी से नकल करती हैं। यह शारीरिक प्रासंगिकता कार्यात्मक परख और प्रतिलेख विश्लेषण में महत्वपूर्ण है।
प्राथमिक कोशिकाओं को प्राप्त करने में चुनौतियों में से एक, विशेष रूप से वयस्क माउस रीढ़ की हड्डी से, मात्रा और नमूने की व्यवहार्यता में निहित है. वयस्क रीढ़ की हड्डी, मस्तिष्क से छोटी होने और माइलिन की एक महत्वपूर्ण मात्रा से युक्त, अद्वितीय कठिनाइयों का सामना करती है। जबकि नवजात जानवरों या वयस्क माउस मस्तिष्क10,11,12,13से शुद्ध, व्यवहार्य ग्लियल कोशिकाओं के अलगाव का विवरण देने वाले कई प्रकाशित प्रोटोकॉल हैं, ये तरीके रीढ़ की हड्डी के लिए विशिष्ट बीमारियों और चोटों का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त नहीं हो सकते हैं। इस प्रोटोकॉल में, हम कुशलतापूर्वक वयस्क माउस रीढ़ की हड्डी से शुद्ध, व्यवहार्य माइक्रोग्लिया और एस्ट्रोसाइट्स को अलग करने के लिए एक व्यापक प्रक्रिया प्रदान करते हैं, सेल संस्कृति और ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण में डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों की सुविधा प्रदान करते हैं। इस प्रोटोकॉल को 10 सप्ताह से 5 महीने तक वयस्क चूहों से इन कोशिकाओं को अलग करने के लिए सफलतापूर्वक नियोजित किया गया है, जो सशर्त नॉकआउट चूहों, दवा प्रतिक्रियाओं, विकासात्मक अनुसंधान और उम्र से संबंधित मॉडल से जुड़े अध्ययनों सहित विभिन्न संदर्भों में इसकी उपयोगिता का प्रदर्शन करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
शुद्ध, व्यवहार्य प्राथमिक कोशिकाओं का अलगाव विशिष्ट सेल प्रकारों की संरचना और कार्य की जांच के लिए सर्वोपरि है। वयस्क माउस में, विशेष रूप से रीढ़ की हड्डी में, इस कार्य महत्वपूर्ण चुनौतियों का सामना क?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम आरएनए विश्लेषण के लिए जॉर्ज वाशिंगटन विश्वविद्यालय जीनोमिक्स कोर में कैसल रैले और आरएनए अनुक्रमण विश्लेषण के लिए क्यू 2 लैब समाधान का धन्यवाद करते हैं। इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ न्यूरोलॉजिकल डिसऑर्डर एंड स्ट्रोक [अनुदान संख्या F31NS117085] और विवियन गिल रिसर्च एंडोमेंट द्वारा डॉ रॉबर्ट एच मिलर को समर्थित किया गया था। चित्रा 1 BioRender.com के साथ बनाया गया था।
Materials
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma Aldrich | T48402 | |
| 24 well tissue culture plate | Avantor | 10861-558 | |
| 2-Methyl-2-butanol, 98% | Thermo Fisher | A18304-0F | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride | Invitrogen | D1306 | 1:1000 |
| 45% glucose solution | Corning | 25-037-CI | |
| 5 mL capped tubes | Eppendorf | 30122305 | |
| Acetic acid | Sigma-Adlrich | A6283 | |
| Adult Brain Dissociation Kit | Miltenyi | 103-107-677 | |
| Anti-ACSA2 Microbead Kit | Miltenyi | 130-097-679 | |
| Anti-Iba1 | Wako | 019-1974 | |
| Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | |
| C57BL/6J wild-type (WT) mice | Jackson Laboratories | ||
| CD11b (Microglia) MicroBeads | Miltenyi | 130-093-634 | |
| Celltrics 30 µm filter | Sysmex Partec | 04-004-2326 | |
| Counting Chamber (Hemacytometer) | Hausser Scientific Co | 3200 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma Aldrich | D4527-40KU | |
| Distilled water | TMO | 15230001 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher | 11320074 | |
| DNase for RNA purification | Qiagen | 79254 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Thermo Fisher | 14040117 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | A5209401 | |
| GFAP antibody (mouse) | Santa Cruz | sc-33673 | 1:500 |
| GFAP antibody (rabbit) | Dako | Z0334 | 1:500 |
| Goat anti-mouse 594 IgG | Invitrogen | a11032 | 1:500 |
| Goat anti-mouse 594 IgM | Invitrogen | a21044 | 1:300 |
| Goat anti-Rabbit 488 IgG | Invitrogen | a11008 | 1:500 |
| Iba1 antibody (rabbit) | Wako | 019-1974 | 1:500 |
| MACS Separator | Miltenyi | 130-042-303 | |
| Masterflex C/L Pump System | Thermo Fisher | 77122-22 | |
| MEM | Corning | 15-015-CV | |
| Methanol | Sigma-Adlrich | 439193 | |
| Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000-10 | |
| MS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| O4 Antibody | R&D | MAB1326 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| Plugged 9" glass pasteur pipette | VWR | 14672-412 | |
| RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| Royal-tek Surgical scalpel blade no. 10 | Fisher scientific | 22-079-683 | |
| Small Vein Infusion Set, 23 G x 19 mm | Kawasumi | D3K2-23G |
References
- Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nat Rev Neurosci. 7, 41-53 (2006).
- Heithoff, B. P., et al. Astrocytes are necessary for blood-brain barrier maintenance in the adult mouse brain. Glia. 69 (2), 436-472 (2021).
- Badimon, A., et al. Negative feedback control of neuronal activity by microglia. Nature. 586, 417-423 (2020).
- Yanuck, S. F. Microglial phagocytosis of neurons: diminishing neuronal loss in traumatic, infectious, inflammatory, and autoimmune CNS disorders. Front Psychiatry. 10, 712 (2019).
- Xu, Y. J., Au, N. P. B., Ma, C. H. E. Functional and phenotypic diversity of microglia: implication for microglia-based therapies for alzheimer’s disease. Front Aging Neurosci. 14, 896852 (2022).
- Song, S., et al. Microglial-oligodendrocyte interactions in myelination and neurological function recovery after traumatic brain injury. J Neuroinflammation. 19 (1), 246 (2022).
- Butler, C. A., et al. Microglial phagocytosis of neurons in neurodegeneration, and its regulation. J Neurochem. 158 (3), 621-639 (2021).
- Voskuhl, R. R., et al. Reactive astrocytes form scar-like perivascular barriers to leukocytes during adaptive immune inflammation of the CNS. J Neurosci. 29 (37), 11511-11522 (2009).
- Bordon, Y. MAFG activity in astrocytes drives CNS inflammation. Nature Reviews Immunology. 20, 205 (2020).
- Agalave, N. M., Lane, B. T., Mody, P. H., Szabo-Pardi, T. A., Burton, M. D. Isolation, culture, and downstream characterization of primary microglia and astrocytes from adult rodent brain and spinal cord. J Neurosci Methods. 340, 108742 (2020).
- Kerstetter, A. E., Miller, R. H. Isolation and culture of spinal cord astrocytes. Methods in Molecular Biology. 814, 93-104 (2012).
- Hersbach, B. A., Simon, T., Masserdotti, G. Isolation and direct neuronal reprogramming of mouse astrocytes. J Vis Exp. (185), 64175 (2022).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. J Neuroinflammation. 9, 147 (2012).
- Richner, M., Jager, S. B., Siupka, P., Vaegter, C. B. Hydraulic extrusion of the spinal cord and isolation of dorsal root ganglia in rodents. J Vis Exp. (119), e55226 (2017).
- Davies, J., Denyer, T., Hadfield, J. Bioanalyzer chips can be used interchangeably for many analyses of DNA or RNA. Biotechniques. 60 (4), 197-199 (2016).
- Ahn, J. J., Islam, Y., Miller, R. H. Cell type specific isolation of primary astrocytes and microglia from adult mouse spinal cord. J Neurosci Methods. 375, 109599 (2022).
- Pan, J., Wan, J. Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain. J Immunol Methods. 486, 112834 (2020).
- Neuschulz, A., et al. A single-cell RNA labeling strategy for measuring stress response upon tissue dissociation. Mol Syst Biol. 19, 11147 (2023).
- CB, S., et al. One brain-all cells: a comprehensive protocol to isolate all principal cns-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice. Cells. 10 (3), 1-25 (2021).
