この研究は、CUBIC透明マウス腎臓からの糸球体を標識および分析するための、使いやすく完全でシンプルな一連の方法を提示します。糸球体数や体積などのデータは、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)-デキストラン、ライトシート蛍光顕微鏡(LSFM)、または一般的な共焦点顕微鏡とImarisなどのソフトウェアを使用して簡単かつ確実に取得できます。
糸球体は腎臓の基本単位です。したがって、糸球体を研究することは、腎機能と病理学を理解する上で極めて重要です。生物学的イメージングは直感的な情報を提供します。したがって、糸球体にラベルを付けて観察することは非常に重要です。しかし、現在使用されている糸球体観察法は複雑な操作を必要とし、その結果、ラベルの詳細や3次元(3D)情報が失われる可能性があります。透明で遮るもののない脳イメージングカクテルとコンピューター解析(CUBIC)組織透明化技術は、腎臓研究で広く使用されており、より正確な検出とより深い検出深さを可能にしています。マウス糸球体は、中分子量のFITC-デキストランの尾静脈注入とそれに続くCUBIC透明化法により、迅速かつ効果的に標識できることを見出しました。透明化したマウスの腎臓をライトシート顕微鏡(スライスした場合は共焦点顕微鏡)でスキャンし、腎臓全体のすべての糸球体の3次元画像スタックを得ることができた。適切なソフトウェアで処理することで、糸球体信号を簡単にデジタル化し、さらに分析して糸球体の数、体積、頻度を測定することができます。
糸球体の数と量は、さまざまな腎臓病の診断と治療にとって非常に重要です1,2,3,4,5。糸球体数推定のゴールデンスタンダードは、物理的なディセクタ/フラクショネーターの組み合わせです。ただし、この方法は特別な試薬と機器を必要とするため、時間がかかり、高価になります6,7,8,9。生検は豊富な情報を提供しますが、明らかに、この方法は大まかな推定にのみ適しています10,11。磁気共鳴画像法(MRI)、コンピュータ断層撮影法(CT)、X線などの医用画像技術も糸球体検出に広く使用されています12,13,14,15が、そのような技術にはかさばる機器が必要です。マトリックス支援レーザー脱離イオン化(MALDI)イメージング質量分析計16や厚切片および薄切片法17などの新しい方法も糸球体検出に使用されていますが、それらは依然として退屈で手間がかかります。
透明化技術の助けを借りて、より深い深さを観察し、厚い組織または臓器全体からさえ、より豊富で完全な情報を得ることができます18,19,20,21,22,23。そのため、腎臓の研究において透明性技術が広く用いられてきた24。透明な腎臓における糸球体の観察と検出も関与しています。しかし、これらの発表された論文は、糸球体検出25に簡潔に言及したに過ぎず、糸球体を標識するためにトランスジェニック動物26、自己生産色素13、または高濃度抗体インキュベーション27などの達成困難な標識方法を使用していた。さらに、透明な腎臓の糸球体を分析した研究もあったが、その分析は常に限定的であったり13、著者自身が確立した分析アルゴリズムに依存していたりした26。
我々は以前、マウスの腎臓の糸球体を標識するより便利な方法を実証した28。Imarisを用いることで、糸球体数、頻度、体積を素早く得ることができることが分かりました。したがって、ここでは、マウスの腎臓の糸球体を標識および分析するための、よりアクセスしやすく、包括的で、簡略化された一連の方法を提示します。
組織透明化技術は、3つまたは4つのグループ29、30、31に分類できます。有機溶媒ベースの組織透明化(DISCOやPEGASOSなど)、水性組織透明化(CUBICなど)、ハイドロゲル包埋組織透明化(CLARITYなど)はすべて、腎臓の透明化に適用されています25,26,28,32。<s…
The authors have nothing to disclose.
本研究は、中国国家自然科学基金会(82204951)および四川省科学技術プログラム(2020JDRC0102)の助成を受けて行われました。
4% PFA | Biosharp | 7007171800 | Fixation reaagen |
502 Glue | Deli | 7146 | For fixing the kidney to the sample fixing adapter |
Antipyrine | Aladdin | A110660 | Clearing reagent |
Brain Matrix | RWD Life Science | 1mm 40-75 | Tissue slicing |
Confocal microscopy | Nikon | A1plus | Image acquisition |
FITC-Dextran | Sigma-Aldrich | FD150S | Labeling reagent |
Light sheet fluorescence microscopy | Zeiss | Light sheet 7 | Image acquisition |
Mice | Ensiweier | Adult C57BL/6 mice (6 weeks of age, 25–30 g) | |
N-Butyldiethanolamine | Aladdin | B299095 | Clearing reagent |
Nicotinamide | Aladdin | N105042 | Clearing reagent |
Pentobarbital Natriumsalz | Sigma-Aldrich | P3761 | |
Tail vein fixator | JINUOTAI | JNT-FS35 | Fix the mouse for vail injection |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Clearing reagent |