تقدم هذه الدراسة مجموعة سهلة الاستخدام وكاملة وبسيطة من الطرق لتسمية وتحليل الكبيبات من كليتي الفئران التي تم تطهيرها من CUBIC. يمكن الحصول على بيانات مثل رقم الكبيبة وحجمها بسهولة وموثوقية باستخدام إيزوثيوسيانات الفلوريسئين (FITC) -Dextran ، أو الفحص المجهري الفلوري للصفائح الضوئية (LSFM) ، أو الفحص المجهري البؤري المشترك والبرامج مثل Imaris.
الكبيبات هي وحدات أساسية في الكلى. ومن ثم ، فإن دراسة الكبيبات أمر محوري لفهم وظائف الكلى وعلم الأمراض. يوفر التصوير البيولوجي معلومات بديهية. وبالتالي ، من الأهمية بمكان تسمية الكبيبات ومراقبتها. ومع ذلك ، فإن طرق مراقبة الكبيبات المستخدمة حاليا تتطلب عمليات معقدة ، وقد تفقد النتائج تفاصيل التسمية أو المعلومات ثلاثية الأبعاد (3D). تم استخدام كوكتيلات تصوير الدماغ الواضحة والخالية من العوائق وتقنية مسح الأنسجة بالتحليل الحسابي (CUBIC) على نطاق واسع في أبحاث الكلى ، مما يسمح باكتشاف أكثر دقة وعمق اكتشاف أعمق. وجدنا أنه يمكن تمييز كبيبات الفئران بسرعة وفعالية عن طريق حقن الوريد الذيل للوزن الجزيئي المتوسط FITC-Dextran متبوعا بطريقة المقاصة المكعبة. يمكن مسح كلية الفأر التي تم تطهيرها بواسطة مجهر ضوئي (أو مجهر متحد البؤر عند تقطيعها) للحصول على أكوام صور ثلاثية الأبعاد لجميع الكبيبات في الكلية بأكملها. يمكن بسهولة رقمنة إشارات الكبيبات وتحليلها لقياس عدد الكبيبات وحجمها وتواترها.
عدد وحجم الكبيبات مهمة جدا لتشخيص وعلاج أمراض الكلى المختلفة1،2،3،4،5. المعيار الذهبي لتقدير عدد الكبيبات هو تركيبة التشريح المادي / المجزأ. ومع ذلك ، تتطلب هذه الطريقة كواشف ومعدات خاصة ، مما يجعلها بطيئة ومكلفة6،7،8،9. توفر الخزعة ثروة من المعلومات ، ولكن من الواضح أن هذه الطريقة مناسبة فقط للتقديرات التقريبية10,11. كما تستخدم تقنيات التصوير الطبي ، بما في ذلك التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) والتصوير المقطعي المحوسب (CT) والأشعة السينية ، على نطاق واسع في الكشف عن الكبيبات12،13،14،15 ، ولكن هذه التقنيات تتطلب أدوات ضخمة. كما استخدمت طرق جديدة ، مثل مطياف الكتلة التصويري16 للتصوير بالامتزاز / التأين بالليزر بمساعدة المصفوفة (MALDI) أو طريقة المقطعالسميك والرقيق 17 ، في الكشف عن الكبيبات ، على الرغم من أنها لا تزال مملة وشاقة.
بمساعدة تقنيات الشفافية ، من الممكن مراقبة أعماق أعمق والحصول على معلومات أكثر ثراء واكتمالا من الأنسجة السميكة أو حتى الأعضاء الكاملة18،19،20،21،22،23. لذلك ، تم استخدام تقنيات الشفافية على نطاق واسع في أبحاث الكلى24. وتشارك أيضا مراقبة والكشف عن الكبيبات في الكلى تطهيرها. ومع ذلك ، فإن هذه المقالات المنشورة إما أشارت لفترة وجيزة فقط إلى الكشف عن الكبيبات25 أو استخدمت طرق وضع العلامات التي يصعب تحقيقها مثل المعدلة وراثيا26 ، أو الأصباغ المنتجة ذاتيا13 ، أو حضانة الأجسام المضادة عالية التركيز27 لتسمية الكبيبات. بالإضافة إلى ذلك ، على الرغم من أن الدراسات قد حللت الكبيبات في الكلى التي تم تطهيرها ، إلا أن التحليلات كانت دائما محدودة13 أو اعتمدت على خوارزميات التحليل التي أنشأها المؤلفون أنفسهم26.
لقد أظهرنا سابقا طريقة أكثر ملاءمة لتسمية الكبيبات في كلى الفئران28. باستخدام Imaris ، وجدنا أنه يمكن الحصول بسرعة على عدد الكبيبات وتكرارها وحجمها. وبالتالي ، نقدم هنا مجموعة من الطرق التي يسهل الوصول إليها وشمولية ومبسطة لتسمية وتحليل كبيبات كلى الفئران.
يمكن تصنيف تقنيات إزالة الأنسجة إلى 3 أو 4 مجموعات29،30،31. تم تطبيق إزالة الأنسجة القائمة على المذيبات العضوية (على سبيل المثال ، DISCO و PEGASOS) ، وتنظيف الأنسجة المائية (على سبيل المثال ، CUBIC) ، وتطهير الأنسجة بتضمين الهيدروجيل (على سبيل المثال ، …
The authors have nothing to disclose.
تم دعم هذه الدراسة بمنح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82204951) وبرنامج سيتشوان للعلوم والتكنولوجيا (2020JDRC0102).
4% PFA | Biosharp | 7007171800 | Fixation reaagen |
502 Glue | Deli | 7146 | For fixing the kidney to the sample fixing adapter |
Antipyrine | Aladdin | A110660 | Clearing reagent |
Brain Matrix | RWD Life Science | 1mm 40-75 | Tissue slicing |
Confocal microscopy | Nikon | A1plus | Image acquisition |
FITC-Dextran | Sigma-Aldrich | FD150S | Labeling reagent |
Light sheet fluorescence microscopy | Zeiss | Light sheet 7 | Image acquisition |
Mice | Ensiweier | Adult C57BL/6 mice (6 weeks of age, 25–30 g) | |
N-Butyldiethanolamine | Aladdin | B299095 | Clearing reagent |
Nicotinamide | Aladdin | N105042 | Clearing reagent |
Pentobarbital Natriumsalz | Sigma-Aldrich | P3761 | |
Tail vein fixator | JINUOTAI | JNT-FS35 | Fix the mouse for vail injection |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Clearing reagent |