Summary
Proporcionamos un protocolo para un modelo experimental de shock endotoxémico en cerdos mediante infusión de lipopolisacáridos.
Abstract
La sepsis y el shock séptico se encuentran con frecuencia en pacientes tratados en unidades de cuidados intensivos (UCI) y se encuentran entre las principales causas de muerte en estos pacientes. Es causada por una respuesta inmunitaria desregulada a una infección. Incluso con un tratamiento optimizado, las tasas de mortalidad siguen siendo altas, lo que hace necesario obtener más información sobre la fisiopatología y nuevas opciones de tratamiento. El lipopolisacárido (LPS) es un componente de la membrana celular de las bacterias gramnegativas, que a menudo son responsables de infecciones que causan sepsis y shock séptico.
La gravedad y la alta mortalidad de la sepsis y el shock séptico hacen que los estudios experimentales estandarizados en humanos sean imposibles. Por lo tanto, se necesita un modelo animal para futuros estudios. El cerdo es especialmente adecuado para este propósito, ya que se parece mucho a los humanos en anatomía, fisiología y tamaño.
Este protocolo proporciona un modelo experimental para el shock endotoxémico en cerdos por infusión de LPS. Pudimos inducir de manera confiable los cambios que se observan con frecuencia en los pacientes con shock séptico, incluida la inestabilidad hemodinámica, la insuficiencia respiratoria y la acidosis. Esto permitirá a los investigadores obtener información valiosa sobre esta afección tan relevante y evaluar nuevos enfoques terapéuticos en un entorno experimental.
Introduction
La sepsis y el shock séptico se encuentran entre las principales causas de mortalidad en pacientes que reciben tratamiento de cuidados intensivos 1,2,3. La sepsis surge cuando una infección desencadena una respuesta inmunitaria desregulada que resulta en una falla multiorgánica. Se caracteriza por síntomas potencialmente mortales, como inestabilidad hemodinámica, dificultad respiratoria, insuficiencia hepática y renal, así como deterioro cognitivo 4,5. El shock séptico representa un subconjunto de sepsis con síntomas particularmente graves que aumentan significativamente la mortalidad. Estos síntomas incluyen hipotensión persistente que requiere terapia vasopresora y un nivel de lactato sérico superior a 2 mmol∙L-1 4,5. Las tasas de mortalidad en pacientes con shock séptico se han estimado en hasta el 40%, incluso con tratamiento hospitalario 1,3,5.
Las bacterias gramnegativas, como Pseudomonas y Escherichia coli, a menudo causan infecciones que desencadenan esta respuesta inmunitaria desregulada4. Los mecanismos fisiopatológicos subyacentes son complejos y aún no se comprenden completamente. Un aspecto bien descrito es la activación de los receptores tipo Toll en las células inmunitarias mediante patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs), lo que conduce a la liberación de citocinas como el factor de necrosis tumoral alfa (TNFα) o la interleucina 1 (IL 1)4. Uno de estos PAMPs es el lipopolisacárido (LPS), que constituye un componente de la membrana celular en bacterias gramnegativas6. El LPS se ha empleado en modelos animales para inducir endotoxemia y shock endotoxémico 7,8.
Los modelos animales proporcionan un entorno controlado y estandarizado para desarrollar e investigar nuevas estrategias de tratamiento. Debido a su anatomía similar, fisiología inmunológica y parámetros hemodinámicos comparables, el modelo porcino es particularmente adecuado para estudiar los efectos del shock endotoxémico 9,10. Además, los equipos médicos estándar comúnmente utilizados en pacientes humanos se pueden aplicar fácilmente en cerdos debido al tamaño similar de sus vías respiratorias y vasos sanguíneos, lo que facilita la instrumentación y el monitoreo hemodinámico.
Con este protocolo, proporcionamos un modelo experimental para el shock endotoxémico en cerdos mediante la infusión intravenosa de LPS derivado de E. coli. Para monitorizar los efectos, se midieron parámetros hemodinámicos y pulmonares, como la presión arterial, la frecuencia cardíaca, la saturación periférica de oxígeno, la presión arterial pulmonar y la presión de las vías respiratorias. Para evaluar la influencia de la endotoxemia en el suministro de oxígeno cerebral, se utilizó espectrometría de infrarrojo cercano (NIRS). Con este método, la saturación de oxígeno cerebral puede ser evaluada a través de un electrodo adhesivo aplicado en la frente11.
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Protocol
Los experimentos de este protocolo fueron aprobados por el Comité Estatal e Institucional de Cuidado de Animales (Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz, Koblenz, Alemania, TVA G21-1-080). Los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de ARRIVE. Para este estudio, se utilizaron seis cerdos Landrace alemanes machos sanos de 2-3 meses de edad y con un peso de 30-35 kg. La cronología experimental se resume en la Figura 1. Los detalles relacionados con todos los materiales e instrumentos utilizados en este protocolo se enumeran en la Tabla de Materiales.
Figura 1: Cronología experimental. Se realizaron mediciones sanitarias basales después de la preparación del animal y un período de estabilización de 30 min. La endotoxemia fue inducida por la inyección de LPS durante 30 min y se tomaron mediciones a las 0 h después de otros 30 min; Después de eso, las mediciones horarias continuaron durante 4 h. Abreviaturas: BLH = línea de base saludable; LPS = lipopolisacárido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
1. Preparación animal
- Mantenga a los animales en su entorno habitual durante el mayor tiempo posible para minimizar el estrés. Suspenda los alimentos durante 6 h antes de la administración de la anestesia, permitiendo el libre acceso al agua.
- Sedar a los animales con una inyección intramuscular de azaperona (3 mg∙kg-1) y midazolam (0,5 mg kg-1) mientras aún están en su entorno normal.
- Una vez que la sedación surta efecto, lo que generalmente ocurre dentro de aproximadamente 15-20 minutos después de la administración, transporte a los cerdos al laboratorio.
NOTA: Es crucial asegurarse de que se mantenga una sedación continua durante toda la transferencia; Dependiendo de la legislación regional, esto puede requerir la supervisión permanente de un veterinario. - Preste mucha atención a mantener la temperatura corporal normal de los cerdos (~38 °C) durante el transporte. Por ejemplo, considera cubrir al animal con una manta para evitar la hipotermia.
NOTA: Es importante limitar el tiempo de transporte para no exceder la duración de la sedación, que suele oscilar entre 30 min y 60 min. - Después de la desinfección, establecer un acceso intravenoso mediante la inserción de un catéter de 22 G en la vena auricular. Antes de continuar con cualquier movimiento adicional del cerdo o la inducción de la anestesia, asegúrese de que el catéter esté bien fijado para evitar la dislocación por movimientos bruscos.
- Controle continuamente la saturación de oxígeno periférica mediante un sensor enganchado a la cola o a la oreja.
2. Anestesia y ventilación mecánica
- Administrar fentanilo intravenoso (4 μg kg-1) y propofol (3 mg kg-1) para inducir la anestesia.
- Coloca al cerdo en posición supina.
- Administrar atracurio (0,5 mg kg-1) como relajante muscular e iniciar inmediatamente la ventilación no invasiva con una máscara de ventilación para perros. Coloque la máscara sobre el hocico y aplique una presión firme con los pulgares mientras tira de la mandíbula inferior hacia adelante con el dedo medio/anular. Ajuste el ventilador a los siguientes parámetros: fracción inspiratoria de oxígeno (FiO2 ) = 100%, volumen corriente = 6-8 mL kg-1, presión positiva al final de la espiración (PEEP) = 5 mbar, presión inspiratoria máxima ≤ 20 mbar, frecuencia respiratoria = 18-20 min-1.
- Mantener la anestesia iniciando una infusión continua de una solución electrolítica balanceada (5 mL kg-1 h-1), fentanilo (10 μg kg-1 h-1) y propofol (6 mg kg-1 h-1).
- Realice la intubación endotraqueal utilizando un tubo endotraqueal estándar (diámetro interior de 6-7 mm), una guía y un laringoscopio equipado con una cuchilla Macintosh (tamaño 4).
- Pídele a un asistente que abra la boca y sostenga la lengua hacia el lado izquierdo.
- Inserte la cuchilla del Macintosh hasta que la epiglotis sea visible. Luego, levante el laringoscopio hacia arriba para mover la epiglotis ventralmente y visualizar las cuerdas vocales. Ocasionalmente, la epiglotis puede pegarse al paladar blando; En este caso, muévalo deslizando suavemente hacia los lados con el tubo o un bougie.
- Inserte con cuidado el tubo endotraqueal a través de las cuerdas vocales y retire el inductor. Si tiene dificultades, intente girar el tubo sin aplicar una fuerza excesiva. Si es necesario, use un tubo más pequeño. Una vez que el tubo esté en su lugar, infle el manguito con 10 ml de aire.
- Conecte el tubo endotraqueal al ventilador e inicie la ventilación. Confirme la colocación adecuada de la sonda detectando el CO2 al final de la espiración y realizando una auscultación bilateral. Utilice los siguientes ajustes de ventilación: FiO2 = 40%, volumen corriente = 6-8 mL kg-1, PEEP = 5 mbar, relación inspiración/espiración = 1:2, frecuencia respiratoria = ajustada para lograr un nivel de CO2 al final de la espiración de <45 mmHg, normalmente 30-40 min-1 .
NOTA: Si el tubo se ha colocado incorrectamente en el esófago, el aire inflará el estómago, causando una protuberancia visible. En tales casos, retire inmediatamente el tubo, administre ventilación no invasiva durante 1-2 minutos y vuelva a colocar el tubo correctamente. - Inserte una sonda gástrica para prevenir el reflujo o los vómitos. Si la inserción resulta difícil, utilice el laringoscopio para obtener una mejor visión de la entrada esofágica.
3. Instrumentación
- Colocar una vía arterial y una vena central en la arteria y la vena femoral, respectivamente, para la monitorización hemodinámica y la terapia de volumen intravenoso.
- Use vendajes para retraer y asegurar las patas traseras, proporcionando un mejor acceso a los vasos femorales.
- Prepare todos los materiales necesarios antes de la instrumentación. Llene todos los catéteres con solución salina y garantice un fácil acceso a los cables y catéteres para minimizar la necesidad de múltiples intentos de cateterismo y la pérdida innecesaria de sangre.
- Aplique un desinfectante alcohólico en el área inguinal y límpiela con un hisopo estéril. Repite este proceso dos veces. Vuelva a aplicar el desinfectante sin limpiar y espere 3 min. Coloque un paño fenestrado estéril sobre el área inguinal.
- Use ultrasonido para identificar los vasos sanguíneos femorales. Utilice una técnica de Seldinger guiada por ultrasonido en el plano para el cateterismo a fin de minimizar el daño tisular y la pérdida de sangre.
- Visualiza la arteria femoral longitudinalmente. Punción de la arteria con una jeringa conectada a la aguja para una aspiración continua. La sangre pulsante de color rojo brillante confirma la punción arterial. Retire la jeringa e inserte el alambre preparado. Retire la aguja mientras deja el alambre en su lugar.
- Repita el mismo procedimiento para la vena femoral. La punción venosa se confirma por sangre de color rojo oscuro que fluye lentamente.
- Confirme la posición correcta de ambos cables visualizando ambos vasos femorales mediante ecografía.
- Utilice la técnica de Seldinger para insertar primero la vaina introductora arterial, seguida de la vaina introductora venosa. Confirme la posición correcta mediante el análisis de gases en sangre de las muestras de sangre extraídas de las dos líneas.
- Asegúrese de que la sangre pueda ser aspirada por todas las vías. Enjuague todas las líneas con solución salina para evitar la formación de coágulos.
- Fije firmemente las líneas a la piel con suturas quirúrgicas para evitar la dislocación.
- Conectar las vías venosas arteriales y centrales a transductores para la medición de parámetros hemodinámicos.
- Inserte un catéter de gasto cardíaco de contorno de pulso (PiCCO) en la vaina introductora arterial y conéctelo al transductor de presión arterial y al cable de interfaz de temperatura del monitor PiCCO.
- Conecte un catéter Swan-Ganz a un transductor.
- Mientras mide continuamente la presión, inserte el catéter en la vaina introductora venosa central. Infle el balón después de aproximadamente 30 cm, cuando se hace visible una curva de presión venosa central.
- Avance lentamente el catéter mientras monitorea la curva de presión. A medida que el catéter entra en el ventrículo derecho, busque una curva de pulso con un valor sistólico alto y diastólico bajo. Un mayor avance del catéter dará como resultado un valor sistólico constante y un aumento del valor diastólico, lo que indica la colocación en la arteria pulmonar.
- Fije el catéter en esta posición (generalmente entre 50 y 70 cm). Conecte el sensor de temperatura de inyección del sistema PiCCO a la luz proximal del catéter Swan-Ganz.
- Afeitar la frente del cerdo y aplicar el electrodo sensor adhesivo para medir la saturación de oxígeno regional cerebral.
- Después de la inducción de la anestesia y la instrumentación, dejar que el animal se estabilice durante 30 minutos o hasta que los parámetros hemodinámicos se hayan estabilizado antes de realizar mediciones basales e inducir un shock endotoxémico.
4. Inducción de choque
NOTA: Cuando trabaje con LPS, siempre use guantes, gafas protectoras, una máscara y una bata de laboratorio. Evite el contacto directo con LPS.
- Preparar una solución de LPS con una concentración de 100 μg mL-1 disolviendo 5 mg de LPS en 50 mL de NaCl al 0,9%.
- Obtener mediciones hemodinámicas basales inmediatamente antes de iniciar la infusión de LPS.
- Administrar una dosis de 150 μg kg-1 de LPS durante 30 min (equivalente a una velocidad de perfusión continua de 300 μg kg-1∙h-1 durante 30 min).
- Después de 30 minutos, reduzca la velocidad de infusión a 15 μg∙kg-1∙h-1 durante el resto del experimento.
- Monitorizar continuamente los parámetros hemodinámicos, incluyendo la presión arterial arterial y pulmonar, la frecuencia cardíaca y los parámetros de ventilación. Controle la temperatura corporal continuamente para mantener la normotermia.
5. Tratamiento de la inestabilidad hemodinámica
- Cuando la presión arterial media cae por debajo de 60 mmHg, utilice PiCCO para medir el índice cardíaco (IC), el índice global de volumen telediastólico (GEDI) y el índice de agua pulmonar extravascular (ELWI). Tratar la presión arterial baja de acuerdo con las recomendaciones del diagrama de flujo de la Figura 2.
- En el monitor PiCCO, presione el botón de termodilución (TD).
- Presione el botón de entrada de presión venosa central (CVP) e ingrese el valor actual de CVP .
- Presione el botón Inicio .
- Cuando se le indique que lo haga, inyecte 10 ml de solución salina fría en el sensor de temperatura de inyección conectado al catéter Swan-Ganz.
NOTA: No inyecte nada más directamente antes o durante la medición de PiCCO, ya que esto comprometería la medición.
- Después de obtener las mediciones de IC, GEDI y ELWI, tratar la inestabilidad hemodinámica de acuerdo con el diagrama de flujo de la Figura 2. Si se recomienda la carga de volumen, infunda rápidamente 200 ml de solución electrolítica balanceada. Si se recomienda el tratamiento con catecolaminas, aumentar la velocidad de infusión de norepinefrina en 1 μg kg-1 h-1.
- Repita este proceso cada vez que la presión arterial media caiga por debajo de 60 mmHg. En caso de inestabilidad hemodinámica grave, se debe optar por una rápida escalada de la terapia.
Figura 2: Terapia de inestabilidad hemodinámica guiada por PiCCO. Después de obtener las mediciones de IC, GEDI y ELWI, aplique el tratamiento de acuerdo con la tabla. Esta cifra fue adaptada de la guía del usuario de PiCCO12. Abreviaturas: PiCCO = gasto cardíaco en el contorno del pulso; V+ = carga de volumen; cat = terapia con catecolaminas; V- = reducción de volumen; IC = índice cardíaco; GEDI = índice global de volumen telediastólico; ELWI = índice de agua pulmonar extravascular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
6. Fin del experimento y eutanasia
- Inyectar 0,5 mg de fentanilo por vía intravenosa. Espere 5 min. Inyectar 200 mg de propofol.
- Sacrificar al cerdo con una inyección rápida de 40 mL de cloruro potásico 1 M a través de la vía venosa central.
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Representative Results
Para este estudio, seis cerdos machos sanos de 2-3 meses de edad y con un peso de 30-35 kg fueron anestesiados y recibieron una infusión de lipopolisacárido (LPS) para inducir endotoxemia. Para determinar la dosis apropiada de LPS requerida para inducir consistentemente los síntomas de shock, a los cerdos se les administraron varias dosis de inducción de LPS que oscilaban entre 100 μg kg-1 y 200 μg kg-1 durante un período de 30 minutos, seguidas de una dosis de mantenimiento de 1/10 de la dosis inicial por hora durante el resto del experimento. Todos los animales mostraron signos de shock poco después de la infusión de LPS. Los parámetros hemodinámicos se monitorizaron mediante el sistema PiCCO. Los animales demostraron una disminución en el índice cardíaco y un aumento en la frecuencia cardíaca, lo que indica inestabilidad hemodinámica durante el estado de shock. La presión arterial media disminuyó tras la infusión de LPS, pero se mantuvo por encima de 60 mmHg mediante reanimación con líquidos o infusión de norepinefrina si era necesario (Figura 3). El daño pulmonar se indicó por una disminución de la relación PaO2 FiO 2-1 y un aumento de la presión arterial pulmonar (Figura 4). La oxigenación cerebral se midió mediante espectroscopia de infrarrojo cercano (NIRS) y disminuyó tras la inducción del shock (Figura 5). Los animales también presentaron acidosis y aumento de los niveles de lactato (Figura 6). Se utilizó un ANOVA de un factor con comparaciones múltiples para determinar la significación.
Figura 3: Desarrollo de los parámetros hemodinámicos después de la infusión de LPS. (A) La presión arterial media disminuyó después de la inducción del shock, pero se mantuvo por encima de 60 mmHg utilizando la infusión de norepinefrina si era necesario. (B) el índice cardíaco disminuyó y (C) la frecuencia cardíaca aumentó después de la infusión de LPS. Se muestran la media y la desviación estándar. *p < 0,05 en comparación con las mediciones iniciales. Abreviaturas: BLH = salud basal; LPS = lipopolisacárido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Desarrollo de los parámetros pulmonares después de la infusión de LPS. (A) La relación PaO2 FiO2-1 disminuyó poco después de la infusión de LPS. (B) La presión motriz aumentó después de la inducción del choque. (C) La presión arterial pulmonar también aumentó durante el shock. Se muestran la media y la desviación estándar. *p < 0,05 en comparación con las mediciones iniciales. Abreviaturas: BLH = salud basal; LPS = lipopolisacárido; FiO2 = fracción inspiratoria de oxígeno; PaO2 = presión parcial de oxígeno en sangre arterial. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Oxigenación cerebral tras la infusión de LPS. La oxigenación cerebral medida mediante espectroscopia de infrarrojo cercano disminuyó después de la inducción de choque con LPS. Se muestran la media y la desviación estándar. *p < 0,05 en comparación con las mediciones iniciales. Abreviaturas: BLH = salud basal; LPS = lipopolisacárido; NIRS = espectroscopía de infrarrojo cercano. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Gasometría arterial durante la endotoxemia inducida por LPS. (A) Los animales se volvieron más acidóticos con el tiempo y (B) los niveles de lactato aumentaron después de la infusión de LPS. Se muestran la media y la desviación estándar. *p < 0,05 en comparación con las mediciones iniciales. Abreviaturas: BLH = salud basal; LPS = lipopolisacárido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Presentamos un protocolo para la inducción de endotoxemia experimental en cerdos a través de la infusión de LPS, con el objetivo de inducir de manera confiable los cambios comúnmente observados en la sepsis y el shock séptico. Es necesario tener en cuenta varios pasos críticos en este protocolo. La sedación adecuada de los cerdos antes del transporte es crucial para evitar la elevación de los niveles de catecolaminas inducida por el estrés, lo que podría comprometer los resultados. La intubación de los cerdos puede plantear desafíos en comparación con los humanos debido a las características anatómicas de sus hocicos alargados. Para abordar esto, recomendamos el uso de una cuchilla Macintosh para la intubación, y el tubo endotraqueal debe estar equipado con un inductor recto. Es común que la epiglotis se adhiera al paladar blando y, en ocasiones, puede ser necesario un tubo endotraqueal más pequeño debido al estrechamiento subglótico de la tráquea del animal, por lo que un tubo que pueda pasar a través de las cuerdas vocales aún puede ser demasiado grande.
Antes de la infusión de LPS, es esencial una preparación precisa de la concentración de LPS. La administración de una dosis más alta de LPS puede provocar inestabilidad hemodinámica grave e incluso la muerte, mientras que una dosis más baja puede no producir los efectos deseados. Además, debe tenerse en cuenta que las diferentes cargas de LPS pueden exhibir diferentes niveles de eficacia. Recomendamos usar el mismo cargo de LPS para cada prueba. Se pueden realizar ensayos de determinación de dosis para determinar la dosis adecuada para cada estudio. Al inicio de la infusión de LPS, la monitorización continua de los parámetros hemodinámicos es crucial debido a la posibilidad de una rápida inestabilidad. Puede ser necesaria una intervención inmediata para controlar cualquier efecto adverso.
Se utilizó PiCCO para mediciones hemodinámicas avanzadas. Esta tecnología también se utiliza con frecuencia en pacientes humanos tratados en la UCI. Fue desarrollado para humanos y su uso en cerdos puede plantear algunos desafíos. El área de superficie corporal (ASC) se utiliza para el cálculo de parámetros hemodinámicos. Esto se calcula automáticamente cuando se ingresa la altura y el peso del paciente. Aunque la fórmula utilizada aquí (para humanos) no es ideal para calcular el BSA de los cerdos, desafortunadamente no hay otra forma de ingresar al BSA. Este problema se resolvió introduciendo una altura de 130 cm para los cerdos, ya que en nuestra experiencia, esto produce los resultados más adecuados para BSA. Sin embargo, esta limitación debe tenerse en cuenta a la hora de interpretar los resultados de PiCCO.
Estudios previos han descrito el uso de LPS para simular el shock séptico en cerdos. En estos estudios, se describen cambios frecuentemente observados en pacientes sépticos, como hipotensión, vasodilatación periférica, aumento de la presión arterial pulmonar y aumento del consumo sistémico de oxígeno 13,14,15. También se han descrito métodos alternativos para inducir sepsis experimental y shock séptico en cerdos. Un modelo consiste en la inducción de peritonitis a través de la administración intraperitoneal de heces 16,17,18,19. Otro abordaje es la inyección directa de bacterias vivas en el torrente sanguíneo de los animales19,20. En comparación con la inyección de LPS, los protocolos que utilizan peritonitis o bacteriemia para inducir sepsis experimental ofrecen la ventaja de un mayor realismo. Estos métodos inducen una afección séptica real a través de una infección bacteriana, mientras que la inyección de LPS solo representa un aspecto único de los mecanismos patogénicos subyacentes.
Sin embargo, el método de infusión de LPS también tiene sus méritos. En comparación con el modelo de peritonitis, este protocolo requiere menos esfuerzo y experiencia, ya que solo implica una inyección intravenosa sin necesidad de acceso intraperitoneal. Además, los síntomas de shock se manifiestan más rápidamente que en los otros modelos, lo que permite tiempos de observación más cortos y una menor utilización de recursos. Además, los resultados son altamente reproducibles, ya que cada cerdo recibe la misma dosis de LPS. Por el contrario, la composición de las heces administradas puede variar significativamente y el crecimiento bacteriano está influenciado por factores incontrolables19.
A pesar de ciertas limitaciones, este protocolo indujo consistentemente un shock endotoxémico, afectando a múltiples sistemas de órganos. Observamos alteraciones características en la función pulmonar y hemodinámica, junto con niveles elevados de lactato en todos los animales tratados con LPS. Debido a la anestesia profunda continua durante todo el experimento, no pudimos evaluar la función cognitiva, que se incorpora a la puntuación SOFA utilizando la escala de coma de Glasgow en humanos. Sin embargo, observamos una reducción en la oxigenación cerebral, lo que sugiere un impacto potencial del choque inducido por LPS en la función cerebral. En las primeras etapas, la sepsis a menudo se asocia con una fase hiperdinámica caracterizada por un gasto cardíaco elevado. Debido a la rápida progresión de los síntomas en este modelo, los datos presentados aquí no muestran adecuadamente esta fase hiperdinámica. Si esta fase es de particular interés, las mediciones deben tomarse con más regularidad en la fase inicial del experimento. Un ajuste de la dosis de LPS puede ayudar a ralentizar el desarrollo de los síntomas y facilitar la observación de la fase hiperdinámica.
El LPS y otras endotoxinas bacterianas se han empleado previamente para simular la sepsis en modelos de animales pequeños8. Sin embargo, el uso de cerdos en este contexto plantea ciertos desafíos en comparación con los modelos de animales pequeños como los ratones. La cría y el mantenimiento de los cerdos requieren mucho más tiempo y esfuerzo, y se pueden utilizar menos animales por experimento. Sin embargo, los modelos animales grandes, en particular los cerdos, proporcionan una representación más realista del cuerpo humano. Los cerdos presentan similitudes con los humanos en términos de anatomía, genoma, dieta y capacidad de respuesta del sistema inmunitario 9,10. Otra ventaja es la posibilidad de repetir los análisis de muestras de sangre. Si bien los modelos de animales pequeños a menudo necesitan equipos especializados, los equipos médicos estándar comúnmente utilizados en pacientes humanos se pueden aplicar a los cerdos, lo que se asemeja a la instrumentación y el monitoreo hemodinámico en un entorno clínico de UCI. En conclusión, este protocolo establece un modelo experimental de endotoxemia en cerdos mediante infusión de LPS. Ofrece un método simple y estandarizado para inducir consistentemente los cambios que se observan con frecuencia en los pacientes con shock séptico.
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Disclosures
El dispositivo NIRS fue proporcionado incondicionalmente por Medtronic PLC, EE. UU., con fines de investigación experimental. Alexander Ziebart recibió una conferencia de Medtronic PLC. Ninguno de los autores informa de ningún conflicto de intereses financieros o de otro tipo. El manuscrito fue revisado y editado por ChatGPT® (Python Software, Versión: 24 de mayo de 2023).
Acknowledgments
Los autores quieren agradecer a Dagmar Dirvonskis por su excelente apoyo técnico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Atracurium Hikma 50 mg/5mL | Hikma Pharma GmbH, Martinsried | ||
| Azaperone (Stresnil) 40 mg/mL | Lilly Deutschland GmbH, Bad Homburg, Germany | ||
| BD Discardit II Spritze 2, 5, 10, 20 mL | Becton Dickinson S.A. Carretera, Mequinenza Fraga, Spain | syringe | |
| BD Luer Connecta | Becton Dickinson Infusion Therapy, AB Helsingborg, Schweden | 3-way-stopcock | |
| Curafix i.v. classics | Lohmann & Rauscher International GmbH & Co. KG, Rengsdorf, Germany | Cannula retention dressing | |
| Datex Ohmeda S5 | GE Healthcare Finland Oy, Helsinki, Finland | hemodynamic monitor | |
| Engström Carestation | GE Heathcare, Madison USA | ventilator | |
| Fentanyl-Janssen 0.05 mg/mL | Janssen-Cilag GmbH, Neuss | fentanyl | |
| Führungsstab, Durchmesser 4.3 | Rüsch | endotracheal tube introducer | |
| Incetomat-line 150 cm | Fresenius, Kabi Deutschland, GmbH | perfusor line | |
| Intrafix Primeline | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | Infusion line | |
| Introducer sheath 5 Fr. | Terumo Healthcare | arterial introducer | |
| INVOS | Medtronic, Dublin, Ireland | near infrared spectrometry | |
| JOZA Einmal Nitril Untersuchungshandschuhe | JOZA, München, Germany | disposable gloves | |
| Laryngoscope, 45.48.50, KL 2000 | Medicon | Laryngoscope handle | |
| Littmann Classic III Stethoscope | 3M Deutschland GmbH, Neuss, Germany | stethoscope | |
| LPS (E. coli; Serotype O111:B4) | Sigma-Aldrich, Switzerland | ||
| MAC Two-Lumen Central venous access set | Arrow international inc. Reading, PA, USA | venous introducer | |
| Maimed Vlieskompresse | Maimed GmbH, Neuenkirchen, Germany | Fleece compress to fix the tongue | |
| Masimo LNCS Adtx SpO2 sensor | Masimo Corporation Irvine, Ca 92618 USA | saturation clip for the tail | |
| Masimo LNCS TC-I SpO2 ear clip sensor | Masimo Corporation Irvine, Ca 92618 USA | Saturation clip for the ear | |
| Masimo Radical 7 | Masimo Corporation Irvine, Ca 92618 USA | periphereal oxygen saturation | |
| Midazolam 15 mg/3 mL | B.Braun Melsungen AG, Germany | ||
| Midmark Canine Mask Small Plastic with Diaphragm FRSCM-0005 | Midmark Corp., Dayton, Ohio, USA | dog ventilation mask | |
| Monocryl surgical suture | Johnson & Johnson, Belgium | ||
| B.Braun Melsungen AG, Germany | saline solution | ||
| NaCl 0.9 % | Sanofi- Aventis, Seutschland GmbH | ||
| Octeniderm farblos | Schülke & Mayr GmbH, Nordenstedt, Germany | Alcoholic disinfectant | |
| Original Perfusor syringe 50 mL | B.Braun Melsungen AG, Germany | perfusor syringe | |
| PA-Katheter Swan Ganz 7.5 Fr 110 cm | Edwards Lifesciences LLC, Irvine CA, USA | Swan-Ganz catheter | |
| Perfusor FM Braun | B.Braun Melsungen AG, Germany | syringe pump | |
| PiCCO catheter | PULSION Medical Systems SE, Feldkirchen, DE | ||
| Potassium chloride 1 M | Fresenius, Kabi Germany GmbH | ||
| Propofol 2% 20 mg/mL (50 mL flasks) | Fresenius, Kabi Deutschland, GmbH | ||
| Pulse-contour continous cardiac output System PiCCO2 | PULSION Medical Systems SE, Feldkirchen, DE | ||
| Rüschelit Super Safety Clear >ID 6/6.5 /7.0 mm | Teleflex Medical Sdn. Bhd, Malaysia | endotracheal tube | |
| Sonosite Micromaxx Ultrasoundsystem | Sonosite Bothell, WA, USA | ultrasound | |
| Stainless Macintosh Größe 4 | Welch Allyn69604 | blade for laryngoscope | |
| Sterofundin | B.Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | Balanced electrolyte solution | |
| Vasco OP sensitive | B.Braun Melsungen AG, Germany | sterile gloves | |
| Vasofix Safety 22 G-16 G | B.Braun Melsungen AG, Germany | venous catheter | |
| VBM Cuff Manometer | VBM Medizintechnik GmbH, Sulz a.N., Germany | cuff pressure gauge |
References
- Vincent, J. -L., Jones, G., David, S., Olariu, E., Cadwell, K. K. Frequency and mortality of septic shock in Europe and North America: a systematic review and meta-analysis. Critical Care. 23 (1), 196 (2019).
- Reinhart, K., et al. Recognizing sepsis as a Global Health Priority - A WHO Resolution. New England Journal of Medicine. 377 (5), 414-417 (2017).
- Cecconi, M., Evans, L., Levy, M., Rhodes, A.
- Font, M. D., Thyagarajan, B., Khanna, A. K. Sepsis and septic shock - basics of diagnosis, pathophysiology and clinical decision making. Medical Clinics of North America. 104 (4), 573-585 (2020).
- Singer, M., et al. The Third International Consensus definitions for sepsis and septic shock (Sepsis-3). JAMA. 315 (8), 801 (2016).
- Jerala, R.
- Copeland, S., Warren, H. S., Lowry, S. F., Calvano, S. E., Remick, D. Inflammation and the host response to injury investigators acute inflammatory response to endotoxin in mice and humans. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12 (1), 60-67 (2005).
- Dickson, K., Lehmann, C. Inflammatory response to different toxins in experimental sepsis models. International Journal of Molecular Sciences. 20 (18), 4341 (2019).
- Bassols, A., Costa, C., Eckersall, P. D., Osada, J., Sabrià, J., Tibau, J. The pig as an animal model for human pathologies: A proteomics perspective. PROTEOMICS - Clinical Applications. 8 (9-10), 715-731 (2014).
- Meurens, F., Summerfield, A., Nauwynck, H., Saif, L., Gerdts, V. The pig: a model for human infectious diseases. Trends in Microbiology. 20 (1), 50-57 (2012).
- Ali, J., Cody, J., Maldonado, Y., Ramakrishna, H. Near-infrared spectroscopy (NIRS) for cerebral and tissue oximetry: analysis of evolving applications. Journal of Cardiothoracic and Vascular Anesthesia. 36, 2758-2766 (2022).
- Getinge Deutschland GmbH PiCCO Technologie Erweitertes hämodynamisches Monitoring auf höchstem Niveau. , Available from: https://www.getinge.com/dam/hospital/documents/german/picco_haemodynamisches_monitoring_broschuere-de-non_us.pdf (2023).
- Breslow, M. J., Miller, C. F., Parker, S. D., Walman, A. T., Traystman, R. J. Effect of vasopressors on organ blood flow during endotoxin shock in pigs. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 252 (2), H291-H300 (1987).
- Fink, M. P., et al. Systemic and mesenteric O2 metabolism in endotoxic pigs: effect of ibuprofen and meclofenamate. Journal of Applied Physiology. 67 (5), Bethesda, Md. 1950-1957 (1989).
- Lado-Abeal, J., et al. Lipopolysaccharide (LPS)-induced septic shock causes profound changes in myocardial energy metabolites in pigs. Metabolomics. 14 (10), 131 (2018).
- Park, I., et al. Characterization of fecal peritonitis-induced sepsis in a porcine model. The Journal of Surgical Research. 244, 492-501 (2019).
- Jarkovska, D., et al. Heart rate variability in porcine progressive peritonitis-induced sepsis. Frontiers in Physiology. 6, 412 (2015).
- Kohoutova, M., et al. Vagus nerve stimulation attenuates multiple organ dysfunction in resuscitated porcine progressive sepsis. Critical Care Medicine. 47 (6), e461-e469 (2019).
- Vintrych, P., et al. Modeling sepsis, with a special focus on large animal models of porcine peritonitis and bacteremia. Frontiers in Physiology. 13, 1094199 (2022).
- Stengl, M., et al. Reduced L-type calcium current in ventricular myocytes from pigs with hyperdynamic septic shock. Critical Care Medicine. 38 (2), 579-587 (2010).
