Fare Glomerüllerini Etiketlemek ve Analiz Etmek için Etkili ve Hızlı Bir Yöntem
Summary
Bu çalışma, CUBIC temizlenmiş fare böbreklerinden glomerülleri etiketlemek ve analiz etmek için kullanımı kolay, eksiksiz ve basit bir dizi yöntem sunmaktadır. Glomerulus sayısı ve hacmi gibi veriler, floresein izotiyosiyanat (FITC)-Dekstran, ışık tabakası floresan mikroskobu (LSFM) veya yaygın konfokal mikroskopi ve Imaris gibi yazılımlar kullanılarak kolay ve güvenilir bir şekilde elde edilebilir.
Abstract
Glomerüller böbrekteki temel birimlerdir; Bu nedenle, glomerülleri incelemek, böbrek fonksiyonunu ve patolojisini anlamak için çok önemlidir. Biyolojik görüntüleme sezgisel bilgi sağlar; Bu nedenle, glomerülleri etiketlemek ve gözlemlemek büyük önem taşımaktadır. Bununla birlikte, şu anda kullanılmakta olan glomerül gözlem yöntemleri karmaşık işlemler gerektirir ve sonuçlar etiket ayrıntılarını veya üç boyutlu (3D) bilgileri kaybedebilir. Net, engelsiz beyin görüntüleme kokteylleri ve hesaplamalı analiz (CUBIC) doku temizleme teknolojisi, böbrek araştırmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır ve daha doğru tespit ve daha derin tespit derinliği sağlar. Fare glomerüllerinin, orta moleküler ağırlıklı FITC-Dekstran’ın kuyruk damarı enjeksiyonu ve ardından CUBIC temizleme yöntemi ile hızlı ve etkili bir şekilde etiketlenebileceğini bulduk. Temizlenen fare böbreği, tüm böbrekteki tüm glomerüllerin üç boyutlu görüntü yığınlarını elde etmek için bir ışık tabakası mikroskobu (veya dilimlendiğinde konfokal bir mikroskop) ile taranabilir. Uygun yazılımla işlenen glomerül sinyalleri, glomerüllerin sayısını, hacmini ve frekansını ölçmek için kolayca sayısallaştırılabilir ve daha fazla analiz edilebilir.
Introduction
Glomerüllerin sayısı ve hacmi çeşitli böbrek hastalıklarının tanı ve tedavisi için çok önemlidir 1,2,3,4,5. Glomerül sayısı tahmininin altın standardı, fiziksel disektör/fraksiyonatör kombinasyonudur. Bununla birlikte, bu yöntem özel reaktifler ve ekipman gerektirir, bu da onu yavaş ve pahalı hale getirir 6,7,8,9. Biyopsi zengin bir bilgi sağlar, ancak açıkçası, bu yöntem yalnızca kaba tahminler için uygundur10,11. Manyetik rezonans görüntüleme (MRI), bilgisayarlı tomografi (BT) ve X-ışını dahil olmak üzere tıbbi görüntüleme teknolojileri de glomerüler algılamada yaygın olarak kullanılmaktadır 12,13,14,15, ancak bu tür teknolojiler hantal aletler gerektirir. Matris destekli lazer desorpsiyon/iyonizasyon (MALDI) görüntüleme kütle spektrometresi16 veya kalın ve ince kesit yöntemi17 gibi yeni yöntemler de glomerüler tespitte kullanılmıştır, ancak bunlar sıkıcı ve zahmetli olmaya devam etmektedir.
Şeffaflık teknolojilerinin yardımıyla, daha derin derinlikleri gözlemlemek ve kalın dokulardan ve hatta tüm organlardan daha zengin ve daha eksiksiz bilgi elde etmek mümkündür 18,19,20,21,22,23. Bu nedenle, şeffaflık teknolojileri böbrek araştırmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır24. Temizlenen böbreklerde glomerüllerin gözlemlenmesi ve tespiti de söz konusudur. Bununla birlikte, yayınlanan bu makaleler ya sadece kısaca glomerüler tespit25’e atıfta bulundu ya da glomerülleri etiketlemek için transgenik hayvanlar26, kendi kendine üretilen boyalar13 veya yüksek konsantrasyonlu antikor inkübasyonu27 gibi elde edilmesi zor etiketleme yöntemlerini kullandı. Ek olarak, çalışmalar temizlenmiş böbreklerdeki glomerülleri analiz etmiş olsa da, analizler her zaman sınırlıydı13 veya yazarların kendileri tarafından oluşturulan analiz algoritmalarınadayanıyordu 26.
Daha önce farelerin böbreklerinde glomerülleri etiketlemenin daha uygun bir yolunu göstermiştik28. Imaris’i kullanarak, glomerül sayısının, frekansının ve hacminin hızlı bir şekilde elde edilebileceğini bulduk. Bu nedenle, burada fare böbreklerinin glomerüllerini etiketlemek ve analiz etmek için daha erişilebilir, kapsamlı ve basitleştirilmiş bir dizi yöntem sunuyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Doku temizleme teknolojileri 3 veya 4 grupta sınıflandırılabilir 29,30,31. Organik çözücü bazlı doku temizleme (örneğin, DISCO ve PEGASOS), su bazlı doku temizleme (örneğin, CUBIC) ve hidrojel gömme doku temizleme (örneğin, CLARITY) böbrek temizlemede uygulanmıştır 25,26,28,32. CUB…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82204951) ve Sichuan Bilim ve Teknoloji Programı (2020JDRC0102) tarafından sağlanan hibelerle desteklenmiştir.
Materials
| 4% PFA | Biosharp | 7007171800 | Fixation reaagen |
| 502 Glue | Deli | 7146 | For fixing the kidney to the sample fixing adapter |
| Antipyrine | Aladdin | A110660 | Clearing reagent |
| Brain Matrix | RWD Life Science | 1mm 40-75 | Tissue slicing |
| Confocal microscopy | Nikon | A1plus | Image acquisition |
| FITC-Dextran | Sigma-Aldrich | FD150S | Labeling reagent |
| Light sheet fluorescence microscopy | Zeiss | Light sheet 7 | Image acquisition |
| Mice | Ensiweier | Adult C57BL/6 mice (6 weeks of age, 25–30 g) | |
| N-Butyldiethanolamine | Aladdin | B299095 | Clearing reagent |
| Nicotinamide | Aladdin | N105042 | Clearing reagent |
| Pentobarbital Natriumsalz | Sigma-Aldrich | P3761 | |
| Tail vein fixator | JINUOTAI | JNT-FS35 | Fix the mouse for vail injection |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Clearing reagent |
References
- Hoy, W. E., et al. Nephron number, glomerular volume, renal disease and hypertension. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 17 (3), 258-265 (2008).
- Bertram, J. F., Douglas-Denton, R. N., Diouf, B., Hughson, M. D., Hoy, W. E. Human nephron number: implications for health and disease. Pediatric Nephrology. 26 (9), 1529-1533 (2011).
- Nyengaard, J. R., Bendtsen, T. F. Glomerular number and size in relation to age, kidney weight, and body surface in normal man. The Anatomical Record. 232 (2), 194-201 (1992).
- Rasch, R. Prevention of diabetic glomerulopathy in streptozotocin diabetic rats by insulin treatment. Kidney size and glomerular volume. Diabetologia. 16 (2), 125-128 (1979).
- Puelles, V. G., et al. Glomerular number and size variability and risk for kidney disease. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 20 (1), 7-15 (2011).
- Bertram, J. F., et al. Why and how we determine nephron number. Pediatric Nephrology. 29, 575-580 (2014).
- Bertram, J. F., Soosaipillai, M. C., Ricardo, S. D., Ryan, G. B. Total numbers of glomeruli and individual glomerular cell types in the normal rat kidney. Cell and Tissue Research. 270 (1), 37-45 (1992).
- Nyengaard, J. R. Stereologic methods and their application in kidney research. Journal of the American Society of Nephrology. 10 (5), 1100-1123 (1999).
- Bertram, J. F. Analyzing renal glomeruli with the new stereology. International Review of Cytology. 161, 111-172 (1995).
- Lødrup, A. B., Karstoft, K., Dissing, T. H., Pedersen, M., Nyengaard, J. R. Kidney biopsies can be used for estimations of glomerular number and volume: a pig study. Virchows Archiv. 452 (4), 393-403 (2008).
- Lane, P. H., Steffes, M. W., Mauer, S. M. Estimation of glomerular volume: a comparison of four methods. Kidney International. 41 (4), 1085-1089 (1992).
- Baldelomar, E. J., Charlton, J. R., deRonde, K. A., Bennett, K. M. In vivo measurements of kidney glomerular number and size in healthy and Os(/+) mice using MRI. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 317 (4), F865-F873 (2019).
- Huang, J., et al. A cationic near infrared fluorescent agent and ethyl-cinnamate tissue clearing protocol for vascular staining and imaging. Scientific Reports. 9 (1), 521 (2019).
- Beeman, S. C., et al. Measuring glomerular number and size in perfused kidneys using MRI. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (6), F1454-F1457 (2011).
- Basgen, J. M., Steffes, M. W., Stillman, A. E., Mauer, S. M. Estimating glomerular number in situ using magnetic resonance imaging and biopsy. Kidney International. 45 (6), 1668-1672 (1994).
- Prentice, B. M., Caprioli, R. M., Vuiblet, V. Label-free molecular imaging of the kidney. Kidney International. 92 (3), 580-598 (2017).
- Sanden, S. K., Wiggins, J. E., Goyal, M., Riggs, L. K., Wiggins, R. C. Evaluation of a thick and thin section method for estimation of podocyte number, glomerular volume, and glomerular volume per podocyte in rat kidney with Wilms’ tumor-1 protein used as a podocyte nuclear marker. Journal of the American Society of Nephrology. 14 (10), 2484-2493 (2003).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Lloyd-Lewis, B., et al. Imaging the mammary gland and mammary tumours in 3D: optical tissue clearing and immunofluorescence methods. Breast Cancer Research. 18 (1), 127 (2016).
- Ren, Z., et al. CUBIC-plus: An optimized method for rapid tissue clearing and decolorization. Biochemical and Biophysical Research Communications. 568, 116-123 (2021).
- Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
- Matsumoto, K., et al. Advanced CUBIC tissue clearing for whole-organ cell profiling. Nature Protocols. 14 (12), 3506-3537 (2019).
- Puelles, V. G., Moeller, M. J., Bertram, J. F. We can see clearly now: optical clearing and kidney morphometrics. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (3), 179-186 (2017).
- Zhu, J., et al. Optimal combinations of fluorescent vessel labeling and tissue clearing methods for three-dimensional visualization of vasculature. Neurophotonics. 9 (4), 045008 (2022).
- Klingberg, A., et al. Fully automated evaluation of total glomerular number and capillary tuft size in nephritic kidneys using lightsheet microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).
- Renier, N., et al. iDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Bai, L., et al. A simple and effective vascular network labeling method for transparent tissues of mice. Journal of Biophotonics. 16 (7), e202300042 (2023).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Kolesová, H., Olejníčková, V., Kvasilová, A., Gregorovičová, M., Sedmera, D. J. I. Tissue clearing and imaging methods for cardiovascular development. Iscience. 238 (2), 489-507 (2021).
- Tian, T., Yang, Z., Li, X. Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications. Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).
- Du, H., Hou, P., Zhang, W., Li, Q. Advances in CLARITY-based tissue clearing and imaging. Experimental and Therapeutic. 16 (3), 1567-1576 (2018).
- Ertürk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 89, e51382 (2014).
