Isolamento di astrociti puri e microglia dal midollo spinale di topo adulto per saggi in vitro e studi trascrittomici
Summary
Questo protocollo delinea l’isolamento di astrociti e microglia purificati dal midollo spinale del topo adulto, facilitando le successive applicazioni come l’analisi dell’RNA e la coltura cellulare. Include metodi e procedure dettagliati di dissociazione cellulare progettati per migliorare sia la qualità che la resa delle cellule isolate.
Abstract
Gli astrociti e le microglia svolgono un ruolo fondamentale nello sviluppo del sistema nervoso centrale, nelle risposte alle lesioni e nelle malattie neurodegenerative. Queste cellule altamente dinamiche mostrano risposte rapide ai cambiamenti ambientali e mostrano una significativa eterogeneità in termini di morfologia, profili trascrizionali e funzioni. Mentre la nostra comprensione delle funzioni delle cellule gliali nella salute e nella malattia è progredita notevolmente, rimane la necessità di analisi in vitro, specifiche per cellule, condotte nel contesto di insulti o lesioni per caratterizzare in modo completo popolazioni cellulari distinte. L’isolamento delle cellule dal topo adulto offre diversi vantaggi rispetto alle linee cellulari o agli animali neonatali, in quanto consente l’analisi delle cellule in condizioni patologiche e in punti temporali specifici. Inoltre, concentrandosi sull’isolamento specifico del midollo spinale, escludendo il coinvolgimento cerebrale, consente la ricerca sulle patologie del midollo spinale, tra cui l’encefalomielite autoimmune sperimentale, la lesione del midollo spinale e la sclerosi laterale amiotrofica. Questo protocollo presenta un metodo efficiente per isolare astrociti e microglia dal midollo spinale del topo adulto, facilitando l’analisi immediata o futura con potenziali applicazioni in studi funzionali, molecolari o proteomici a valle.
Introduction
Gli astrociti e le microglia sono cellule gliali versatili che svolgono ruoli vitali nel sistema nervoso centrale (SNC), comprendendo responsabilità come la regolazione della funzione neuronale, contribuendo allo sviluppo del SNC, mantenendo la barriera emato-encefalica e partecipando ad altri processi critici 1,2,3,4 . Oltre al loro ruolo nel mantenimento dell’omeostasi, queste cellule gliali svolgono anche un ruolo fondamentale nei meccanismi di lesione e riparazione. Le microglia sono ben note per le loro capacità fagocitarie, infiammatorie e migratorie in seguito a insulti o lesioni 5,6,7. Le risposte degli astrociti nella malattia sono ugualmente diverse, comprendendo i contributi all’infiammazione, alla formazione di cicatrici gliali e alla compromissione della barriera emato-encefalica 8,9. Sebbene la nostra comprensione dei ruoli dannosi e riparativi della microglia e degli astrociti nel sistema nervoso centrale sia cresciuta, l’eterogeneità intrinseca sia nella loro struttura che nella loro funzione richiede strumenti robusti per studiarli in vari contesti.
Ottenere ulteriori informazioni sul ruolo della microglia e degli astrociti nella salute e nella malattia richiede un approccio combinato di indagini in vivo e in vitro . Le tecniche in vivo sfruttano l’intricato crosstalk tra cellule gliali e neuroni all’interno del sistema nervoso centrale, mentre le metodologie in vitro si rivelano preziose quando si valutano le funzioni o le risposte di singole cellule sotto stimoli specifici. Ogni metodo offre vantaggi unici; Gli studi in vitro sono essenziali per comprendere i ruoli specifici di questi tipi di cellule senza input diretto o indiretto da parte delle cellule vicine. Inoltre, i saggi in vitro che utilizzano linee cellulari immortali presentano alcuni vantaggi, tra cui la capacità di proliferare indefinitamente, l’efficienza dei costi e la facilità di manutenzione. Tuttavia, è importante notare che le cellule primarie imitano più da vicino le normali risposte fisiologiche rispetto alle linee cellulari. Questa rilevanza fisiologica è cruciale nei saggi funzionali e nelle analisi trascrittomiche.
Una delle sfide nell’ottenere cellule primarie, in particolare dal midollo spinale del topo adulto, risiede nella quantità e nella vitalità dei campioni. Il midollo spinale adulto, essendo più piccolo del cervello e contenente una quantità significativa di mielina, pone difficoltà uniche. Sebbene esistano diversi protocolli pubblicati che descrivono in dettaglio l’isolamento di cellule gliali pure e vitali da animali neonatali o dal cervello di topo adulto 10,11,12,13, queste metodologie potrebbero non essere adatte per lo studio di malattie e lesioni specifiche del midollo spinale. In questo protocollo, offriamo una procedura completa per isolare in modo efficiente microglia e astrociti puri e vitali dal midollo spinale del topo adulto, facilitando le applicazioni a valle nelle colture cellulari e nelle analisi trascrittomiche. Questo protocollo è stato impiegato con successo per isolare queste cellule da topi adulti di età compresa tra 10 settimane e 5 mesi, dimostrando la sua utilità in vari contesti, tra cui studi che coinvolgono topi knockout condizionali, risposte ai farmaci, ricerca sullo sviluppo e modelli legati all’età.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’isolamento di cellule primarie pure e vitali è fondamentale per studiare la struttura e la funzione di specifici tipi di cellule. Nel topo adulto, in particolare nel midollo spinale, questo compito pone sfide significative, poiché i protocolli esistenti spesso non sono adattati al midollo spinale adulto10,17. Questo protocollo presenta un metodo efficiente ed economico applicabile a varie applicazioni a valle, tra cui colture cellulari, citometria a flusso, i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Castle Raley del George Washington University Genomics Core per le analisi dell’RNA e Q2 Lab Solutions per le analisi di sequenziamento dell’RNA. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of Neurological Disorders and Stroke [sovvenzione numero F31NS117085] e dal Vivian Gill Research Endowment al Dr. Robert H. Miller. La Figura 1 è stata creata con BioRender.com.
Materials
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma Aldrich | T48402 | |
| 24 well tissue culture plate | Avantor | 10861-558 | |
| 2-Methyl-2-butanol, 98% | Thermo Fisher | A18304-0F | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride | Invitrogen | D1306 | 1:1000 |
| 45% glucose solution | Corning | 25-037-CI | |
| 5 mL capped tubes | Eppendorf | 30122305 | |
| Acetic acid | Sigma-Adlrich | A6283 | |
| Adult Brain Dissociation Kit | Miltenyi | 103-107-677 | |
| Anti-ACSA2 Microbead Kit | Miltenyi | 130-097-679 | |
| Anti-Iba1 | Wako | 019-1974 | |
| Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | |
| C57BL/6J wild-type (WT) mice | Jackson Laboratories | ||
| CD11b (Microglia) MicroBeads | Miltenyi | 130-093-634 | |
| Celltrics 30 µm filter | Sysmex Partec | 04-004-2326 | |
| Counting Chamber (Hemacytometer) | Hausser Scientific Co | 3200 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma Aldrich | D4527-40KU | |
| Distilled water | TMO | 15230001 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher | 11320074 | |
| DNase for RNA purification | Qiagen | 79254 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Thermo Fisher | 14040117 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | A5209401 | |
| GFAP antibody (mouse) | Santa Cruz | sc-33673 | 1:500 |
| GFAP antibody (rabbit) | Dako | Z0334 | 1:500 |
| Goat anti-mouse 594 IgG | Invitrogen | a11032 | 1:500 |
| Goat anti-mouse 594 IgM | Invitrogen | a21044 | 1:300 |
| Goat anti-Rabbit 488 IgG | Invitrogen | a11008 | 1:500 |
| Iba1 antibody (rabbit) | Wako | 019-1974 | 1:500 |
| MACS Separator | Miltenyi | 130-042-303 | |
| Masterflex C/L Pump System | Thermo Fisher | 77122-22 | |
| MEM | Corning | 15-015-CV | |
| Methanol | Sigma-Adlrich | 439193 | |
| Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000-10 | |
| MS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| O4 Antibody | R&D | MAB1326 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| Plugged 9" glass pasteur pipette | VWR | 14672-412 | |
| RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| Royal-tek Surgical scalpel blade no. 10 | Fisher scientific | 22-079-683 | |
| Small Vein Infusion Set, 23 G x 19 mm | Kawasumi | D3K2-23G |
References
- Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nat Rev Neurosci. 7, 41-53 (2006).
- Heithoff, B. P., et al. Astrocytes are necessary for blood-brain barrier maintenance in the adult mouse brain. Glia. 69 (2), 436-472 (2021).
- Badimon, A., et al. Negative feedback control of neuronal activity by microglia. Nature. 586, 417-423 (2020).
- Yanuck, S. F. Microglial phagocytosis of neurons: diminishing neuronal loss in traumatic, infectious, inflammatory, and autoimmune CNS disorders. Front Psychiatry. 10, 712 (2019).
- Xu, Y. J., Au, N. P. B., Ma, C. H. E. Functional and phenotypic diversity of microglia: implication for microglia-based therapies for alzheimer’s disease. Front Aging Neurosci. 14, 896852 (2022).
- Song, S., et al. Microglial-oligodendrocyte interactions in myelination and neurological function recovery after traumatic brain injury. J Neuroinflammation. 19 (1), 246 (2022).
- Butler, C. A., et al. Microglial phagocytosis of neurons in neurodegeneration, and its regulation. J Neurochem. 158 (3), 621-639 (2021).
- Voskuhl, R. R., et al. Reactive astrocytes form scar-like perivascular barriers to leukocytes during adaptive immune inflammation of the CNS. J Neurosci. 29 (37), 11511-11522 (2009).
- Bordon, Y. MAFG activity in astrocytes drives CNS inflammation. Nature Reviews Immunology. 20, 205 (2020).
- Agalave, N. M., Lane, B. T., Mody, P. H., Szabo-Pardi, T. A., Burton, M. D. Isolation, culture, and downstream characterization of primary microglia and astrocytes from adult rodent brain and spinal cord. J Neurosci Methods. 340, 108742 (2020).
- Kerstetter, A. E., Miller, R. H. Isolation and culture of spinal cord astrocytes. Methods in Molecular Biology. 814, 93-104 (2012).
- Hersbach, B. A., Simon, T., Masserdotti, G. Isolation and direct neuronal reprogramming of mouse astrocytes. J Vis Exp. (185), 64175 (2022).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. J Neuroinflammation. 9, 147 (2012).
- Richner, M., Jager, S. B., Siupka, P., Vaegter, C. B. Hydraulic extrusion of the spinal cord and isolation of dorsal root ganglia in rodents. J Vis Exp. (119), e55226 (2017).
- Davies, J., Denyer, T., Hadfield, J. Bioanalyzer chips can be used interchangeably for many analyses of DNA or RNA. Biotechniques. 60 (4), 197-199 (2016).
- Ahn, J. J., Islam, Y., Miller, R. H. Cell type specific isolation of primary astrocytes and microglia from adult mouse spinal cord. J Neurosci Methods. 375, 109599 (2022).
- Pan, J., Wan, J. Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain. J Immunol Methods. 486, 112834 (2020).
- Neuschulz, A., et al. A single-cell RNA labeling strategy for measuring stress response upon tissue dissociation. Mol Syst Biol. 19, 11147 (2023).
- CB, S., et al. One brain-all cells: a comprehensive protocol to isolate all principal cns-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice. Cells. 10 (3), 1-25 (2021).
