Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

نمذجة الروابط في الخرائط المشتقة من المجهر الإلكتروني بالتبريد

Published: July 19, 2024 doi: 10.3791/66310
Automatic Translation
*1, *2, 1
1National Centre for Biological Sciences, Tata Institute of Fundamental Research, 2Institute for Stem Cell Science and Regenerative Medicine
* These authors contributed equally

Summary

يقدم هذا البروتوكول الأدوات المتاحة لنمذجة الروابط ذات الجزيئات الصغيرة في خرائط cryoEM للجزيئات الكبيرة.

Abstract

يعد فك رموز تفاعلات البروتين والليجند في مركب جزيئي كبير أمرا بالغ الأهمية لفهم الآلية الجزيئية والعمليات البيولوجية الأساسية وتطوير الأدوية. في السنوات الأخيرة ، ظهر المجهر الإلكتروني للعينة المبردة (cryoEM) كتقنية قوية لتحديد هياكل الجزيئات الكبيرة والتحقيق في طريقة ربط الربيطة بدقة شبه ذرية. غالبا ما يكون تحديد ونمذجة الجزيئات غير البروتينية في خرائط cryoEM أمرا صعبا بسبب الدقة متباينة الخواص عبر الجزيء محل الاهتمام والضوضاء المتأصلة في البيانات. في هذه المقالة ، يتم تعريف القراء على العديد من البرامج والأساليب المستخدمة حاليا لتحديد الليجند ، وبناء النماذج ، وتحسين الإحداثيات الذرية باستخدام جزيئات كبيرة مختارة. تتمثل إحدى أبسط الطرق لتحديد وجود الرباط، كما هو موضح بإنزيم الإنولاز، في طرح الخريطتين اللتين تم الحصول عليهما مع الربيطة وبدونها. من المرجح أن تبرز الكثافة الإضافية لليجند في خريطة الاختلاف حتى عند عتبة أعلى. هناك حالات ، كما هو موضح في حالة مستقبلات الغلوتامات الأيضية mGlu5 ، عندما لا يمكن إنشاء خرائط الفرق البسيطة هذه. يمكن أن تكون الطريقة التي تم إدخالها مؤخرا لاشتقاق خريطة حذف Fo-Fc بمثابة أداة للتحقق من وجود الرباط وإثباته. أخيرا ، باستخدام β-galactosidase المدروس جيدا كمثال ، يتم تحليل تأثير الدقة على نمذجة الروابط وجزيئات المذيبات في خرائط cryoEM ، ويتم تقديم نظرة عامة حول كيفية استخدام cryoEM في اكتشاف الأدوية.

Introduction

تنجز الخلايا وظائفها من خلال إجراء تفاعلات كيميائية لا حصر لها في وقت واحد وبشكل مستقل ، كل منها منظم بدقة لضمان بقائها وقدرتها على التكيف استجابة للإشارات البيئية. يتم تحقيق ذلك عن طريق التعرف الجزيئي ، والذي يمكن الجزيئات الحيوية ، وخاصة البروتينات ، من تكوين مجمعات عابرة أو مستقرة مع جزيئات كبيرة أخرى وكذلك جزيئات صغيرة أو روابط1. وبالتالي ، فإن تفاعلات البروتين والليجند أساسية لجميع العمليات في علم الأحياء ، والتي تشمل تنظيم تعبير البروتين ونشاطه ، والتعرف على الركائز والعوامل المساعدة بواسطة الإنزيمات ، وكذلك كيفية إدراك الخلايا لإشارات 1,2 وترحيلها. يكشف الفهم الأفضل للخصائص الحركية والديناميكية الحرارية والهيكلية لمركب البروتين والليجند عن الأساس الجزيئي لتفاعل الليجند ويسهل أيضا التصميم العقلاني للدواء من خلال تحسين التفاعل الدوائي والنوعية. يتمثل النهج الاقتصادي والأسرع لدراسة تفاعل البروتين والليجند في استخدام الالتحام الجزيئي ، وهي طريقة حسابية تفحص فعليا مجموعة متنوعة من الجزيئات الصغيرة وتتنبأ بوضع الارتباط وتقارب هذه الروابط لاستهدافالبروتينات 3. ومع ذلك ، فإن الأدلة التجريبية من الهياكل عالية الدقة التي يحددها حيود الأشعة السينية (XRD) أو الرنين المغناطيسي النووي (NMR) أو المجهر الإلكتروني بالتبريد (cryoEM) توفر الدليل الأساسي لمثل هذه التنبؤات وتساعد في تطوير منشطات أو مثبطات أحدث وأكثر فعالية لهدف معين. تستخدم هذه المقالة الاختصار "cryoEM" كما يشار إلى التقنية عادة. ومع ذلك ، هناك نقاش مستمر حول اختيار التسمية الصحيحة ، ومؤخرا ، تم اقتراح مصطلحcryo genic-sample Electron Microscopy (cryoEM) للإشارة إلى أن العينة في درجة حرارة مبردة ويتم تصويرها بالإلكترونات4. وبالمثل ، فإن الخرائط المشتقة من cryoEM تسمى جهد الإلكترون أو الجهد الكهروستاتيكي أو جهد كولوم ، وللتبسيط ، نستخدم هنا خرائط cryoEM5،6،7،8،9،10.

على الرغم من أن XRD كانت التقنية القياسية الذهبية في تحديد البنية عالية الدقة لمجمعات البروتين ، إلا أن cryoEM بعد ثورةالدقة 11 اكتسبت زخما ، كما يتضح من زيادة خرائط Coulomb المحتملة أو خرائط cryoEM المودعة في قاعدة بيانات المجهر الإلكتروني (EMDB) 12,13 على مدى السنوات القليلةالماضية 14. نظرا للتقدم في إعداد العينات والتصوير وطرق معالجة البيانات ، زاد عدد ترسبات بنك بيانات البروتين (PDB) 14 التي تستخدم cryoEM من 0.7٪ إلى 17٪ بين عامي 2010 و 2020 ، مع تحديد ما يقرب من 50٪ من الهياكل المبلغ عنها في عام 2020 بدقة 3.5 Å أو أفضل15,16. تم اعتماد CryoEM بسرعة من قبل مجتمع البيولوجيا الهيكلية ، بما في ذلك صناعة الأدوية ، لأنه يسمح بدراسة الجزيئات البيولوجية الكبيرة المرنة وغير البلورية ، وخاصة البروتينات الغشائية والمجمعات متعددة البروتينات ، بدقة شبه ذرية ، والتغلب على عملية التبلور والحصول على بلورات حيود جيدة المطلوبة لتحديد بنية عالية الدقة بواسطة XRD.

تعد النمذجة الدقيقة لليجند في خريطة cryoEM أمرا بالغ الأهمية ، لأنها بمثابة مخطط لمجمع البروتين والليجند على المستوى الجزيئي. هناك العديد من أدوات بناء الرباط الآلية المستخدمة في علم البلورات بالأشعة السينية والتي تعتمد على شكل وطوبولوجيا كثافة الربيطة من أجل ملاءمة أو بناء الربيطة في كثافة الإلكترون17،18،19،20. ومع ذلك ، إذا كانت الدقة أقل من 3 Å ، فإن هذه الأساليب تميل إلى إنتاج نتائج أقل استحسانا لأن السمات الطوبولوجية التي تعتمد عليها للاعتراف والبناء تصبح أقل تحديدا. في كثير من الحالات ، أثبتت هذه الطرق عدم فعاليتها في نمذجة الروابط بدقة في خرائط cryoEM ، حيث تم تحديد هذه الخرائط في نطاق الدقة المنخفضة إلى المتوسطة ، عادة بين 3.5 Å-5 Å17.

تتضمن الخطوة الأولى في تحديد بنية 3D لمركب البروتين والليجند بواسطة cryoEM إما التنقية المشتركة لليجند مع البروتين (عندما يكون لليجند تقارب ارتباط عالي بالبروتين) أو احتضان محلول البروتين مع الربيطة لمدة محددة قبل إعداد الشبكة. بعد ذلك ، يتم وضع حجم عينة صغير على شبكة TEM هولي تنظيفها بالبلازما ، يليها تجميد فلاش في الإيثان السائل والتصوير في النهاية باستخدام cryo-TEM. يتم حساب متوسط صور الإسقاط 2D من مئات الآلاف إلى الملايين من الجسيمات الفردية لإعادة بناء خريطة إمكانات كولوم ثلاثية الأبعاد (3D) للجزيء الكبير. يشكل تحديد ونمذجة الروابط وجزيئات المذيبات في هذه الخرائط تحديات كبيرة في كثير من الحالات بسبب دقة الخواص عبر الخريطة (أي أن الدقة ليست موحدة عبر الجزيء الكبير) ، والمرونة في المنطقة التي يرتبط فيها الربيطة ، والضوضاء في البيانات. يتم الآن تكييف العديد من أدوات النمذجة والتحسين والتصور التي تم تطويرها ل XRD للاستخدام في cryoEM لنفس الأغراض18،19،20،21. في هذه المقالة ، يتم تقديم نظرة عامة على الأساليب والبرامج المختلفة المستخدمة حاليا لتحديد الروابط وبناء النماذج وتحسين الإحداثيات المشتقة من cryoEM. تم توفير بروتوكول خطوة بخطوة لتوضيح العمليات التي تنطوي عليها نمذجة الروابط باستخدام معقدات بروتين ليجند محددة بدقة وتعقيد متفاوتين.

تتضمن الخطوة الأولى في نمذجة الروابط في خرائط cryoEM تحديد كثافة الربيطة (غير البروتينية) في الخريطة. إذا كان ارتباط الربيطة لا يحدث أي تغيير مطابق في البروتين ، فإن حساب خريطة فرق بسيطة بين مركب البروتين والليجند وبروتين apo يسلط الضوء بشكل أساسي على مناطق الكثافة الإضافية ، مما يشير إلى وجود الرباط. يمكن ملاحظة هذه الاختلافات على الفور ، لأنها تتطلب خريطتين فقط ، وحتى الخرائط الوسيطة أثناء عملية تحسين 3D يمكن استخدامها للتحقق مما إذا كان الرباط موجودا. بالإضافة إلى ذلك ، إذا كانت الدقة عالية بما يكفي (<3.0 Å) ، فيمكن أن توفر خريطة الفرق أيضا نظرة ثاقبة لموقع جزيئات الماء وكذلك الأيونات التي تتفاعل مع الرباط وبقايا البروتين.

في غياب خريطة apo-protein ، أصبح من الممكن الآن استخدام Servalcat22 ، والذي يتوفر كأداة قائمة بذاتها وتم دمجه أيضا في مجموعة برامج CCP-EM23,24 كجزء من تحسين Refmac وفي إصدار CCP4 8.025,26. يسمح Servalcat بحساب خريطة الفرق المرجح FSC (Fo-Fc) باستخدام الخرائط النصفية غير الحادة ونموذج apoprotein كمدخلات. تمثل خريطة حذف Fo-Fc التباين بين الخريطة التجريبية (Fo) والخريطة المشتقة من النموذج (Fc). في حالة عدم وجود ليجند في النموذج ، فإن الكثافة الموجبة في خريطة Fo-Fc التي تتداخل مع خريطة EM التجريبية تشير عادة إلى وجود الرباط. الافتراض هنا هو أن سلسلة البروتين مثبتة جيدا في الخريطة ، وتشير الكثافة الموجبة المتبقية إلى موقع الرباط. ومع ذلك ، من المهم أن نفحص بدقة ما إذا كانت الكثافة الإيجابية تنبع من عدم دقة النمذجة ، مثل الدوار الخاطئ لسلسلة جانبية للبروتين.

تتضمن الخطوة الثانية الحصول على أو إنشاء ملف إحداثي ديكارتي لليجند بهندسة محددة جيدا من المعلومات الكيميائية المتاحة. يمكن استخدام الروابط القياسية (على سبيل المثال ، ATP و NADP +) المتوفرة بالفعل في مكتبة مونومر CCP4 للتحسين عن طريق استرداد ملفات الإحداثيات والهندسة عبر رمز انضمام المونومر الخاص بها. ومع ذلك ، بالنسبة للروابط غير المعروفة أو غير القياسية ، تتوفر أدوات مختلفة لإنشاء ملفات الهندسة. تتضمن بعض الأمثلة eLBOW27 - (منشئ الرباط الإلكتروني ومنضدة عمل التحسين) في Phenix28 ، Lidia - أداة مدمجة في Coot29 ، JLigand / ACEDRG30,31 ، CCP-EM23,24 ، Ligprep32-وحدة من Glide داخل مجموعة Schrodinger. ثم يتم تركيب ملف إحداثيات الرباط في الكثافة ، مسترشدا بكل من خريطة cryoEM التجريبية وخريطة الفرق في Coot. ويتبع ذلك تحسين الفضاء الحقيقي في فينيكس28 أو التحسين المتبادل في Refmac33. مطلوب محطة عمل Linux أو كمبيوتر محمول مزود ببطاقة رسومات جيدة والبرامج المذكورة أعلاه. يتم تضمين معظم هذه البرامج في أجنحة مختلفة. CCP-EM24 و Phenix28 متاحان مجانا للمستخدمين الأكاديميين ويتضمنان مجموعة متنوعة من الأدوات المستخدمة في هذه المقالة ، بما في ذلك Coot و Refmac533،34،35،36 و Servalcat و phenix.real_space_refine وما إلى ذلك. وبالمثل ، توفر Chimera37 و ChimeraX38 تراخيص مجانية للمستخدمين الأكاديميين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. نمذجة فوسفوينول بيروفات (PEP) في enolase من المتفطرة السلية

  1. تحديد كثافة الربيطة في خريطة cryoEM لمركب PEP-enolase
    1. قم بتنزيل أنصاف الخرائط غير الواضحة (emd_30988_additional_1.map و emd_30988_additional_2.map) ل apo-enolase من البيانات الإضافية في EMDB (انظر جدول المواد).
    2. افتح ChimeraX (انظر جدول المواد). افتح أنصاف خرائط apo-enolase بالنقر فوق فتح من شريط الأدوات وتحديد أسماء الملفات. اكتب vop add # 1 # 2 في سطر الأوامر لدمج كل من نصف الخرائط للحصول على خريطة apo-enolase غير الواضحة.
      ملاحظة: تشير #1 و #2 إلى نصف خريطتين لإنزيم آبو-إنولاز، كما هو مذكور في الخطوة 1.1.1.
    3. أعد تسمية الخريطة المدمجة (معرف خريطة ChimeraX: #3) عن طريق كتابة إعادة تسمية #3 Apo-enolase-unsharpened-map. قم بتلوين الخريطة باللون الرمادي من لوحة النموذج. تشير الخريطة إلى أن enolase ثماني في المحلول مع تناظر D4.
    4. كرر الخطوات 1.1.1-1.1.3 باستخدام أنصاف الخرائط التالية emd_30989_additional_1.map (معرف الخريطة: 4) و emd_30989_additional_2.map (معرف الخريطة: 5) للحصول على خريطة PEP-enolase-unsharpened (معرف الخريطة: #6).
    5. من أجل حساب خريطة الاختلاف ، قم أولا بتركيب الخريطتين (خرائط PEP-enolase و apo-enolase غير الواضحة من الخطوة 1.1.3 والخطوة 1.1.4) على بعضهما البعض بالنقر فوق Fit (الخريطة في الخريطة) في لوحة الخريطة (شريط الأدوات) في ChimeraX.
      ملاحظة: لا يتم إجراء التسوية بين الخريطتين. في بعض الحالات ، قد تكون هناك حاجة إلى التطبيع لجعل الخرائط بنفس المقياس.
    6. اطرح خريطة PEP-enolase من خريطة apo-enolase عن طريق كتابة vop sub #6 #3 في سطر الأوامر.
      ملاحظة: # 6 = خريطة PEP-enolase غير واضحة ، # 3 = خريطة Apo-enolase غير واضحة.
    7. قم بتلوين الخريطة المطروحة (معرف الخريطة: 7) باللون الأخضر ، للدلالة على الكثافة الموجبة (وفقا للاتفاقية في علم البلورات بالأشعة السينية)39.
    8. قم بتنزيل إحداثيات المتفطرة السلية أوكتامريك إنولاز (PDB: 7e4x) من بنك بيانات البروتين (PDB) ، وانقر فوق فتح من شريط الأدوات ، وحدد اسم الملف.
    9. أعد تسمية النموذج 7e4x.pdb عن طريق كتابة rename #8 Apo_enolase.pdb في سطر الأوامر. # 8 يدل على Apo_enolase.pdb في ChimeraX.
    10. حدد النموذج من لوحة النموذج. انقر فوق الماوس الأيمن من شريط الأدوات. انقر فوق تحريك الجزيء لوضع النموذج بالقرب من خريطة PEP-enolase ومحاذاة النموذج فيما يتعلق بالخريطة. قم بتركيب هذا النموذج في خريطة PEP-enolase-unsharpened عن طريق كتابة fit # 8 في # 6 في سطر الأوامر. هنا ، الخريطة مرقمة 6 ، والنموذج مرقم 8.
      ملاحظة: في بعض الحالات، قد لا يكون الملاءمة المحلية في ChimeraX كافية لمحاذاة النموذج. في هذه الحالات ، قد يتم تنفيذ خطوة إضافية من التركيب العالمي (DockinMap ، انظر جدول المواد) في Phenix.
    11. احفظ النموذج المجهز عن طريق كتابة حفظ Apo-enolase.pdb # 8 في سطر الأوامر.
  2. نمذجة وصقل PEP في خريطة cryoEM الحادة للعامل B لمجمع PEP-enolase
    1. افتح "coot" (انظر جدول المواد) من المحطة عن طريق كتابة ./Coot &.
    2. عرض "Apo-enolase.pdb" من خلال النقر على ملف > فتح إحداثيات Apo-enolase.pdb. يتم عرض ملف الإحداثيات بواسطة الروابط (اللون بالذرة).
    3. قم بتنزيل خريطة Enolase الحادة المرتبطة ب PEP ، أي emd_30989.map من EMDB. اعرض نفس الشيء بالنقر فوق ملف > فتح الخريطة > emd_30989.map . اضبط الحد على 7.00 σ عن طريق تمرير زر الماوس الأوسط.
    4. ابحث عن الكائنات الثنائية كبيرة الحجم غير المصممة بالنقر فوق التحقق من صحة > النقط غير النموذجية > البحث عن النقط.
    5. حدد موقع كثافة الليجند غير المنمذجة بالقرب من بقايا الموقع النشط ، Ser 42 و Lys-386 و Arg-364 من نموذج enolase.
    6. احصل على ملف نموذج مونومر PEP من مكتبة Coot monomer بالنقر فوق ملف > الحصول على مونومر وإدخال PEP كرمز مكون من 3 أحرف.
    7. انقل جزيء PEP إلى الكثافة باستخدام خيار التدوير / الترجمة - المنطقة / السلسلة / الجزيء في قائمة الشريط الجانبي. استخدم تحسين الفضاء الحقيقي في Coot لتناسب جزيء PEP في الكثافة من خلال النقر على Real Space Refine Zone في قائمة الشريط الجانبي. دمج الليجند المجهز مع Apo-enolase.pdb باستخدام خيار دمج الجزيء في علامة التبويب تحرير . احفظ النموذج باسم PEP-Enolase.pdb.
      ملاحظة: يمكن للمرء أيضا استخدام خيار ligand> Jiggle-Fit Ligand لتناسب الليجند أيضا.
    8. لإضافة روابط إلى بقية المونومرات في ملف الإحداثيات ، انقر فوق حساب أدوات NCS > > روابط NCS. ستظهر نافذة منفصلة باسم Find NCS-Related Ligands. بالنسبة لخيار البروتين مع NCS ، حدد ملف الإحداثيات Apo-enolase.pdb ومعرف السلسلة A كسلسلة NCS الرئيسية.
      1. بالنسبة للجزيء الذي يحتوي على ليجند ، حدد Apo-enolase.pdb كملف إحداثي ومعرف السلسلة و J والبقايا رقم 1 إلى 1. انقر فوق البحث عن وظائف المرشحين. ستظهر نافذة باسم Fitted Ligands مع قائمة بمناصب المرشحين. قم بتقييم التركيب من خلال النقر على الروابط الفردية المرشحة وتحليل الملاءمة بصريا.
        ملاحظة: في Servalcat / Refmac ، يمكن توفير نموذج مونومر فقط ، ويمكن إعطاء التماثل المستخدم في إعادة البناء للحصول على نموذج موسع.
    9. كما لوحظت كثافة إضافية لجزيئات المذيب بالقرب من الرباط. تشير الهياكل البلورية عالية الدقة من enolase من المتجانسات المختلفة إلى وجود اثنين من أيونات Mg2+ 40,41 ، والتي ربما تعمل على استقرار الشحنة السالبة لوسيط التفاعل. قم بتمثيل اثنين من أيونات Mg2+ في كثافة الموقع النشط بالنقر فوق وضع الذرة في المؤشر وتحديد MG من قائمة نوع Pointer Atom.
      ملاحظة: يمكن استخدام هندسة الرابطة والمسافة كدليل لتحديد أيون المعدن. في حالة Mg2+ المرتبط بذرات الأكسجين في بقايا البروتين ، تتراوح مسافة الرابطة بين 2.1 Å -2.4 Å ، مع هندسة ثماني السطوح. ومع ذلك ، في حالة الخرائط منخفضة الدقة ، غالبا ما يكون مجال التنسيق غير مكتمل ، وقد تختلف المسافة أيضا بسبب القيود في الدقة.
    10. كرر الخطوة 1.2.8 لإضافة أيونات Mg2+ في المونومرات المرتبطة بالتماثل.
    11. احفظ النموذج بالنقر فوق ملف > إحداثيات الحفظ > حدد اسم الملف > واكتب Enolase + PEP + Mg.pdb.
    12. افتح واجهة المستخدم الرسومية Phenix (انظر جدول المواد). قم بتشغيل مهمة تحسين مساحة حقيقية باستخدام Enolase + PEP + Mg.pdb و emd_30989.map كنموذج إدخال وخريطة ، على التوالي ، باستخدام المعلمات الافتراضية. تتم هذه الخطوة بشكل متكرر باستخدام Coot لتحقيق ملاءمة وهندسة جيدة لنموذج الخريطة.
      ملاحظة: يتم استخدام خريطة الفرق غير الحادة لإثبات وجود ليجند ، كما هو الحال في الشكل. لأغراض النمذجة ، تم استخدام خريطة العامل B الحادة ويوصى بها. يمكن أيضا استخدام خريطة B-factor الحادة لحساب خريطة الفرق لأغراض العرض التوضيحي بدلا من الخريطة غير الواضحة. ومع ذلك ، إذا كانت الدقة أقل في المنطقة التي يرتبط فيها الربيطة ، فإن العامل B الفردي المستخدم لشحذ الخريطة بأكملها قد لا يكشف بوضوح عن كثافة الرباط.
  3. التصور وتوليد الشكل لليجند النموذجي
    1. افتح نموذج Enolase + PEP + Mg المكرر من مهمة تحسين Phenix النهائية في PyMOL42 (انظر جدول المواد) بالنقر فوق ملف > فتح وتحديد اسم الملف.
    2. قم بتحميل emd-30989.map (خريطة حادة مرتبطة ب PEP) بالنقر فوق ملف > فتح وتحديد اسم الملف.
    3. أعد تسمية الخريطة على أنها PEP-sharpened بالنقر فوق الإجراءات > إعادة التسمية مقابل الكائن emd_30989 وكتابة PEP-sharpened.
      ملاحظة: في معظم الحالات ، على سبيل المثال enolase ، يتم تسوية الخرائط عند فتحها في pymol حيث يتم تحديد خيار تطبيع الخريطة افتراضيا في pymol. نظرا لأن خرائط cryoEM تتمركز في صندوق أكبر ، فإن التطبيع سيشمل كل شيء في الصندوق. وبالتالي ، يمكن إيقاف تشغيل التطبيع قبل الفتح في البيمول.
    4. حدد الروابط بالنقر فوق عرض > تسلسل.
    5. اكتب isomesh mesh_ligands ، PEP-sharpened ، 6.0 ، sele ، carve = 3.0 في سطر الأوامر واضغط على Enter.
    6. قم بتلوين mesh_ligand باللون الأزرق بالنقر فوق المربع الأخير ، C ، بجوار الكائن mesh_ligand.
    7. عرض بقايا الموقع النشط ، Ser-42 ، Asp-241 ، Glu-283 ، Asp-310 ، Arg-364 و Lys-386 التي تتفاعل مع PEP و Mg2+ في تمثيل العصا والكرة ، على التوالي ، وإنزيم enolase في تمثيل الرسوم المتحركة.
    8. تتبع الأشعة عن طريق كتابة ray 3600 ، 3600 لإنشاء صور بجودة النشر وحفظها كملف png بالنقر فوق ملف > حفظ واختيار PEP.png كاسم للملف.

2. نمذجة الروابط في مستقبلات الغلوتامات الأيضية mGlu5

  1. تحديد ونمذجة كثافة الربيطة في خريطة cryoEM للناهض و mGlu المرتبط بالمناهض5
    1. قم بتنزيل الخريطتين النصفيتين مع ملفات الإحداثيات المقابلة لكل من مجمعات mGlu 5 المرتبطة بالناهض (EMD-31536 ، 7fd8.pdb) والمناهض المرتبط (EMD-31537,7fd9.pdb).
    2. افتح ChimeraX
      1. افتح ملف الإحداثيات، 7fd8.pdb بالنقر فوق فتح وتحديد 7fd8.pdb.
      2. اكتب حذف ligand في سطر الأوامر واضغط على Enter.
      3. وبالمثل ، استخدم الأمر delete/B لحذف السلسلة B.
        ملاحظة: يمكن حذف الروابط والسلاسل باستخدام القائمة المنسدلة في الأعلى باستخدام التحديد والإجراءات > الذرات / الروابط > حذفها.
      4. احفظ pdb غير المقيدة عن طريق كتابة ما يلي في سطر الأوامر: حفظ 7fd8_noligand_chainA.pdb # 1. # 1 يدل على معرف النموذج.
      5. كرر الخطوات 2.1.2.1-2.1.2.4 ل 7fd9.pdb.
    3. افتح CCP-EM. قم بإنشاء مشروع جديد باسم mGlu5 وحدد دليل المشروع واسم المستخدم.
      1. افتح Relion من الخيارات الموجودة على اللوحة اليمنى.
        1. انتقل إلى علامة التبويب إنشاء قناع .
        2. قدم إحدى الخرائط النصفية ل EMD-31536 كمدخل.
          ملاحظة: يقبل Relion الخرائط التي تحتوي على .mrc كلاحقة، وتحتوي خرائط EMD على لاحقة .map. يمكن فتح ملفات الخرائط في ChimeraX للفحص وحفظها بتنسيق .mrc.
        3. في صفحة القناع ، قم بتوفير حجم البيكسل 0.89 Å وعتبة التقسيم الأولية 0.007.
        4. قم بتشغيل المهمة باستخدام الاسم المستعار 31536 (أو أي اسم آخر يسهل متابعته).
        5. وبالمثل ، قم بإنشاء قناع لنصف خريطة EMD - 31537.
      2. افتح برنامج Refmac Servalcat من الخيارات الموجودة في اللوحة اليمنى في CCPEM.
        1. أدخل الاسم ك mGlu5_agonist.
        2. قم باستيراد ملف .pdb 7fd8_noligand_chainA كما هو موضح في قسم النموذج 2.1.2.4. قم بتوفير موقع الخريطتين النصفيتين والقناع المقابل الذي تم إنشاؤه في Relion.
        3. حدد الدقة ك 3.8 Å.
        4. انتقل إلى إعدادات التحسين > التماثل الصارم واذكر C2 كتناظر مجموعة نقاط Relion.
        5. ابدأ البرنامج بالضغط على زر البدء في الأعلى.
    4. بمجرد الانتهاء من المهمة ، افتح النتيجة في Coot (الخيار متاح في الجزء العلوي في قسم النتائج). سيعرض هذا diffmap.mtz في Coot افتراضيا ، حيث يشير اللونان الأحمر والأخضر إلى كثافات سالبة وموجبة ، على التوالي.
      1. انتقل إلى مدير العرض > خصائص خريطة الفرق المسماة DELFWT PHDELWT وقم بتغيير مستوى الكنتور إلى 4.0 (القيمة المطلقة).
        ملاحظة: يعتمد اختيار العتبة على الخريطة والدقة.
      2. إخفاء الخريطة المسماة FWT PHWT والجزيء المسمى refined.pdb.
      3. حرك الخريطة باستخدام الماوس لتصور الكثافة الموجبة (الملونة باللون الأخضر) وإحضار النقطة الأكبر إلى المركز.
      4. انتقل إلى ملف > احصل على مونومر ، واكتب QUS ، واضغط على Enter.
      5. انتقل إلى حساب > نمذجة > جزيء Rigid Body Fit وانقر نقرا مزدوجا فوق مونومر QUS لضبط الجزيء ليلائم كثافة Fo-Fc.
      6. استخدم خيار دمج الجزيء في علامة تبويب التحرير لإضافة جزيء QUS إلى ملف الإحداثيات، refined.pdb.
      7. كرر الخطوات 2.1.4.3-2.1.4.6 لتناسب الرباط مع رمز المونومر NAG و CHS في النقطة الأصغر في خارج الخلية وفي الجزء العلوي من المجال عبر الغشاء ، على التوالي.
      8. احفظ الإحداثيات باسم refined_ligands.pdb.
        ملاحظة: دقة مجال الغشاء (TM) أقل ، وبالتالي ، لم تتم مناقشتها هنا.
  2. صقل هيكل mGlu5 المربوط
    1. افتح CCPEM واستنسخ مهمة التحسين السابقة (الخطوة 2.1.3.2) وقم بتشغيلها باستخدام refined_ligands.pdb والخريطة الحادة (emd. 31536.mrc) كإدخال ، باستخدام المعلمات الافتراضية والتماثل C2.
      ملاحظة: إذا لم يتعرف البرنامج على الرباط ، فيجب توفير ملفات CIF. يمكن تنزيل ملفات CIF هذه من PDB أو إنشاؤها باستخدام برامج مختلفة (انظر الخطوة 3.1.1 للحصول على التفاصيل).
  3. التصور وتوليد الشكل في PyMOL
    1. افتح طراز refined_expanded.pdb من أحدث مهمة تحسين Refmac في PyMOL.
    2. انتقل إلى ملف > فتح واستعرض للوصول إلى دليل وظائف Refmac لتحميل ملف diffmap_normalised_fofc.mrc (خريطة الفرق من مهمة Servalcat في الخطوة 2.1.3.2).
      ملاحظة: إذا كانت ملفات ملحق .mrc غير مرئية أثناء التصفح ثم تغيير نوع الملف إلى كافة الملفات واستعراض.
    3. حدد الروابط باستخدام تسلسل > العرض.
    4. انتقل إلى زر الإجراءات وأعد تسمية التحديد باسم الروابط.
    5. اكتب ما يلي في سطر الأوامر واضغط على إدخال: isomesh mesh_ligands ، diffmap_normalised_fofc ، 6.0 ، ligands ، carve = 2.5.
      ملاحظة: يمكن تعديل عرض الشبكة. هنا ، يتم استخدام عرض شبكة 0.2 ، ويتم تعيين ذلك باستخدام الأمر التالي: set mesh_width = 0.2.
    6. انقر بزر الماوس الأيمن فوق أحد المونومر وانتقل إلى سلسلة > اللون لتحديد لون كل مونومر. لون الرباط والشبكة باستخدام المربع الأخير المسمى c في كائنات الليجند و mesh_ligands. يظهر ديمر مستقبلات mGlu5 في تمثيل الرسوم المتحركة ، ويتم تلوين المونومرات باللون البط البري والقمح. تظهر الروابط في العصا ، والشبكة التي تحيط بالروابط ملونة باللون الأخضر.
    7. استخدم خيار الإجراءات > التوجيه / التوسيط / التكبير / التصغير مقابل الكائنات واضبطها يدويا لتصور الشبكة وبوضوح. حدد المخلفات القريبة التي يمكن أن تتفاعل مع الرباط ، على سبيل المثال ، Tyr64 ، Trp100 ل QUS ، وكما هو مطلوب ، اعرض سلسلتها الجانبية أو السلسلة الرئيسية أو كليهما كتمثيل للعصا.
    8. تتبع الأشعة لإنشاء صور عالية الدقة وحفظها كملف png.
      ملاحظة: تتكرر الخطوات المذكورة أعلاه للخريطة المرتبطة بالخصم EMD-31537 وملف الإحداثيات المقابل PDB-7fd9.

3. نمذجة المثبط ، ديوكسي غالاكتو-نوجيريمايسين (DGN) ، وجزيئات المذيبات في خريطة شحذ عالية الدقة من β-galactosidase

  1. تحديد الرباط ، DGN ، باستخدام أنصاف الخرائط من cryoEM
    1. إعداد قاموس ليجند غير معروف للنمذجة [Deoxygalacto-nojirimycin (DGN)]
      ملاحظة: يتم تضمين ملف قاموس ديوكسيغالاكتو-نوجيريميسين في مكتبة مونومر CCP4 ك DGJ (معرف ليجند 3 أحرف). ومع ذلك ، يعتبر هنا ليجند جديد وغير معروف لتوضيح عملية إنشاء ملفات القاموس للروابط غير المعروفة ، يتم استخدام DGN كرمز مكون من 3 أحرف.
      1. افتح الملخص المركب لديوكسي غالاكتو-نوجيريميسين (DGN) في صفحة ويب PubChem وانسخ سلسلة الابتسامات لمركب ديوكسي غالاكتو-نوجيريميسين.
      2. افتح فينيكس > ليكاندز > eLBOW.
      3. حدد سلسلة الابتسامات كمدخل.
      4. حدد طريقة تحسين بناء الليجند المناسبة. هنا ، يتم استخدام التحسين البسيط.
      5. الصق سلسلة الابتسامات الكيميائية في قسم تعريف الرباط.
      6. قم بتوفير المسمى الوظيفي وبادئة ملف الإخراج ومعرف ligand بشكل مناسب واضغط على تشغيل.
        ملاحظة: يحتوي إخراج المهمة على ملف إحداثي DGN.pdb وملف قاموس ملف DGN.cif. يمكن أيضا استخدام Jligand29 لإنشاء ملف cif.
    2. قم بتنزيل ملف إحداثيات β-galactosidase (6tsh.pdb) من PDB وقم بإزالة إحداثيات سلاسل البروتين (B ، C ، D) ، LIGAND ، DGN ، وجزيئات المذيبات الأخرى باستخدام محرر نصوص أو خيار حذف السلسلة / المنطقة في Coot. احفظ ملف الإحداثيات ك apo-betaGal_chainA.pdb.
      ملاحظة: يمكن أيضا استخدام ChimeraX أو Pymol لإزالة جزيء الرباط / المذيب.
    3. قم بتنزيل أنصاف الخرائط (emd_10563_half_map_1.map و emd_10563_half_map_2.map) من البيانات الإضافية لإدخال EMD-10563 من EMDB.
    4. افتح CCPEM واستخدم Relion لإنشاء قناع للخريطة عند عتبة 0.01 (كما هو موضح في الخطوات 2.1.3.1.1-2.1.3.1.4).
    5. قم بتشغيل Servalcat (داخل مجموعة CCPEM كما هو موضح في الخطوة 2) مع نصف الخرائط التي تم الحصول عليها في الخطوة 3.1.3 ونموذج apo في الخطوة 3.1.2 وتناظر D2.
      ملاحظة: يجب محاذاة النموذج إلى إحدى الخرائط النصفية أو الخرائط الكاملة لتحديد كثافة الرباط. يمكن القيام بذلك عن طريق تركيب النموذج في الخريطة باستخدام ChimeraX ثم حفظ الإحداثيات المتعلقة بنصف الخريطة. في هذا المثال ، تحتوي نصف الخرائط والخريطة الأساسية في EMDB على أحجام / شبكات مربعات مختلفة ، ويجب وضع النموذج في نصف الخريطة.
    6. افتح الطائر.
      1. افتح DGN.cif لقاموس ligand كما تم إنشاؤه في الخطوة 3.1.1 باستخدام Phenix eLBOW. يتم ذلك عن طريق الانتقال إلى File > استيراد قاموس CIF وتصفح دليل وظائف eLBOW.
      2. افتح ملفات إحداثيات البروتين والرباط ، apo-betaGal_chainA.pdb من الخطوة 3.1.2 و DGN.pdb من الخطوة 3.1.6 على التوالي.
      3. فتح ملف diffmap.mtz تلقائيا من مهمة Servalcat (الخطوة 3.1.5) وتصور الخريطة المسماة DELFWT PHDELWT في Coot. حدد الخريطة عند عتبة ~ 4 القيمة المطلقة.
        ملاحظة: من المهم التحقق من إحصائيات الخريطة عن طريق كتابة header map.mrc أو استخدام الأدوات في Chimera. يمكن الحصول على جميع المعلومات اللازمة حول حجم البكسل وحجم الصندوق والحد الأدنى والمتوسط والحد الأقصى للكثافة وانحراف rms عن متوسط الكثافة. من الأهمية بمكان التحقق من حجم البكسل وحجم الصندوق لخرائط cryoEM. تمثل الخريطة ثلاثية الأبعاد حجم خريطة البروتين والليجند في شبكة من فوكسل ثلاثي الأبعاد. في كل فوكسل ، يتم تخزين قيمة جهد الإلكترون أو احتمال العثور على الإلكترون في هذا الموقع. عند اختيار عتبة معينة ، يتم تعيين voxels، التي لها كثافة أقل من القيمة المحددة، إلى الصفر. يساعد هذا في تقليل الضوضاء التجريبية في الخريطة وتصور ميزات الخريطة بشكل أفضل43. وبالتالي ، يجب تحديد الخريطة عند عتبة حيث تكون معالم الخريطة مرئية بسهولة ويكون الحد الأدنى من الضوضاء في الخريطة.
      4. انتقل إلى Ligand > العثور على Ligands. في النافذة الجديدة التي تظهر ، حدد ligand وخريطة الاختلاف ونموذج apo-betaGal_chainA.pdb. اترك الخيارات الأخرى في إعداداتها الافتراضية وانقر فوق Find Ligands لبدء البحث.
      5. يتم عرض قائمة بأهم النتائج التي تظهر كثافة الرباط المحتملة مع وضع نسخة في كل كثافة. تحقق يدويا من جميع الزيارات حيث تم وضع الرباط. احتفظ بالنتائج الأكثر احتمالا وقم بإزالة النتائج الغامضة.
        ملاحظة: يشير الاختلاف في كثافة الخريطة عند عتبة عالية بوضوح إلى وجود الربيطة في الموقع النشط.
  2. نمذجة ليجند DGN وجزيئات المذيبات
    1. قم بإجراء تحسين مساحة حقيقية في Coot لتناسب ligand (DGN.pdb) في خريطة كثافة الفرق ، ثم ادمج إحداثيات ligand مع apo-betaGal_chainA.pdb واحفظه ك betaGal_chainA + ligand.pdb.
      ملاحظة: يمكن إزالة الروابط التي تم وضعها في مناطق السلاسل الأخرى ولا يتم دمجها أثناء حفظ ملف الإحداثيات المدمج. يمكن إنشاء الروابط في سلاسل أخرى بواسطة NCS Ligands كما هو موضح في المثال 1 ، الخطوة 1.2.8 ، أو في Refmac / Servalcat باستخدام توسيع التماثل.
    2. قم بتشغيل مهمة Servalcat أخرى على النحو الوارد أعلاه (الخطوة 3.1.5) باستخدام betaGal_chainA + ligand.pdb كنموذج إدخال ونصف الخرائط (من الخطوة 3.1.3) مع تناظر D2.
    3. تشير كثافة الفرق (من مهمة Servalcat في الخطوة 3.2.2) المحيطة بالليجند النموذجي إلى وجود جزيئات المذيب التي تنسق مع جزيء الرباط. يبدو أن الكثافة المركزية القريبة من الربيطة كبيرة جدا بالنسبة لجزيئات الماء.
    4. استنادا إلى البيانات البيوكيميائية والهيكلية السابقة التي تشير إلى وجود Mg2+ في هذا الموضع ، يتم تمثيل أيون Mg2+ هنا بالنقر فوق خيار ذرة المكان وتحديد الذرة على أنها MG.
    5. نمذجة جزيئات الماء في كثافة الفرق في الموقع النشط التي تشير إلى وجود جزيء المذيب بالنقر على ذرة المكان عند المؤشر واختيار الماء.
      ملاحظة: لدى Coot أيضا خيار اختيار جزيئات الماء تلقائيا. هنا ، نظرا لأن التركيز ينصب فقط على الموقع النشط ، تتم إضافة جزيئات الماء يدويا.
    6. دمج إحداثيات Mg2+ والماء مع ملف betaGal + ligand.pdb وحفظه ك betaGal + ligand + solvent_chainA.pdb.
    7. باستخدام betaGal + ligand + solvent_chainA.pdb ، قم بإجراء تحسين Refmac في Servalcat مع تناظر D2.
      ملاحظة: يمكن أن تكون خريطة فرق الإخراج من هذه الوظيفة بمثابة وسيلة للتحقق مما إذا كان الربيطة قد تم نمذجتها بدقة ، حيث يجب أن تظهر خريطة الفرق الحد الأدنى من الكثافة الإيجابية أو السلبية المتبقية.
  3. التصور وتوليد الشكل باستخدام PyMOL
    ملاحظة: توفر الخطوات الموضحة أدناه بعض الأمثلة على عمل الأشكال باستخدام النماذج والخرائط التي يمكن استخدامها لتوضيح وجود الروابط والمذيبات.
    1. افتح refined_expanded.pdb من آخر مهمة Servalcat (الخطوة 3.2.6) باستخدام نموذج الرباط والمذيب.
    2. حدد سلاسل مختلفة بشكل منفصل لتلوينها باللون الأرجواني والأصفر والأخضر والأزرق المخضر، كما هو موضح في المثال 2.
    3. انتقل إلى عرض تسلسل > ، وقم بعمل تحديدات منفصلة لجزيئات الماء والمغنيسيوم و DGN ، وأعد تسمية الكائنات باسم الماء و MG و DGN ، على التوالي.
    4. اعرض MG وجزيئات الماء ككرات عن طريق تحديد الكائنات والنقر بزر الماوس الأيمن وإظهار > الكرة. وبالمثل ، اعرض الربيطة في تمثيل العصا وقم بتلوين الروابط والمذيبات بشكل مناسب. في هذه الحالة، يكون لون الربيطة أصفر بواسطة ذرة غير متجانسة، ولون أيون المغنيسيوم باللون الأرجواني، وتلوين جزيئات الماء باللون الأحمر.
    5. حدد DGN و MG وجزيئات الماء. انقر بزر الماوس الأيمن وحدد الإجراءات > نسخها للكائن وقم بتسميتها كروابط.
    6. افتح diffmap_normalised_fo.mrc من مهمة Servalcat في الخطوة 3.2.6 وأعد تسميته ك ligand_fo.mrc. اكتب الأمر التالي: mesh_ligands_fo isomesh ، ligand_fo ، 3 ، ligands ، carve = 2.
      ملاحظة: يتم تطبيق خيار النحت 2 Å حول الذرات ، واعتمادا على دقة وجودة الخرائط ، يمكن استخدام قيم 3-5. علاوة على ذلك ، عند فتح خرائط cryoEM في PyMOL ، ينصح بضبط normalize_ccp4_maps على إيقاف التشغيل.
    7. استخدم الإجراءات > خيارات التوجيه / التكبير واضبطها يدويا لتصور الروابط والمخلفات المتفاعلة القريبة (حيثما ينطبق ذلك) كما هو موضح في الخطوة 2.3.7.
    8. تتبع Ray هذه المشاهد لحفظ الصور عالية الدقة باستخدام الأمر ray 3600 ، 3600.
    9. احفظ المشهد كملف .png.
      ملاحظة: الخطوات التالية اختيارية وتحدد عملية تصور (1) كثافة الفرق (Fo-Fc) لليجند غير المنمذج ، DGN ، (2) الكثافة (Fo) لليجند النموذجي ، DGN وكذلك كثافة الفرق (Fo-Fc) للمذيبات غير المنمذجة وأخيرا للكثافة (3) الكثافة (Fo) لليجند المنمذج ، DGN وجزيئات المذيب في الموقع النشط.
    10. لإثبات وجود الربيطة و DGN وجزيئات المذيبات المحيطة باستخدام خريطة الفرق ، افتح diffmap_normalised_fofc.mrc من مهمة Servalcat في الخطوة 3.1.5. أعد تسمية ملف الخريطة ك unliganded_fofc.mrc بالنقر فوق الإجراءات > إعادة تسمية بجوار كائن الخريطة. اكتب ما يلي في سطر الأوامر: mesh_ligands_fofc isomesh ، unliganded_fofc ، ligands ، level = 6 ، carve = 2.
    11. لتوضيح كثافة الربيطة المنمذجة ، DGN ، وكثافة المذيب غير المنمذجة المحيطة ، افتح diffmap_normalised_fo.mrc وكذلك diffmap_normalised_fofc.mrc من وظيفة servalcat في الخطوة 3.2.2. إعادة تسمية diffmap_normalised_fo.mrc ك DGN_fo و diffmap_normalised_fofc.mrc ك DGN_unmodelled_solvents_fofc.
    12. حدد MG والماء من Display > Sequence ، وانقر بزر الماوس الأيمن وحدد الإجراءات > نسخها إلى كائن ، وقم بتسميتها كمذيبات.
    13. اكتب ما يلي في سطر الأوامر: mesh_DGN_fo isomesh ، DGN_fo ، DGN ، المستوى = 3 ، النحت = 2 ؛ mesh_solvent_fofc isomesh ، DGN_unmodelled_solvents_fofc ، المذيبات ، المستوى = 6 ، النحت = 2.
      ملاحظة: سيظهر mesh_DGN_fo كثافة الربيطة ، وسيظهر mesh_solvent_fofc كثافة الحذف ل MG والماء.
    14. أخيرا ، لتصور الروابط النموذجية وكذلك جزيئات المذيب المحيطة في الموقع النشط ، افتح diffmap_normalised_fo.mrc من مهمة Servalcat في الخطوة 3.2.6 وأعد تسميتها باسم ligand_fo.mrc.
    15. اكتب ما يلي في سطر الأوامر: mesh_ligand_fo isomesh ، ligand_fo ، التحديد = ligands ، المستوى = 3 ، النحت = 2.
      ملاحظة: هنا ، استخدمنا diffmap_normalised_fo.mrc ، ولكن يمكن استخدام الخريطة النهائية الحادة لإظهار كثافة الروابط والمخلفات المحيطة. من الممارسات الجيدة ذكر نوع الخريطة المستخدمة ، قيم شحذ عامل B في وسيلة إيضاح الشكل.
    16. يمكن ضبط عرض الشبكة وحجم الكرة عن طريق كتابة الأوامر التالية: اضبط mesh_width = 0.2 واضبط sphere_scale = 0.25 لتصغير حجم الكرة.
    17. لون شبكة fo باللون الأزرق وشبكة fofc باللون الأخضر.
    18. استخدم الإجراءات > خيارات التوجيه / التكبير واضبطها يدويا لتصور الروابط والبقايا المتفاعلة القريبة (حيثما ينطبق ذلك) ، كما هو موضح في الخطوة 2.3.7.
    19. تتبع Ray هذه المشاهد لحفظ الصور عالية الدقة باستخدام الأمر ray 3600 ، 3600.
    20. احفظ المشاهد الفردية كملفات .png.

4. تأثير القرار على نمذجة الرباط في β-galactosidase

  1. افتح Terminal وانتقل إلى الدليل الذي يحتوي على خريطتين نصفيتين.
  2. افتح الخريطتين النصفيتين (الخطوة 3.1.3) بتنسيق .map في ChimeraX ، وقم بتصورهما وحفظهما ك emd10563_half1_1_unfil.mrc و emd10563_half2_1_unfil.mrc.
  3. يمكن استخدام القناع الذي تم إنشاؤه في الخطوة 3.1.4 كمدخل.
  4. قم بتشغيل مهمة PostProcessing في Relion باستخدام أنصاف الخرائط والأقنعة من الخطوات 4.2-4.3، باستخدام المعلمات الافتراضية.
  5. كرر الخطوة 4.4، الآن مع تمكين تخطي وزن FSC وتحديد مرشح ترددات منخفضة مخصص يبلغ 3 Å.
  6. كرر الخطوة 4.4 باستخدام مرشح تمرير منخفض مخصص يبلغ 3.5 Å.
  7. افتح الخرائط (postprocess.mrc) من الخطوات 4.4-4.6 ، وقم بالتصفية بدقة مختلفة ، وإحداثيات النموذج ، ملف 6tsh.pdb (المحاذي لأنصاف الخرائط في ChimeraX) من الخطوة 3.1.2 في PyMOL. أعد تسمية الخرائط المختلفة ك 3.0 و 3.5 و 2.3 كما هو محدد في دقاتها.
    ملاحظة: يمكن للمرء تأكيد تصفية الترددات المنخفضة للخرائط من خلال تصورها في ChimeraX أو Coot.
  8. تصور تأثير الدقة على كثافة جزيئات الربيطة والمذيبات عن طريق إنشاء شبكة من 2 Å حول جزيئات الربيطة والمذيبات عند عتبة 6σ كما هو موضح في الخطوة 3.3.6 مع ترشيح الخرائط بدقة مختلفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

المثال 1
يحفز إنزيم enolase من M. tuberculosis الخطوة قبل الأخيرة من تحلل السكر ويحول 2-phosphoglycerate إلى فسفوينول بيروفات (PEP) ، وهو وسيط أساسي للعديد من المسارات الأيضية44,45. تم جمع بيانات CryoEM لعينات enolase المرتبطة ب apo-enolase و PEP بنفس حجم البكسل البالغ 1.07 Å ، وتم إجراء معالجة الصور باستخدام Relion 3.146,47. تم تحديد هياكل apo-enolase و PEP-enolase عند 3.1 Å و 3.2 Å ، على التوالي48. تم إيداع الخرائط والنماذج في EMDB و PDB49,50 (EMD-30988 و EMD-30989 و PDB-7e4x و PDB-7e51). توضح خريطة cryoEM للإنزيم أنه أوكتامير في المحلول (الشكل 1 أ). من أجل تحديد كثافة الرباط في خريطة PEP-enolase ، تم اختيار الخرائط غير الحادة للإنزيم الأبوإنزيم والإنزيم المرتبط ب PEP ، وتم حساب خريطة الفرق في ChimeraX ، عن طريق طرح خريطة PEP-enolase من خريطة apoenzyme. لوحظت كثافة مميزة (خضراء) عند عتبة عالية ، مما يشير إلى وجود الربيطة (الشكل 1 ب). أشارت نمذجة سلسلة البروتين في الخريطة غير الحادة بوضوح إلى أن الكثافة الإضافية موجودة في الموقع النشط للبروتين (الشكل 1C). ثم تم تصميم الرباط ، PEP ، في خريطة شحذ العامل B باستخدام Coot ، وتم تحسين نموذج البروتين + الليجند في الفضاء الحقيقي باستخدام Phenix. تم نمذجة أيونين Mg2+ في الكثافة التي لوحظت بالقرب من الربيطة (الشكل 1D). يتبنى الليجند ، PEP ، اتجاها مشابها كما لوحظ في متجانسات enolase الأخرى ، والعديد من بقايا الموقع النشطة ، مثل Lys-386 ، Arg-364 ، تشكل تفاعلات رابطة هيدروجينية مع ligand PEP. تشكل أيونات Mg2+ روابط تنسيق معدنية مع Asp-241 و Glu-283 و Asp-310 وفوسفات PEP (الشكل 1D).

المثال 2
في حالة عدم وجود بنية بروتين apo متاحة أو إذا خضع البروتين لتغيير توافقي كبير ، فإن حساب خرائط الفرق كما هو موضح أعلاه غير ممكن. في عام 2021 ، قدمت مجموعة Garib Murshudov في مختبر البيولوجيا الجزيئية ، كامبريدج ، Servalcat22 ، الذي ينفذ سير عمل التحسين باستخدام Refmac ويحسب أيضا خريطة فرق Fo-Fc بعد التحسين. تشير كثافة فرق Fo-Fc الإيجابية إلى وجود جزيئات / روابط لم يتم تضمينها في النموذج أثناء الصقل ، وهي في الأساس خريطة محذوفة. ومع ذلك ، يوصى أولا بتقييم ملاءمة النموذج للخريطة بشكل عام ثم تقييم خريطة كثافة الفرق.

لتوضيح استخدام Servalcat / Refmac ، mGlu5 ، وهو مستقبل مقترن ببروتين G ثنائي يرتبط بالناقل العصبي ، تم اختيار L-Glutamate. عند ربط الناهض ، L-quisqualate ، يعيد المجال خارج الخلية التوجيه ، مما يؤدي إلى دوران 7TM ، مما يجعلها أقرب إلى استقرار الحالة المنشطة. وبالتالي ، هناك تغيير توافقي كبير لوحظ بين apo / الخصم مقابل. حالات ناهضة ملزمة51 (الشكل 2 أ والشكل 2 ه). تم الحصول على الخريطتين النصفيتين لكل من المعقدات المرتبطة بالناهض (EMD-31536) والخصم (EMD-31537) من EMDB ، وتظهر خرائط cryoEM دقة متنوعة عبر الجزيء والمجال خارج الخلية الذي تم حله بشكل أفضل. بعد ذلك ، تم استخدام هذه كمدخلات في Servalcat جنبا إلى جنب مع بروتين apo كنموذج لحساب الفرق أو خريطة Fo-Fc لكل مجموعة بيانات. أظهرت هذه الخريطة بوضوح وجود جزيئات ليجند مختلفة (غير بروتينية). كانت الدقة المقدرة بواسطة FSC (ارتباط فورييه شل) للمجمعات المرتبطة بالناهض والخصم 3.8 Å و 4.0 Å ، على التوالي. في حالة mGlu5 المرتبط بالناهض ، أظهرت خريطة فرق Servalcat Fo-Fc وجود كل من الناهض (L-quisqualate) (الشكل 2B) و N-AcetylGlucosamine (NAG) (الشكل 2C) في ECD للمستقبل (بسبب انخفاض دقة TMD ، هنا نركز فقط في ECD والجزء العلوي من TMD). ينظر إلى بقايا البروتين ، بما في ذلك Tyr-64 و Trp-100 و Ser-151 و Thr-175 ، على أنها تتفاعل مع الناهض. تشير الكثافة بالقرب من بقايا Asn-210 إلى وجود N-acetyl glucosamine (الشكل 2C). لوحظت كثافة تتفق مع كوليستيريل هيميسوكسينات ، والتي تمت إضافتها أثناء تنقية mGlu5 ، بالقرب من الجزء العلوي من الحلزون عبر الغشاء 1 (الشكل 2D). نظرا لأن الدقة معتدلة ويمكن وضع الربيطة ، L-quisqualate ، في اتجاهات مختلفة ، فقد تم استخدام البنية السابقة للمجال خارج الخلية مع الربيطة (PDB-6N50) كدليل لنمذجة الرباط. يعمل الارتباط المضاد على استقرار الحالة المفتوحة أو الراحة للمستقبل (الشكل 2E). لوحظت كثافة تتفق مع LY341495 المضاد عند مفصل الفص الأول والفص الثاني من مجال مصيدة ذباب الزهرة في ECD. يتفاعل الخصم مع بقايا مماثلة لتلك الموجودة في الناهض. تفاعل التراص بين Tyr-223 في الفص II مع المضاد يستقر المستقبل في حالة مفتوحة (الشكل 2F). على غرار بنية الناهض ، لوحظ وجود الجليكوزيل أو وجود مجموعة N-acetylglucosamine بالقرب من Asn-210 (الشكل 2G).

المثال 3
يوضح المثال الثالث بروتوكول نمذجة الروابط وجزيئات المذيبات ذات الحجم الشظوي أو الصغيرة الحجم في خرائط CryoEM عالية الدقة. برز اكتشاف الأدوية القائم على الشظايا (FBDD) كطريقة قوية ومبتكرة في تطوير علاجات جديدة قائمة على الهدف في مختلف مجالات الأمراض ، مما يجعلها وسيلة واعدة في مجال البحث والتطوير52,53 للأدوية. يبدأ FBDD بالفحص والاختيار الدقيق لشظايا صغيرة عالية الذوبان ومنخفضة الوزن الجزيئي من الجزيئات التي ترتبط ببروتينات مستهدفة محددة أو جزيئات حيوية ذات أهمية. يكشف تحديد هياكل معقدات شظايا البروتين هذه عن طريقة ربط هذه الشظايا ، والتي تعمل كدليل لتصميم جزيئات شبيهة بالأدوية أكبر وأكثر تعقيدا مع زيادة التقارب والنوعية تجاه البروتينالمستهدف 54. ومع ذلك ، تتطلب هذه الطريقة كثافة ليجند عالية الدقة لتحديد الوضع بدقة ووضع المجموعات الوظيفية لليجند15 بشكل صحيح.

β-galactosidase ، أحد الهياكل الأولى عالية الدقة التي يتم تحديدها من التطورات في تقنية cryoEM ، هو إنزيم متجانس رباعي المدروسة جيدا 450kDa يحفز التحلل المائي للاكتوز إلى الجلوكوز والجالاكتوز55. لعرض استخدام cryoEM في FBDD ، حددت Astex ، المملكة المتحدة ، بنية β-galactosidase مع مثبط بحجم الشظية ، deoxygalacto-nojirimycin (DGN) المرتبط بالموقع النشط (EMDB-10563 ، PDB: 6tsh) 56. تستخدم مجموعة البيانات هذه لتوضيح بروتوكول نمذجة الروابط والمذيبات بشكل لا لبس فيه في الخرائط عالية الدقة. لعرض تأثير الدقة على نمذجة الليجند والتصور ، تمت تصفية الخرائط إلى 3.0 Å و 3.5 Å في خطوة ما بعد المعالجة في Relion. وهذا يسلط الضوء على جودة كثافة الخريطة بدرجات استبانة مختلفة ويؤكد الحاجة إلى دقة أعلى لنمذجة الروابط والمذيبات.

الإنزيم عبارة عن رباعي مع تناظر D2 في محلول (الشكل 3 أ). اقترحت خريطة الفرق (بين الخريطة والنموذج) ، كما تم حسابها بواسطة Servalcat ، وجود DGN والعديد من جزيئات المذيبات في الموقع النشط للإنزيم (الشكل 3B). عند دقة تقديرية تبلغ 2.3 Å ، أظهرت الكثافة ميزات عالية الدقة ، مما ساعد في النمذجة الدقيقة للمثبط في الموقع النشط للبروتين. لوحظت تفاعلات بين DGN و Tyr-503 و His-540 (الشكل 3C). تشير كثافة الفرق أيضا إلى وجود جزيئات المذيبات التي تتفاعل مع DGN وكذلك بقايا البروتين. تم نمذجة Mg2+ والعديد من جزيئات الماء في الكثافة (الشكل 3D). لوحظت روابط التنسيق المعدنية بين Mg2+ و Glu-416 و Glu-461 والعديد من جزيئات الماء (الشكل 3D). شوهد Mg2+ يتفاعل مع DGN عبر جزيء ماء.

عند دقة أقل تبلغ 3.5 Å و 3.0 Å ، تشبه كثافة الرباط نقطة وتفتقر إلى ميزات عالية الدقة ضرورية للنمذجة الدقيقة لليجند (الشكل 4A ، B). كانت كثافة جزيئات الماء شبه معدومة في هذه القرارات. باختصار ، مع زيادة الدقة ، خاصة أعلى من 3.0 Å ، مكنت الكثافة من نمذجة عدد أكبر من جزيئات الماء (الشكل 4C ، D). أصبح الموضع الصحيح لمركز chiral الخاص بالربيطة قابلا للتحقيق عند ~ 2.3 Å (الشكل 4C ، D) نظرا لوجود ميزات مميزة في الخريطة التي وجهت التنسيب بالإضافة إلى نمذجة جزيئات الماء و Mg2+. وبالمقارنة ، ظلت كثافة Mg2+ واضحة عبر نطاق الدقة (الشكل 4A-C).

Figure 1
الشكل 1: تمثيل فسفوينول بيروفات الربيطة في المتفطرة السلية enolase. (أ) يوضح خريطة العامل B الحادة لإنزيم الإينولاز المرتبط ب PEP. تشير الخريطة إلى أن إنولاز محلول، وأن كل مونومر في الخريطة ملون بشكل مختلف. (B) يعرض خريطة cryoEM غير حادة لإنزيم apo-Enolase باللون الرمادي مع خريطة الفرق (بين الخرائط المرتبطة ب PEP وخرائط apo-Enolase غير الواضحة) متراكبة باللون الأخضر ، مما يشير إلى وجود ligand ، PEP. هذه خريطة توضيحية لإظهار وجود الروابط. (C) يعرض ملاءمة نموذج enolase في خريطة cryoEM غير الواضحة ، مع إبراز موضع كثافة الفرق بالنسبة للبروتين. يظهر نموذج البروتين في تمثيل الرسوم المتحركة وملون في Chainbow. يوضح هذا الشكل أن الكثافة الإضافية (الخضراء) موجودة في الموقع النشط لكل مونومر. (D) يظهر الرباط ، PEP ، مغطى بخريطة العامل B الحادة ، باللون الأزرق. بالإضافة إلى ذلك ، لوحظت أيضا كثافة لاثنين من أيونات Mg2+ ، والتي تشكل روابط تنسيق معدنية مع العديد من بقايا الموقع النشط ، بما في ذلك Ser-42 و Asp 241 و Glu-283 و Asp-310 وذرات الرباط. يقوم الرباط بعمل تفاعلات رابطة هيدروجينية مع Lys-386 و Lys-335 و Arg-364. تظهر بقايا البروتين في تمثيل العصا ، وتظهر أيونات Mg2+ في صورة كرات أرجوانية. تم إنشاء الأرقام في اللوحات (A-D) باستخدام Pymol. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تحديد ونمذجة وتصور الروابط المختلفة في مستقبلات mGlu5 . تم الحصول على خرائط حذف Fo-Fc باستخدام Servalcat. (A) يظهر بنية ديمر مستقبلات mGlu5 (PDB-7fd8) في تمثيل الرسوم المتحركة ، مع تلوين كل مونومر باللون البط البري والقمح ، على التوالي ، ومرتبط بناهض L-quisqualate. جميع الروابط التي تم تحديدها في خارج الخلية وعلى الجزء العلوي من المجال عبر الغشاء للمستقبل مغلفة في خريطة حذف Fo-Fc ، ملونة باللون الأخضر ، ومحددة عند 6σ. (B) يسلط الضوء على ملاءمة الناهض ، L-quisqualate المغلفة في خريطة الفرق. يتفاعل L-quisqualate مع العديد من بقايا mGlu5 بما في ذلك Tyr-64 و Trp-100 و Ser-151 و Thr-175 و Gly-280. يتم تمثيل تفاعلات الرابطة H بشرطات حمراء. في (C) ، تظهر كثافة إضافية بالقرب من Asn-210 ، الموجود في المجال خارج الخلية للمستقبل ، وتم نمذجة جزيء N-acetylglucosamine (NAG) بهذه الكثافة. للتوضيح ، لا يرتبط NAG ب Asn في الشكل الحالي. (د) يوضح الفرق في كثافة هيميسوتشينات الكوليسترول (CHS) باللون الأخضر بالقرب من السطح المعرض للدهون للمستقبل. تم تصميم جزيء CHS ، الممثل في العصي ، بهذه الكثافة. (E) يظهر بنية مستقبلات mGlu5 (PDB-7fd9) مرتبطة بالخصم LY341495 في تمثيل الرسوم المتحركة. في (F) ، تشير الكثافة الإضافية في خريطة فرق Fo-Fc الموجودة عند المفصلة بين الفص الأول والفص الثاني من المجال خارج الخلية إلى وجود المضاد. تظهر البقايا الرئيسية (Tyr-64 و Trp-100 و Ser-152 و Ser-173 و Thr-175 و Tyr-223) حول المضاد في تمثيلات العصا ، وتظهر تفاعلات الرابطة الهيدروجينية المحتملة مع المضاد بشرطات حمراء. (G) يوضح الاختلاف في الكثافة التي توحي بوجود جزيء NAG بالقرب من Asn-210 في البنية المرتبطة بالخصم (لاحظ أن NAG غير مرتبط ب Asn من أجل الوضوح). تم إنشاء الأرقام باستخدام Pymol. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تحديد ونمذجة وصقل جزيئات مثبطات ومذيبات صغيرة في الخريطة عالية الدقة ل β-galactosidase (EMD-10563). (A) يوضح نموذج β-galactosidase الذي تم حله إلى 2.3 Å (PDB: 6tsh) في تمثيل الرسوم المتحركة ، حيث يتم تلوين كل مونومر بشكل واضح. يسلط الصندوق الرمادي الضوء على موقع ربط اليجند. (B) يعرض كثافة فرق Fo-Fc (من Servalcat) في شبكة خضراء في الموقع النشط للإنزيم. يشير الاختلاف في الكثافة إلى وجود المانع (DGN) والعديد من جزيئات المذيبات في الموقع النشط. (C) يوضح أنه يسترشد بخريطة Fo-Fc ، يتم نمذجة مثبط deoxygalacto-nojirimycin (DGN) في الموقع النشط. تم تصوير هذا الليجند النموذجي في شكل عصا ومغطى بكثافة Fo (بواسطة Servalcat) ، وهو ملون باللون blue_mesh. لوحظت تفاعلات الرابطة الهيدروجينية بين DGN والعديد من بقايا البروتين ، بما في ذلك Tyr-503 و His-540. تشير كثافة فرق Fo-Fc الإضافية حول الربيطة (الخضراء) إلى جزيئات المذيب. (د) توضح الخريطة العديد من جزيئات المذيب، بما في ذلك الماء والمغنيسيوم2+، الممثلة في شكل كرات حمراء وأرجوانية، على الترتيب، تم تمثيلها في الموقع النشط بعد التأكد من ارتباط كل جزيء مذيب إما بالبروتين (Glu-416 و His-418 و Glu-461) أو بقايا الليجند. يتم تغليف جزيئات الماء و Mg2+ في كثافة Fo (شبكة زرقاء). ينظر إلى Mg2+ على أنه يتفاعل مع الرباط ، DGN عبر جزيء الماء. يتم تحديد خريطة Fo-Fc (الشبكة الخضراء) في الألواح (B ، C) عند 6σ ، في حين أن كثافة Fo - الشبكة الزرقاء في C و D (من صقل Servalcat بعد النمذجة) محددة عند 3σ. تم إنشاء الأرقام في اللوحات (A-D) باستخدام Pymol. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تأثير الدقة على نمذجة الليجند في β-galactosidase. تم استخدام نصف الخرائط من EMD-10563 كمدخلات في خطوة Relion بعد العملية ، وتم تصفية خرائط ما بعد العملية المدمجة إلى الدقة 2.3 Å و 3.0 Å و 3.5 Å مع عوامل B مختلفة. الخريطة الموضحة في جميع اللوحات محددة عند 6σ. من أجل الوضوح ، يتم عرض العمود الفقري للبروتين فقط بدون سلاسل جانبية أو جزيئات ليجند أو مذيب في الألواح A و B و C. (A) يتم ترشيح الخريطة إلى 3.5 Å ، ويظهر الموقع النشط ل β-galactosidase. تظهر نقطة تشبه الرباط ، DGN ، في هذا القرار ، مصحوبة بعدد قليل من النقط الأصغر في المنطقة المجاورة. تثبت نمذجة الرباط في الاتجاه الصحيح أنها صعبة بسبب عدم وجود ميزات مميزة في الخريطة. (B) يتم عرض الخريطة التي تمت تصفيتها إلى دقة 3.0 Å. هنا ، تصبح نقطة ligand أكثر تحديدا قليلا ولكنها لا تزال تفتقر إلى الميزات بشكل عام. كما لوحظ عدد قليل من النقط الصغيرة التي توحي بجزيئات المذيبات. (C) تكشف الخريطة التي تمت تصفيتها بدقة 2.3 Å عن كثافة الرباط ذات السمات المميزة ، ولا سيما الكشف عن شكل كرسي iminosugar. لوحظ وجود عدد كبير من النقط الصغيرة المقابلة لجزيئات الماء عند هذا القرار. يعطي تقدير / شحذ عامل B التلقائي في عملية Relion اللاحقة قيمة -18 Å2 للخرائط التي تمت تصفيتها إلى 3 Å و 3.5 Å ، بينما القيمة هي -52 Å2 للخريطة التي تمت تصفيتها إلى 2.3 Å. يمكن أيضا إجراء شحذ عامل B مختلف لخرائط EM باستخدام Coot ومفيد في بناء النموذج. (د) توضح اللوحة أن الربيطة DGN (تمثيل العصا) ، Mg2+ ، وجزيئات الماء (ككرات) كما تم تصميمها في الموقع النشط والخريطة الحادة عند 2.3 Å ، موضحة بشبكة زرقاء تحيط بهذه الذرات. تم إنشاء الأرقام في اللوحات (A-D) باستخدام Pymol. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

أدت التحسينات في أجهزة وبرامج المجهر إلى زيادة عدد هياكل cryoEM في السنوات الأخيرة. على الرغم من أن أعلى دقة تم تحقيقها في الوقت الحالي في cryoEM أحادي الجسيم هي 1.2 Å57،58،59 ، يتم تحديد غالبية الهياكل حول دقة 3-4 Å. يمكن أن تكون نمذجة الروابط في الخرائط متوسطة إلى منخفضة الدقة صعبة وغالبا ما تكون محفوفة بالغموض. نظرا للاستخدام الواسع النطاق ل cryoEM في كل من الأوساط الأكاديمية وصناعة الأدوية للبحث الانتقالي واكتشاف الأدوية ، فإن ضمان نمذجة الروابط بشكل صحيح وبدون غموض أمر ضروري. وبالتالي ، من الحكمة تحديد قابلية حل ذرات الليجند عن طريق حساب Q-scores60 ، والذي يتوفر الآن في EMDB كمقياس لتقييم جودة الخرائط وملاءمة النموذج وكذلك في Chimera.

في المثال الأول ، تم استخدام ChimeraX لحساب خريطة الفرق في الفضاء الحقيقي بين apo والخرائط المرتبطة بالليجند في إنزيم M. tuberculosis enolase. تشير الكثافة الإضافية عند عتبة عالية إلى وجود الربيطة ، فسفوينول بيروفات ، في الموقع النشط ، و Mg2+ مرتبطة بالليجند. من المهم ملاحظة أنه في هذه الحالة ، تكون الخريطة متوسطة الدقة (3.2 Å) ، ولا يمكن نمذجة جزيئات الماء بثقة (الشكل 1). القيد المرتبط بهذه الطريقة هو أنه لا يمكن تطبيقها إلا عندما لا يؤدي ربط الرباط إلى تغييرات توافقية كبيرة في البروتين. لم يتم إجراء تسوية الخريطة في هذه الحالة حيث تم الحصول على كل من مجموعات البيانات apo و ligand المرتبطة بنفس حجم البكسل ومعالجتها بمعلمات متطابقة في Relion. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أنه عند مقارنة الخرائط التي تم إنشاؤها بواسطة برامج إعادة الإعمار المختلفة ، مثل Relion46,47 و CryoSparc61 ، أو بجودة مختلفة ، يصبح تطبيع الخرائط ضروريا قبل إجراء مقارنات ذات مغزى.

المثال التالي هو mGlu5 ، الذي يخضع لإعادة تنظيم جزيئية كبيرة عند ارتباط ناهض ، كما يتضح من هياكل cryoEM51,62 (الشكل 2). في هذا السيناريو ، ليس من الممكن حساب خريطة فرق بسيطة بين المستقبلات غير المنضمة (apo) والمستقبلات المرتبطة بالرباط بسبب الاختلافات الجوهرية بين الخرائط. هنا ، تم استخدام Servalcat ، الذي يستخدم خرائط نصفية غير واضحة وغير موزونة كمدخلات للتحسين في الفضاء المتبادل ثم يحسب خريطة الفرق بين الخريطة التجريبية والخريطة المشتقة من النموذج. عند عتبة عالية ، يمكن للمرء أن يتصور الاختلافات ويعمل كدليل لتصحيح النموذج وتحسينه. لوحظت العديد من النقط غير النموذجية في المجال خارج الخلية وبالقرب من المجال عبر الغشاء ل mGlu5 واستخدمت كدليل لنمذجة الروابط (الشكل 2).

يوضح المثال الثالث كيف تلعب الدقة (2.3 Å) دورا حاسما في تفسير الخريطة ونمذجة مثبط بحجم الشظية في β-galactosidase. هنا ، كان التحدي هو تحديد ليجند صغير جدا (<200 دا) في خريطة فرق Servalcat وسط الضوضاء المتأصلة في البيانات ونمذجتها بدقة. بالإضافة إلى الدقة العالمية العالية المحددة باستخدام ارتباط صدفة فورييه (FSC) ، كانت الدقة المحلية الخاصة بالليجند عالية أيضا بما يكفي لضمان وضع دقيق للمراكز الشريانية للروابط (الشكل 3). لوحظت كثافة جزيئات المذيب في خريطة الفرق في جميع أنحاء الإنزيم وخاصة المحيطة بالليجند. كما تم توضيح تأثير الدقة على نمذجة الروابط وذرات المذيبات (الشكل 4). من المهم توخي الحذر عند نمذجة جزيئات الماء أو المذيبات لأنه في بعض الأحيان ، قد تشبه الضوضاء عند عتبة منخفضة جزيئات الماء أو المذيبات ، مما يؤدي إلى تفسيرات خاطئة محتملة.

هناك اعتبار مهم آخر وهو أن خرائط cryoEM وحدها قد لا تكون كافية لتحديد أيون معدني بدقة من تلقاء نفسها. غالبا ما تكون الطرق الفيزيائية الحيوية الإضافية مثل البنية الدقيقة لامتصاص الأشعة السينية الممتدة (EXAFS) أو التحليل الطيفي للأشعة السينية المشتتة للطاقة (EDX) ضرورية لتأكيد وجود وهوية أيون المعدن. في كل من إنزيمات enolase و β-galactosidase ، تم تصميم Mg2+ بسبب ثروة المعلومات المتاحة بالفعل عن هذه البروتينات ، مما يؤكد هوية أيون المعدن. أيضا ، قدم تنسيق أيونات المعادن في هذه الحالات ، والذي يتجسد في الهندسة ثماني السطوح الكلاسيكية ومسافات التنسيق شبه المثالية ل Mg2+ ، دليلا جوهريا على هويتها.

بشكل عام ، يجب مراعاة بعض الاعتبارات المهمة أثناء نمذجة الروابط في خرائط cryoEM. بادئ ذي بدء ، من المهم اختيار الخريطة الصحيحة لتحديد الليجند والنمذجة. في جميع الحالات ، ينصح باستخدام خريطة غير واضحة وغير موزونة أو نصف خريطة على خريطة حادة وموزونة لتصور كثافة الرباط ، حيث قد يؤدي الشحذ والترجيح إلى مناطق أقل حدة أو مفرطة في الوضوح (الضوضاء بسبب إنهاء السلسلة) في الخريطة. قد يؤدي ذلك إلى كثافة ليجند دون المستوى الأمثل ، ويمكن استخدام شحذ عامل B مختلف لتقييم الكثافة أثناء بناء النموذج في Coot. على الرغم من وجود خطر في استخدام الخريطة الحادة لتحديد الروابط في خريطة cryoEM ، إلا أن الخريطة غير الحادة قد لا تظهر التفاصيل الكاملة لكثافة الربيطة ولكن يمكن استخدامها لأغراض العرض التوضيحي ، كما هو موضح في الشكل 1B ، C.

يجب التحقق من صحة وضع الرباط النموذجي ، خاصة في الحالات التي تكون فيها البيانات ضعيفة. كما هو موضح هنا ل mGlu5 ، تختلف الدقة المحلية عبر خريطة cryoEM ، ويمكن أن تكون النمذجة غير المتحيزة لليجند صعبة. يمكن استخدام Servalcat كأداة قيمة للكشف عن عدم الدقة المحتملة في نمذجة البروتين والليجند22.

يمكن أن يكون عدم التجانس التركيبي موجودا في مجمع بروتين ليجند حيث قد يكون لدى مجموعة معينة فقط الرباط (إذا كان الربيطة ذات وزن جزيئي منخفض ، فقد لا تزيل خطوة التصنيف عدم التجانس). ومع ذلك ، من المهم إجراء تصنيف3D 63 خطوة بشكل متكرر أثناء معالجة الصور قبل نمذجة ligand والتحقق مما إذا كانت كثافة ligand تتحسن. في حالة وجود نسخ متعددة من البروتين ، يجب توخي الحذر عند تطبيق التماثل عبر الخريطة أثناء توليد النموذج الأولي وصقله ، لأن هذا قد يؤدي إلى متوسط كثافة الرباط في جميع الجزيئات المرتبطة بالتماثل. يجب فرض التماثل فقط بعد فحص الخريطة بدقة للتأكد من وجود كثافة الربيطة في جميع سلاسل البروتين.

اعتمادا على الحالة (بلورة أو محلول) والموقع (مدفون أو سطح) ، يمكن أن تكون الذرات ديناميكية ، وفي تحسين النموذج ، يشار إلى هذا باسم معلمة الإزاحة الذرية (ADP). جنبا إلى جنب مع خريطة الفرق ، التي توفر أدلة مرئية على عدم الدقة المحتملة في النموذج ، يمكن استخدام قيم ADP لتقييم دقة الروابط بعد الصقل64،65،66،67. عادة ، يجب أن يكون لليجند قيم ADP مماثلة للمخلفات المحيطة ، أي إذا كانت مرتبطة بثبات ونمذجة بدقة. ومع ذلك، فإن الروابط الموجودة في محيط أو ذرات الربيطة (مثل الليبيدات) البعيدة عن الجزيئات الكبيرة يمكن أن يكون لها قيم ADP أعلى. بالإضافة إلى تحسين الإحداثيات ، يسمح كل من Refmac33,34 و Phenix بتحسين قيم ADP28,68. في Refmac ، يتم استخدام تقريب Mott-Bethe لحساب عامل تشتت الإلكترون للذرات الفردية أثناء حساب الخريطة. في الإصدار الأخير من فينيكس ، تم إدخال صقل عامل B الفردي ، على غرار علم البلورات ، لحساب اضطراب الذرة. في كثير من الأحيان ، في النماذج المكررة المشتقة من cryoEM ، يتم ملاحظة مجموعة واسعة من قيم ADP (أحيانا تكون القيم قريبة من الصفر) ، وحتى درجة Q المستخدمة في EMDB لتقييم ملاءمة النموذج مع الخريطة تعتمد على الخريطة الأولية المودعة وطبيعة شحذ عامل B60. في بناء نموذج cryoEM ، غالبا ما يتم استخدام خرائط متعددة ، وبالتالي ، يجب ذكر الخرائط المستخدمة في النمذجة والتحسين بوضوح في الطرق ، نظرا لدقة تباين الخواص في العديد من الجزيئات الكبيرة ، قد لا تكون خريطة واحدة كافية لشرح جميع التفاصيل. 

في نمذجة الروابط في الجزيئات الكبيرة ، فإن أحد القيود الرئيسية لخرائط cryoEM (كما هو الحال في علم البلورات) هو أنه إذا كان موقع ربط الليجند منخفض الدقة أو إذا كان الربيطة المرتبطة ديناميكيا ، فقد يكون من الصعب التأكد من التشكل الصحيح. بالإضافة إلى ذلك ، فإن معظم هياكل cryoEM لها دقة أقل من 3 Å ، وتمثيل جزيئات الماء في الخرائط محدود ، مما يجعل من الصعب تقييم دور الترطيب في ربط الليجند أو الدواء (كما هو موضح هنا مع أمثلة enolase و mGluR). يمكن استخدام الطرق الحسابية مع بيانات cryoEM لمعالجة هذه القيود69. على عكس علم البلورات ، يخضع النموذج فقط للتحسين ، وليس الخريطة. في الوقت الحاضر ، الطريقة الوحيدة للإشارة إلى وجود ليجند أو ضمان النمذجة الدقيقة هي عن طريق إنشاء خرائط محذوفة (باستخدام أدوات مثل Servalcat). وبالتالي ، هناك عدد من الأدوات لمساعدة الباحثين على بناء النموذج وتقييمه ، ولكن هناك العديد من المجالات في تحسين النموذج حيث يمكن توقع مناهج أو تعديلات أحدث للنهج الحالية في المستقبل القريب.

في هذه المقالة ، ركزنا على الأساليب الحالية لنمذجة الروابط ، والتي تشمل الفحص اليدوي لكثافة الليجند ، وإنشاء ملف هندسة الليجند ، متبوعا بنمذجة الربيطة في خريطة cryoEM. هذه فترة مثيرة في البيولوجيا الهيكلية واكتشاف الأدوية ، حيث أدت أجهزة الكشف عن الإلكترونات المباشرة ذات معدلات الإطارات الأسرع واستخدام الحصول على البيانات بشكل أسرع70 إلى الحصول على خرائط عالية الدقة (<2.8 Å) للعديد من الجزيئات الكبيرة التي غالبا ما ترتبط بروابط جزيئية صغيرة في وقت قصير نسبيا. إن الإدخال الأخير لأدوات نمذجة الرباط الآلية مثل GEMspot69 في جناح Schrodinger و EMERALD17 في مجموعة Rosetta ، والذي يحاول العثور على الوضع الأكثر احتمالا للربط مع مراعاة بيانات cryoEM التجريبية ، يبشر بتبسيط هذه العملية وأتمتتها. على غرار علم البلورات بالأشعة السينية ، من المتصور أن تحديد أنماط الارتباط للروابط الجزيئية الصغيرة بواسطة cryoEM ، ربما اثنين أو أكثر في يوم واحد ، سيصبح احتمالا واقعيا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

حصلت SJ على منحة الدكتوراه من DAE-TIFR ، وتم الاعتراف بالتمويل. تقر KRV بمنحة DBT B-Life DBT / PR12422 / MED/31/287/2014 ودعم وزارة الطاقة الذرية ، حكومة الهند ، بموجب تحديد المشروع رقم. RTI4006.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CCP4-8.0 Consortium of several institutes https://www.ccp4.ac.uk Free for academic users and includes Coot and list of tools developed for X-ray crystallography
CCP-EM Consortium of several institutes https://www.ccpem.ac.uk/download.php Free for academic users and includes Coot, Relion and many others
Coot  Paul Emsley, LMB, Cambridge https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/ General software for model building but also available with other suites described above
DockinMap (Phenix) Consortium of several institutes https://phenix-online.org/documentation/reference/dock_in_map.html Software inside the Phenix suite for docking model into cryoEM maps
Electron Microscopy Data Bank  Consortium of several institutes https://www.ebi.ac.uk/emdb/ Public Repository for Electron Microscopy maps
Falcon Thermo Fisher Scientific  https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Technical-Notes/Falcon-3EC-Datasheet.pdf Commercial, camera from Thermo Fisher 
Phenix  Consortium of several institutes https://phenix-online.org/download Free for academic users and includes Coot
Protein Data Bank Consortium of several institutes https://rcsb.org Public database of macromolecular structures
Pymol Schrodinger https://pymol.org/2/ Molecular viusalization tool. Educational version is free but comes with limitation. The full version can be obtained with a small fee.
Relion MRC-LMB, Cambridge https://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/Installation.html Software for cryoEM image processing, also available with CCP-EM
Titan Krios Thermo Fisher Scientific  https://www.thermofisher.com/in/en/home/electron-microscopy/products/transmission-electron-microscopes/krios-g4-cryo-tem.html?cid=msd_ls_xbu_xmkt_tem-krios_285811_gl_pso_gaw_tpne1c&
gad_source=1&gclid=CjwKCAiA-P-rBhBEEiwAQEXhHyw5c8MKThmdA
AkZesWC4FYQSwIQRk
ZApkj08MfYG040DtiiuL8
RihoCebEQAvD_BwE		 Commercial, cryoTEM from Thermo Fisher
UCSF Chimera UCSF, USA https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html General purpose software for display, analysis and more
UCSF Chimera X UCSF, USA https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/ General purpose software for display, analysis and more

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Steinbrecher, T., Labahn, A. Towards accurate free energy calculations in ligand protein-binding studies. Curr Med Chem. 17, 767-785 (2010).
  2. Fu, Y., Zhao, J., Chen, Z. Insights into the molecular mechanisms of protein-ligand interactions by molecular docking and molecular dynamics simulation: a case of oligopeptide binding protein. Comput Math Methods Med. 4, 3502514 (2018).
  3. Grinter, S. Z., Zou, X. Challenges, applications, and recent advances of protein-ligand docking in structure-based drug design. Molecules. 19 (7), 10150-10176 (2014).
  4. Henderson, R., Hasnain, S. Cryo-EM': electron cryomicroscopy, cryo electron microscopy or something else. IUCrJ. 10 (5), 519-520 (2023).
  5. Rosenthal, P. B. A potential difference for single-particle cryo-EM. IUCrJ. 6, 988-989 (2019).
  6. Wang, J., Moore, P. B. On the interpretation of electron microscopic maps of biological macromolecules. Prot Sci. 26 (1), 122-129 (2017).
  7. Murshudov, G. N. Refinement of atomic structures against cryo-EM Maps. Meth Enzymol. 579, 277-305 (2016).
  8. Kulik, M., Chodkiewicz, M. L., Dominiak, P. M. Theoretical 3D electron diffraction electrostatic potential maps of proteins modeled with a multipolar pseudoatom data bank. Acta Crystallogr D Struct Biol. 78 (8), 1010-1020 (2022).
  9. Yonekura, K., Kato, K., Ogasawara, M., Tomita, M., Toyoshima, C. Electron crystallography of ultrathin 3D protein crystals: Atomic model with charges. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (11), 3368-3373 (2015).
  10. Mu, X., Gillman, C., Nguyen, C., Gonen, T. An overview of microcrystal electron diffraction (MicroED). Annu Rev Biochem. 90, 431-450 (2021).
  11. Kühlbrandt, W. The resolution revolution. Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).
  12. EMDB (the Electron Microscopy Data Bank. , Available from: www.ebi.ac.uk/emdb/ (2023).
  13. Lawson, C. L., et al. EMDataBank unified data resource for 3DEM. Nucleic Acids Res. 44, 396-403 (2016).
  14. RCSB.org. , Available from: http://www.rcsb.org/stats/growth/growth-em (2024).
  15. Lees, J. A., Dias, J. M., Han, S. Applications of Cryo-EM in small molecule and biologics drug design. Biochem Soc Trans. 49 (6), 2627-2638 (2021).
  16. Robertson, M. J., Meyerowitz, J. G., Skiniotis, G. Drug discovery in the era of cryo-electron microscopy. Trends Biochem Sci. 47 (2), 124-135 (2022).
  17. Muenks, A., Zepeda, S., Zhou, G., Veesler, D., DiMaio, F. Automatic and accurate ligand structure determination guided by cryo-electron microscopy maps. Nat Commun. 14, 1164 (2023).
  18. Oldfield, T. J. X-ligand: An application for the automated addition of flexible ligands into electron density. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 57 (5), 696-705 (2001).
  19. Zwart, P. H., Langer, G. G., Lamzin, V. S. Modelling bound ligands in protein crystal structures. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 60, 2230-2239 (2004).
  20. Terwilliger, T. C., Klei, H., Adams, P. D., Moriarty, N. W., Cohn, J. D. Automated ligand fitting by core-fragment fitting and extension into density. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62 (8), 915-922 (2006).
  21. Casañal, A., Lohkamp, B., Emsley, P. Current developments in Coot for macromolecular model building of Electron Cryo-microscopy and Crystallographic Data. Prot Sci. 29 (4), 1069-1078 (2020).
  22. Yamashita, K., Palmer, C. M., Burnley, T., Murshudov, G. N. Cryo-EM single-particle structure refinement and map calculation using Servalcat. Acta Crystallogr D Struct Biol. 77 (10), 1282-1291 (2021).
  23. Wood, C. Collaborative computational project for electron cryo-microscopy. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 71 (1), 123-126 (2015).
  24. Burnley, T., Palmer, C. M., Winn, M. Recent developments in the CCP-EM software suite. Acta Crystallogr D Struct Biol. 73 (6), 469-477 (2017).
  25. Potterton, E., McNicholas, S., Krissinel, E., Cowtan, K., Noble, M. The CCP4 molecular-graphics project. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 58 (11), 1955-1957 (2002).
  26. Agirre, J. The CCP4 suite: Integrative software for macromolecular crystallography. Acta Crystallogr D Struct Biol. 79 (6), 449-461 (2023).
  27. Moriarty, N. W., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D. Electronic ligand builder and optimization workbench (eLBOW): A tool for ligand coordinate and restraint generation. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 65 (10), 1074-1080 (2009).
  28. Adams, P. D. A comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (2), 213-221 (2010).
  29. Emsley, P., Cowtan, K. Coot: Model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 60 (12), 2126-2132 (2004).
  30. Debreczeni, J. É, Emsley, P. Handling ligands with Coot. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 68 (4), 425-430 (2012).
  31. Long, F., et al. AceDRG: A stereochemical description generator for ligands. Acta Crystallogr D Struct Biol. 73 (2), 112-122 (2017).
  32. Schrödinger. LigPrep. Schrödinger Release 2022-1: Schrödinger, LLC. , Schrödinger, LLC. New York, NY. (2022).
  33. Brown, A. Tools for macromolecular model building and refinement into electron cryo-microscopy reconstructions. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 71 (1), 136-153 (2015).
  34. Murshudov, G. N., Vagin, A. A., Dodson, E. J. Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 53, 240-255 (1997).
  35. Kovalevskiy, O., Nicholls, R. A., Long, F., Carlon, A., Murshudov, G. N. Overview of refinement procedures within REFMAC 5: Utilizing data from different sources. Acta Crystallogr D Struct Biol. 74 (3), 215-227 (2018).
  36. Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 67 (4), 235-242 (2011).
  37. Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera - A visualization system for exploratory research and analysis. J Comput Chem. 25 (13), 1605-1612 (2004).
  38. Pettersen, E. F., et al. UCSF ChimeraX: Structure visualization for researchers, educators, and developers. Prot Sci. 30 (1), 70-82 (2021).
  39. Lamb, A. L., Kappock, T. J., Silvaggi, N. R. You are lost without a map: Navigating the sea of protein structures. Biochim Biophys Acta Proteins Proteom. 1854 (4), 256-268 (2015).
  40. Ehinger, S., Schubert, W. D., Bergmann, S., Hammerschmidt, S., Heinz, D. W. Plasmin(ogen)-binding α-Enolase from streptococcus pneumoniae: Crystal structure and evaluation of plasmin(ogen)-binding sites. J Mol Biol. 343 (4), 997-1005 (2004).
  41. Tjia-Fleck, S., Readnour, B. M., Ayinuola, Y. A., Castellino, F. J. High-Resolution single-particle cryo-EM hydrated structure of streptococcus pyogenes enolase offers insights into its function as a plasminogen receptor. Biochemistry. 62 (3), 735-746 (2023).
  42. DeLano, W. L. The PyMOL molecular graphics system. Schrödinger LLC wwwpymolorg. Version 1. , Available from: http://www.pymol.org (2002).
  43. Pfab, J., Si, D. Automated threshold selection for cryo-EM density maps. ACM-BCB 2019. Proceedings of the 10th ACM International Conference on Bioinformatics, Computational Biology and Health Informatics. , 161-166 (2019).
  44. Rahi, A., et al. Enolase of Mycobacterium tuberculosis is a surface exposed plasminogen binding protein. Biochim Biophys Acta Gen Subj. 1861 (1), 3355-3364 (2017).
  45. Henderson, B., Martin, A. Bacterial virulence in the moonlight: Multitasking bacterial moonlighting proteins are virulence determinants in infectious disease. Infect Immun. 79 (9), 3476-3491 (2011).
  46. Scheres, S. H. W. A bayesian view on cryo-EM structure determination. J Mol Biol. 415 (2), 406-418 (2012).
  47. Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. Elife. 7, 42166 (2018).
  48. Mohammed, A., et al. Structural snapshots of Mycobacterium tuberculosis enolase reveal dual mode of 2PG binding and its implication in enzyme catalysis. IUCrJ. 10 (6), 738-753 (2023).
  49. RCSB Protein Data Bank (RCSB PDB). , Available from: http://www.rcsb.org (2023).
  50. Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Res. 28 (1), 3-21 (2000).
  51. Nasrallah, C. Agonists and allosteric modulators promote signaling from different metabotropic glutamate receptor 5 conformations. Cell Rep. 36 (9), 109648 (2021).
  52. Doak, B. C., Norton, R. S., Scanlon, M. J. The ways and means of fragment-based drug design. Pharmacol Ther. 167, 28-37 (2016).
  53. Baker, M. Fragment-based lead discovery grows up. Nat Rev Drug Discov. 12 (1), 5-7 (2013).
  54. Kirsch, P., Hartman, A. M., Hirsch, A. K. H., Empting, M. Concepts and core principles of fragment-based drug design. Molecules. 24 (3), 4309 (2019).
  55. Bartesaghi, A., et al. 2.2 Å resolution cryo-EM structure of β-galactosidase in complex with a cell-permeant inhibitor. Science. 348 (6239), 1147-1151 (2015).
  56. Saur, M. Fragment-based drug discovery using cryo-EM. Drug Discov Today. 25 (3), 485-490 (2020).
  57. Maki-Yonekura, S., Kawakami, K., Takaba, K., Hamaguchi, T., Yonekura, K. Measurement of charges and chemical bonding in a cryo-EM structure. Commun Chem. 6 (1), 98 (2023).
  58. Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM. Nature. 587 (7832), 157-161 (2020).
  59. Nakane, T. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
  60. Pintilie, G. Measurement of atom resolvability in cryo-EM maps with Q-scores. Nat Methods. 17 (3), 328-334 (2020).
  61. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nat Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  62. Koehl, A. Structural insights into the activation of metabotropic glutamate receptors. Nature. 566 (7742), 79-84 (2019).
  63. Scheres, S. H. W. Classification of structural heterogeneity by maximum-likelihood methods. Meth Enzymol. 482, 295-320 (2010).
  64. Carugo, O. Atomic displacement parameters in structural biology. Amino Acids. 50 (7), 775-786 (2018).
  65. Wlodawer, A., Li, M., Dauter, Z. High-resolution Cryo-EM maps and models: A crystallographer's perspective. Structure. 25 (10), 1589-1597 (2017).
  66. Masmaliyeva, R. C., Babai, K. H., Murshudov, G. N. Local and global analysis of macromolecular atomic displacement parameters. Acta Crystallogr D Struct Biol. 76 (10), 926-937 (2020).
  67. Merritt, E. A. To B or not to B: A question of resolution. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 68 (4), 468-477 (2012).
  68. Afonine, P. V., et al. Real-space refinement in PHENIX for cryo-EM and crystallography. Acta Crystallogr D Struct Biol. 74 (60), 531-544 (2018).
  69. Roberts on, M. J., van Zundert, G. C. P., Borrelli, K., Skiniotis, G. GemSpot: A pipeline for robust modeling of ligands into Cryo-EM maps. Structure. 28 (6), 707-716 (2020).
  70. Weis, F., Hagen, W. J. H. Combining high throughput and high quality for cryo-electron microscopy data collection. Acta Crystallogr D Struct Biol. 76 (8), 724-728 (2020).

Tags

هذا الشهر في JoVE ، العدد 209 ،
نمذجة الروابط في الخرائط المشتقة من المجهر الإلكتروني بالتبريد
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jha, S., Bose, S., Vinothkumar, K.… More

Jha, S., Bose, S., Vinothkumar, K. R. Modeling Ligands into Maps Derived from Electron Cryomicroscopy. J. Vis. Exp. (209), e66310, doi:10.3791/66310 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter