Quantifier l’apport alimentaire chez Caenorhabditis elegans en mesurant la clairance bactérienne

Summary

Ce protocole décrit un test permettant de quantifier le taux d’alimentation de Caenorhabditis elegans basé sur la mesure de l’élimination des bactéries en culture liquide.

Abstract

L’alimentation est un processus biologique essentiel à la croissance, à la reproduction et à la survie d’un organisme. Ce test vise à mesurer l’apport alimentaire de Caenorhabditis elegans (C. elegans), un paramètre important lors de l’étude de la génétique du vieillissement ou du métabolisme. Chez la plupart des espèces, l’alimentation est déterminée en mesurant la différence entre la quantité de nourriture fournie et la quantité restante après un intervalle de temps donné. La méthode présentée ici utilise la même stratégie pour déterminer l’alimentation de C. elegans. Il mesure la quantité de bactéries, la source de nourriture de C. elegans, éliminées en 72 heures. Cette méthode utilise des plaques de microtitration à 96 puits et a permis de cribler des centaines de médicaments pour leur capacité à moduler l’apport alimentaire à une vitesse et une profondeur impossibles dans d’autres modèles animaux. La force de ce test est qu’il permet de mesurer simultanément l’alimentation et la durée de vie et de mesurer directement la disparition de la nourriture et, ainsi, est basé sur les mêmes principes que ceux utilisés pour d’autres organismes, facilitant la comparaison d’une espèce à l’autre.

Introduction

Caenorhabditis elegans a été largement utilisé dans la recherche sur le vieillissement.  Il s’agit d’un modèle puissant pour étudier la génétique sous-jacente à la longévité induite par le métabolisme induite par une restriction alimentaire, une activité mitochondriale réduite ou une signalisation de l’insuline réduite. 1,2,3,4,5,6,7. Cependant, la mesure de l’alimentation dans le contexte de la longévité s’est avérée difficile pour C. elegans en raison de la petite taille de l’animal 3,8,9,10,11,12,13,14,15.

L’alimentation est un comportement biologique fondamental nécessaire à la survie, et sa régulation stricte est au cœur du maintien de la santé métabolique, de la reproduction et du vieillissement. Le comportement alimentaire est contrôlé par de multiples voies de signalisation à la fois dans le système nerveux et à la périphérie et, par conséquent, ne peut être étudié qu’in vivo 16,17,18,19. L’alimentation représente le premier de trois piliers : (i) l’apport énergétique, (ii) le stockage de l’énergie et (iii) la dépense énergétique qui régissent l’homéostasie énergétique d’un organisme. L’alimentation de C. elegans a été principalement étudiée en mesurant le pompage pharyngé, tel que défini par le taux de contractions du pharynx. Cette approche a fourni des informations cruciales sur le comportement alimentaire de C. elegans 3,4,8,12,13,20,21 ; Cependant, le pompage pharyngé, surtout mesuré sur de courts intervalles de minutes, n’est pas nécessairement corrélé à l’apport alimentaire.

L’apport alimentaire n’est pas seulement déterminé par le taux de pompage pharyngé, mais aussi par des paramètres tels que la durée et la fréquence des épisodes d’alimentation et la densité des bactéries alimentaires. Un animal peut avoir un pompage pharyngé très élevé, mais la durée de ses séances d’alimentation peut être plus courte, ce qui compense l’augmentation du taux. Un autre facteur de confusion est l’efficacité avec laquelle le pompage peut ou non ingérer et broyer des bactéries. Un exemple extrême de découplage de l’apport alimentaire du pompage pharyngé est l’ajout de sérotonine sans qu’aucun aliment (bactérie) ne soit présent. En présence de sérotonine exogène, les animaux pompent à un taux élevé, mais sans bactéries présentes, le taux de pompage élevé n’entraîne pas d’apport alimentaire 2,6,13,22,23.

La méthode de clairance bactérienne présentée ici mesure l’apport alimentaire des populations de vers dans les puits individuels comme la diminution des concentrations bactériennes au fil du temps (Figure 1). Cette approche est similaire à celles utilisées chez d’autres espèces où la disparition de la nourriture représente une mesure de l’apport alimentaire 10,11,24,25,26,27,28. Dans la publication originale, nous avons validé cette méthode de mesure de l’ingestion alimentaire en nourrissant C. elegans avec ¹⁵bactéries marquées aux isotopes^{N 11}. Des mesures ultérieures par spectrométrie de masse ont montré que la mesure de la disparition des bactéries était fortement corrélée avec l’apparition d’un marquage isotopique, révélant l’absorption réelle des bactéries dans l’animal¹¹. Ainsi, nous sommes convaincus que le test de clairance bactérienne représente l’apport alimentaire dans la plupart des circonstances. Le but de l’essai n’est pas de remplacer l’essai de pompage pharyngé, mais d’ajouter à la boîte à outils des essais pour étudier l’alimentation et le métabolisme chez C. elegans et leur lien avec le vieillissement et la longévité.

Protocol

Figure 1 : Schéma de l’essai de clairance bactérienne. Schéma graphique des principales sections du protocole (de haut en bas) : préparation des bactéries, synchronisation de la population de vers, ensemencement dans des plaques de 96 puits, stérilisation des vers, ajout de médicaments, mesure dela DO 600 le jour 1 et le jour 4. Une description détaillée de ces étapes spécifiques est indiquée à gauche de chaque représentation. Abréviations : OD = densité optique ; FUdR = fluorodésoxyuridine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. 1. Préparation des bactéries REMARQUE : Cette section décrit en détail la préparation des bactéries alimentaires utilisées dans cet essai. La souche spécifique d’E. coli utilisée dans l’essai est appelée OP50. OP50 est la souche la plus utilisée pour nourrir C. elegans. La souche OP50 utilisée est résistante à la carbénicilline/ampicilline, ce qui empêche la contamination croisée de la culture de vers avec d’autres bactéries9. Préparez l’OP50 4 à 5 jours à l’avance et irradiez aux rayons X un jour avant l’utilisation. S’assurer que tous les matériaux rencontrant OP50 sont stériles29,30. Jour -8 : Mercredi (semaine 1) :Préparez le préinoculum en inoculant 5 mL de LB avec 100 μg/mL d’ampicilline et 0,1 μg/mL d’amphotéricine B, ainsi qu’une seule colonie d’OP50, puis incubez pendant environ 6 h à 37 °C dans un agitateur bactérien. Inoculer tôt pour permettre une croissance suffisante pour que la culture devienne trouble. Une fois que la culture est trouble, diluer la culture de préinoculum d’OP50 à 1:2 000 dans 250 mL de TB contenant 100 μg/mL d’ampicilline. Incuber la culture pendant la nuit dans un agitateur bactérien pendant 17-19 h à 37 °C.REMARQUE : La culture ne doit pas croître plus de 19 h. Jour -7 : Jeudi (semaine 1)Après l’incubation de 17 à 19 h, transvaser la culture liquide OP50 dans un tube de centrifugation stérile et centrifuger pendant 15 min à 3 100 × g dans une centrifugeuse de table à 4 °C. Jetez le surnageant, remettez en suspension la pastille OP50 avec de l’eau stérile et centrifugez-la à nouveau. Répétez ce lavage 2 fois. Après le deuxième lavage, jeter le surnageant, remettre en suspension la pastille OP50 dans de l’eau stérile jusqu’à un volume de 50 mL et la transférer dans un tube conique prépesé de 50 mL. Granulez l’OP50 par centrifugation pendant 20 min à 3 100 × g dans une centrifugeuse de table à 4 °C. Après le troisième lavage, retirez soigneusement tout le surnageant restant, en veillant à ce qu’il ne reste pas d’eau dans le tube. Calculez le poids de la pastille en soustrayant le poids du tube de centrifugation vide du poids du tube de centrifugation avec la pastille.REMARQUE : Le poids des granulés varie généralement de 3 à 3,5 g. Remettez complètement en suspension la pastille OP50 dans le tampon S-complete à une concentration de 100 mg/mL, en veillant à ce qu’il n’y ait pas de grumeaux. S’assurer que la concentration d’OP50 à 100 mg/mL correspond à 2 ×10 10 bactéries/mL. Si la relation entre la densité optique et le nombre de bactéries par mL est connue, déterminer la concentration bactérienne par mL par spectrophotométrie. Si nécessaire, utilisez le tampon S-complete pour ajuster la concentration de la solution d’alimentation OP50 à 2 ×10 10 bactéries/mL. Testez l’OP50 sur une plaque de gélose pour déterminer s’il a été contaminé. Stockez l’OP50 suspendu dans le tampon S-complete à 4 °C. Jour -3 : Lundi (semaine 2)Tuez les bactéries par irradiation aux rayons X pour empêcher la croissance bactérienne pendant le test. 2. Préparation synchrone de la culture de vers REMARQUE : Cette section traite de la préparation d’une population de vers synchrones. Tous les matériaux qui entrent en contact avec les populations de vers sont stériles. Toutes les plaques sont maintenues à 20 °C, sauf indication contraire. Jour -6 : Vendredi (semaine 1), 16h00Transférez les animaux dans une assiette fraîche.Prenez une plaque NGM sur laquelle la majeure partie de la population de vers est constituée de larves L1 affamées.REMARQUE : Une population mixte produira également des résultats. L’utilisation de vers L1 qui ont été affamés pendant une longue période peut affecter le comportement alimentaire des générations actuelles ou futures, car la famine peut laisser des marques épigénétiques pendant au moins trois générations. Lavez les vers avec un maximum de 1 ml d’eau stérile. Aliquote ~300 μL de la population de vers lessivés sur des plaques NGM ensemencées avec de l’OP50 concentré (~300 mg/mL). Laissez les plaques sécher sous un séchoir à plaques ou un bec Bunsen. Incuber les plaques à 20 °C jusqu’à ce qu’une grande partie de la population contienne des adultes gravides (lundi).REMARQUE : Cette période est optimisée pour une population de vers N2 de type sauvage et peut varier d’une souche à l’autre. Les vers présentant des retards de développement doivent être pris en compte et être coupés en morceaux et/ou ensemencés plus tôt afin que toutes les souches testées atteignent l’âge adulte en même temps. Jour -3 : Lundi (semaine 2) 10h00Etablissement d’une population synchronePRUDENCE! L’eau de Javel est corrosive pour la peau et les yeux. Sa manipulation nécessite des gants et des lunettes de sécurité.Ramassez les vers en les lavant de la plaque avec jusqu’à 10 ml d’eau stérile. Transférez cette solution vers/eau dans un tube conique de 15 ml. Laver les vers par gravité sur la paillasse pendant environ 4 min (à l’inverse, laver par centrifugation pendant 2 min dans une centrifugeuse de table à 310 × g. Jeter le surnageant par aspiration à l’aide d’une petite pointe et ajouter jusqu’à 15 ml d’eau stérile. Répétez l’opération 3 fois. Retirer le surnageant et ajouter 5 mL d’une solution d’eau de Javel/NaOH fraîchement préparée (1,8 mL d’eau de Javel domestique, 0,5 mL de NaOH 10 N, 7,7 mL de dH2O). Incuber pendant 5 min à température ambiante ou jusqu’à ce que les vers s’ouvrent. Tourbillonnez doucement toutes les minutes pendant au moins 10 s. Suivre la progression à l’aide du microscope à dissection.REMARQUE : Le temps nécessaire pour ouvrir les vers peut varier d’une souche à l’autre. Laisser les vers dans la solution d’eau de Javel trop longtemps peut entraîner des œufs non viables. Ajouter le tampon M9 pour neutraliser la réaction une fois que tous les adultes se sont ouverts ou dissous (le volume final doit être de 15 ml) et centrifuger pendant 2 minutes à 1 300 × g. Lavez les œufs 3 fois avec 13 ml de tampon M9. Lavez une fois les œufs avec 10 mL de tampon S-complete par centrifugation pendant 2 min à 1 300 × g. Aspirez le surnageant, ajoutez 10 ml de S-complet et transférez la suspension dans un tube conique frais de 15 ml. Faites tourner doucement le tube à température ambiante pendant la nuit sur un nutator ou un appareil similaire. Facultatif : Si des carcasses d’adultes sont présentes après la centrifugation finale dans un tampon S-complet, filtrer la solution de vis sans fin à travers une crépine cellulaire de 40 μm. Jour -2 : Mardi (semaine 2), 13h00Ensemencement des animaux dans des assiettesÀ l’aide d’une lunette de dissection, vérifiez si les vers ont éclos. Déterminer la concentration de vers dans la mémoire tampon S-complète en comptant la population de vers en gouttes de 10 μL à l’aide d’une lunette de dissection ; Comptez 5 à 10 gouttes pour chaque échantillon. Si la concentration de vers dans chaque goutte de 10 μL dépasse 30 vers par goutte, diluez le stock total avec S-complet à une densité de vers plus faible par goutte pour faciliter le comptage. Ensemencer le mélange de vers liquides dans chaque puits d’une plaque de 96 puits à un volume de 120 μL comme suit (concentrations finales) : 60 vers/mL dans du S-complet, 50 μg/mL de carbénicilline, 0,1 μg/mL d’amphotéricine et 6 mg/mL d’OP50 préparés à la section 1.REMARQUE : Le volume total à préparer dépend du nombre de plaques (~12 mL par plaque de 96 puits). Il devrait y avoir 6 à 12 vers dans chaque puits. Alternativement, une cytométrie à grand flux de particules, telle que la COPAS FP d’Union Biometrica, peut être utilisée pour trier précisément 10 vers dans chaque puits (voir la section sur l’effet d’encombrement). Inclure également un mélange liquide sans vers : 50 μg/mL de carbenicilline, 0,1 μg/mL d’amphotéricine et 6 mg/mL d’OP50 préparés à la section 1. Mettez 120 μL du mélange sans vers dans la rangée H de la plaque à 96 puits, qui est utilisée pour déterminer les valeurs d’autolyse, comme mentionné précédemment. Mettez 120 μL par puits du mélange avec des vers dans les rangées A-G.REMARQUE : Assurez-vous que les vers sont maintenus en suspension pendant le pipetage (voir Figure 2A, B). Nous utilisons des plaques transparentes à 96 puits avec un fond plat. Notre disposition de plaque divise la plaque pour produire 4 ou 6 conditions dans lesquelles chaque paire de colonnes sera un traitement médicamenteux ou une souche de vers différente, et la rangée inférieure servira de témoin « sans ver » (Figure 2A, B). Pour éviter la contamination et l’évaporation, scellez la plaque avec un scellant à ruban. Incuber les plaques pendant environ 65 h à 20 °C jusqu’à ce que les animaux deviennent des vers L4. Jour 0 : Jeudi (semaine 2) avant midi.Stérilisation de la population de vers par l’ajout de fluorodésoxyuridine (FUdR).Ajouter 30 μL d’une solution mère de FUdR de 0,6 mM pour stériliser les animaux dans chaque puits. Refermez la plaque à l’aide de scelleuses à ruban adhésif et secouez les plaques pendant 20 min sur un agitateur de plaque de microtitration à 800 tr/min. Remettez les plaques dans l’incubateur à 20 °C.REMARQUE : Au cours de cette étape, la concentration finale d’OP50 est réduite de 6 mg/mL à 5 mg/mL (1 × 109 bactéries/mL), et chaque puits a un volume final de 150 μL. Il est crucial d’ajouter FUdR au stade L4 avant que les animaux n’atteignent l’âge adulte. Jour 1 : Vendredi (semaine 2)Ajoutez des drogues à la culture.À 9 h, confirmez que la plupart des animaux sont gravides et que chaque puits contient plusieurs œufs. Si nécessaire, ajoutez des médicaments à la concentration souhaitée (voir la discussion). Après avoir ajouté le médicament, scellez les plaques avec du ruban adhésif et secouez les plaques pendant 20 min à 800 tr/min sur un agitateur de plaques.REMARQUE : L’agitation garantit que tous les amas bactériens sont dissous sans toucher le scelleur. Les amas bactériens ou le liquide sur le scellant déformeront la lecture de l’OD600 . S’il y a des gouttes de liquide sur le scelleur, faites-le tourner brièvement pendant 10 à 20 s à 310 × g. Agitez à nouveau sur le shaker pendant 5 min et mesurez. Après 20 min d’agitation sur l’agitateur à plaque de microtitration, retirez le couvercle et le joint et mesurez l’OD600 dans un lecteur de plaques ; il s’agit de la mesure du jour 1 OD600 . Scellez et remettez les plaques dans un incubateur à 20 °C.REMARQUE : Étant donné que les bactéries se déposent rapidement, la lecture devrait se produire dans les 10 minutes suivant l’agitation des plaques. Utilisez un microscope inversé pour vérifier la population de vers à la recherche de signes de contamination ou de toxicité si un médicament a été ajouté. Remettez les plaques dans l’incubateur à 20 °C. Jour 4 : Lundi (semaine 3)Prenez la lecture du jour 4 OD600 .Répétez la procédure de lecture à partir du jour 1 (étape 2.5.1.3) pour obtenir la valeur OD600 du jour 4. Avant la mesure OD600, agitez les plaques pendant 20 min à 800 tr/min sur l’agitateur à plaques de microtitration. Sur un microscope inversé, avec idéalement un objectif 2x, comptez la population de vers dans chaque puits et enregistrez-la dans un tableur. Remettez les plaques dans l’incubateur à 20 °C après avoir compté.REMARQUE : Voir un échantillon de notre feuille de pointage fourni dans le matériel supplémentaire. Après la lecture du jour 4 , les mesures de l’apport alimentaire sont terminées. Si nécessaire, conservez ces plaques pour l’analyse de la durée de vie.REMARQUE : Ce protocole est compatible avec Solis et Petrascheck31. 3. Analyse des données sur l’apport alimentaire Figure 2 : Conception et analyse. (A, B) Conceptions de plaques possibles pour les conditions 4 et 6 avec les puits de contrôle « sans vis sans fin » dans la rangée H. Ces puits sont nécessaires pour déterminer le taux d’autolyse. Dans chaque plaque, incluez toujours une population témoin N2 non traitée comme référence. (C) Des données d’échantillon recueillies dans la feuille de calcul fournie avec le nombre de vers (case verte), les deux mesures de DO600 aux jours 1 et 4 (cases orange), les valeurs d’autolyse (boîte bleue) et l’évaluation à l’aide de la formule (2) ((OD600 -autolyse)/X0) dans la boîte rouge. L’exemple spécifique présenté ici utilise la conception de plaque illustrée en (B). Abréviations : OD = densité optique ; X0 = nombre de vers par puits. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. REMARQUE : Cette section décrit comment les données sur l’apport alimentaire de la section 2 du présent protocole sont analysées. Les premières valeurs à calculer sont les valeurs de contrôle de l’autolyse . Les bactéries lysent avec le temps dans un liquide, même en l’absence de vers. Cette valeur d’autolyse peut également être affectée par de nombreux produits chimiques et doit être contrôlée car elle est relativement importante par rapport à l’apport alimentaire d’un ver. Comme décrit à l’étape 2.3.1.4 et illustré dans la présentation des plaques de la figure 2A, B, la rangée H contient la même solution, à l’exclusion des vis sans fin. Dans la configuration de nos plaques illustrée à la figure 2B, il y a 14 puits par condition avec deux puits de contrôle d’autolyse respectifs (rangée H, « pas de vers »). Calculer les valeurs de contrôle de l’autolyse pour les puits de contrôle sans vers dans chaque condition à l’aide de l’équation ( 1). Pour chaque groupe de puits répétés, assurez-vous qu’il y a au moins deux puits de contrôle sans vers, comme mentionné à l’étape 2.3.1.4. Utilisez la moyenne de tous les puits de contrôle sans vers pour la valeur d’autolyse d’un groupe de répétitions.Selfysis = moyenne(OD600 Jour 1 – OD600 Jour 4) (1)REMARQUE : Pour la configuration de la plaque illustrée à la figure 2B, nous calculerions six valeurs d’autolyse , une pour chacun des six groupes, en calculant la moyenne des deux puits de contrôle d’autolyse de la rangée H. Calculer l’apport alimentaire par ver à l’aide de l’équation     (2).REMARQUE : Formule utilisée dans la feuille de calcul (encadré rouge, figure 2C) avec X0 étant le nombre de vers par puits. Une fois que l’apport alimentaire par ver est déterminé pour chaque puits, calculez les moyennes et l’écart-type pour l’ensemble de l’état.REMARQUE : Pour la configuration des plaques illustrée à la figure 2B, 14 puits répétés par condition sont suffisants pour les comparaisons statistiques. Normaliser chaque affection en fonction de sa population témoin N2 non traitée. Indiquez le changement d’alimentation sous forme de changement de pli ou de pourcentage d’alimentation N2.REMARQUE : La normalisation est effectuée parce que les valeurs absolues de OD600/X0 de l’équation (2) peuvent varier d’une expérience menée à des jours différents.

Representative Results

Figure 3 : Données représentatives. (A) Le graphique montre les courbes dose-réponse de la variation du pli de l’apport alimentaire en fonction de la concentration de sérotonine. Toutes les données montrent que l’apport alimentaire de base non stimulé est normalisé à l’alimentation basale en N2. Notez que les animaux daf-16(mu86) mangent plus que le type sauvage N2 lorsqu’aucune sérotonine n’a été ajoutée, mais montrent une gamme émoussée dans leur capacité à contrôler l’alimentation. (B) Le graphique montre un graphique en violon de la variation du pli de l’apport alimentaire des vers traités avec 50 μM de l’antipsychotique Loxapine mais nourris avec des bactéries tuées par les rayons X, les rayons γ ou le paraformaldéhyde (C) Le graphique montre un graphique en violon de la variation du pli de l’apport alimentaire de différents mutants avec leurs génotypes indiqués dans l’axe des x. Ces données suggèrent que les mutants exc-4 et cgr-1 mangent moins tandis que les mutants srp-6 mangent plus. Les astérisques représentent ** p < 0,001, ****p < 0,0001 tels que déterminés par ANOVA et Brown-Forsythe-Welch, corrigés a posteriori pour tenir compte de plusieurs tests d’hypothèses. Les barres d’erreur affichent ±S.E.M. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. La figure 1 met en évidence le flux de travail global de ce protocole. Il illustre l’ensemble du processus, de la fabrication des bactéries à l’acquisition de la lecture dela DO 600 le jour 1 et le jour 4. De plus, l’infographie fait référence aux étapes spécifiques des méthodes utilisées. La figure 2A, B montre deux dispositions de plaques expérimentales possibles, y compris des puits de contrôle « sans vers » dans la rangée H, nécessaires pour calculer les taux d’autolyse décrits dans la section de discussion. D’après l’expérience de notre laboratoire, il est nécessaire que l’une des conditions de contrôle N2 non traitée tienne compte de la variabilité de l’absorption bactérienne de vers observée entre les expériences (voir discussion : Planification [population de référence N2]). La figure 2C est un exemple de tableur utilisé pour analyser les données générées dans ce protocole. Il met en évidence le nombre de vers en vert, l’autolyse en bleu, le jour 1 OD600 et le jour 4 OD600 en orange, et l’apport alimentaire par ver en rouge. De plus, chaque puits fait l’objet d’un suivi pour déterminer la souche, le médicament, la concentration, la date de l’expérience et les autres traitements ajoutés. De plus amples renseignements sur les équations spécifiques utilisées se trouvent à la section 3 du protocole. Dans l’ensemble, ces feuilles de calcul (modèle fourni en tant que documents supplémentaires) permettent une collecte et une analyse efficaces des données de ce protocole. La figure 3A montre des résultats représentatifs pour une courbe dose-réponse de la façon dont la sérotonine module l’alimentation chez les mutants N2 et daf-16 à l’aide de ce protocole. Dans cette expérience, le changement de pli à partir de l’apport alimentaire de base (premier point de la courbe) a été calculé sur cinq doses croissantes de sérotonine. Comme le soulignent ces résultats, la souche N2 est capable de trop manger de manière dose-dépendante. Cependant, pour le mutant daf-16(mu86), bien que l’alimentation de base soit supérieure à celle de N2, le mutant ne peut pas répondre à la sérotonine de la même manière dose-dépendante que la souche N2. Ce protocole nous permet de déterminer le comportement alimentaire entre deux souches où la concentration de sérotonine était le facteur variable pour générer des courbes dose-réponse. La figure 3B montre l’apport alimentaire de vers traités avec l’antipsychotique Loxapine mais nourris avec des bactéries tuées par les rayons X, les rayons γ ou le paraformaldéhyde. Notons que ces expériences n’ont pas été menées en parallèle et que les différences ne sont pas représentatives des différentes méthodes pour tuer les bactéries mais sont dues à la variabilité inter-expérimentale. La figure 3C montre l’apport alimentaire d’une série de souches génétiques, deux souches montrant une diminution et une souche montrant une augmentation du comportement alimentaire par rapport à N2. Cette application du protocole permet de tester un médicament à une concentration unique dans différents contextes génétiques. Il est adapté pour identifier les antécédents génétiques qui montrent une réponse alimentaire différente de celle des témoins N2 de type sauvage lorsqu’ils reçoivent le même médicament. Il peut être associé à notre protocole de durée de vie pour dépister rapidement l’apport alimentaire et la durée de vie dans la même configuration d’assiette31. Matériel supplémentaire : Modèles de tableur illustrés à la figure 2C. Veuillez cliquer ici pour télécharger ces documents.

Discussion

Le protocole présenté mesure la clairance bactérienne comme lecture de l’apport alimentaire de C. elegans dans des plaques de microtitration à 96 puits. Les courbes dose-réponse de la section des résultats représentatifs montrent que le test mesure quantitativement l’apport alimentaire, une notion qui a été confirmée indépendamment à l’aide de bactéries marquées aux isotopes¹¹. À l’aide de ce test, nous avons testé avec succès des médicaments approuvés par la FDA tels que des antipsychotiques avec des effets secondaires métaboliques humains connus et avons montré que ces médicaments augmentaient l’alimentation chez C. elegans^10,26. Le test est utile pour étudier la génétique ou la pharmacologie de l’alimentation et ajoute un nouvel outil pour la recherche sur C. elegans pour étudier le métabolisme. Ce test fournit une méthode peu coûteuse pour étudier l’alimentation d’une manière évolutive et rapide, ce qui n’est pas possible dans la plupart des autres organismes. Nos travaux sur les médicaments approuvés par la FDA montrent que de nombreux effets secondaires observés chez les patients humains sont également observés chez C. elegans, révélant la conservation évolutive 24,26,32.

Le test est limité par la concentration de bactéries qui peut être mesurée dans la plage linéaire de la mesure OD₆₀₀ . Par conséquent, le nombre de vers et la gamme de concentrations bactériennes pouvant être analysées sont limités. Trop de vers affecteront OD₆₀₀ en consommant les bactéries trop rapidement, d’où le fait de « manger » la concentration bactérienne de l’OD₆₀₀ linéaire. D’après notre expérience, la variabilité de la préparation bactérienne est le paramètre critique qui fait varier les résultats d’une expérience à l’autre. Nous avons essayé en vain de congeler de grands lots de bactéries ou d’utiliser des bactéries lyophilisées. Dans ces cas, soit le taux d’autolyse est devenu trop élevé, soit les bactéries étaient d’une qualité qui ralentissait le développement de C. elegans . Cependant, nos tests n’ont pas été exhaustifs, et ce problème pourrait être résolu.

En général, le taux d’autolyse de la bactérie est le plus difficile à contrôler, et il peut entraîner une variabilité considérable. Nous avons constaté que certains médicaments peuvent augmenter le taux d’autolyse à des niveaux que le test ne pouvait pas déterminer de manière fiable l’apport alimentaire. Étant donné que le taux d’autolyse augmente avec le temps dans le test, nous n’avons pas mesuré l’apport alimentaire au-delà du 5e jour de l’âge adulte. À cet âge, les bactéries sont en culture depuis ~10 jours. Pour mesurer l’apport alimentaire au-delà du 5e jour de l’âge adulte, les anciennes bactéries doivent être lavées et remplacées par des bactéries fraîches.

Le test présenté est une extension de notre test de durée de vie basé sur des plaques de microtitration de 96 puits³¹. Cette combinaison permet de mesurer la durée de vie et l’apport alimentaire dans une même population. Bien que le test de clairance bactérienne présenté ici ne permette pas de déterminer l’apport alimentaire sur toute la vie de C. elegans en raison de l’autolyse bactérienne, il fournit des données solides pour les quatre premiers jours de l’âge adulte, période où l’apport alimentaire est le plus élevé. En particulier pour la découverte de médicaments à petites molécules, le contrôle de l’apport alimentaire est essentiel. En résumé, nous prévoyons que le test présenté sera utile à la communauté de C. elegans et élargirons l’ensemble des outils pour étudier le métabolisme ou le contrôler dans le contexte des études sur le vieillissement et la durée de vie.

Planification:

Avant de planifier la mesure de l’apport alimentaire, il faut tenir compte de quelques considérations.

Tuer les bactéries :

Nous tuons les bactéries par irradiation aux rayons X dans un tube conique de 50 mL (900 Gray pendant 4 h réglé à 160,0 kV et 25,0 mA). Nous utilisons le RS2000 de Rad Source pour l’irradiation. Selon l’équipement, le temps spécifique et la dose de rayonnement peuvent varier d’une installation à l’autre. La destruction complète de la bactérie doit être déterminée en plaçant les bactéries après l’irradiation pour détecter les survivants par croissance. Il est essentiel de tuer toutes les bactéries pour empêcher la croissance pendant le test, car cela entraînerait une sous-estimation de l’alimentation, voire des valeurs alimentaires négatives. Il est important de noter que les bactéries doivent être tuées pour que C. elegans puisse encore les manger. D’après notre expérience, il existe trois façons de tuer de grandes quantités de bactéries de manière fiable : (i) l’irradiation par rayons X, (ii) par les rayons γ, et (iii) l’ajout de formaldéhyde^29,30. Les taux d’autolyse entre ces trois méthodes sont comparables, avec un coefficient de variation de 8 % entre les taux d’autolyse pour les expériences présentées à la figure 3B. Les méthodes qui n’ont pas fonctionné de manière fiable entre nos mains étaient l’irradiation UV, les cocktails d’antibiotiques, l’inactivation de la chaleur et l’azoture de sodium. Ces méthodes ne parviennent pas à tuer complètement les bactéries (UV et antibiotiques), ne produisent pas de bactéries que C. elegans ne mange pas (chaleur) ou modifient l’apport alimentaire (azoture de sodium).

Nombre de répétitions :

D’après notre expérience, les changements de pli dans l’alimentation sont généralement faibles par rapport à la variation observée. Ainsi, la mesure des changements dans l’apport alimentaire nécessite plusieurs puits répétés. Les figures 2A et B montrent des plaques de 96 puits conçues pour quatre ou six conditions différentes, avec 21 ou 14 puits de réplication et deux puits de contrôle d’autolyse sans vers. Compte tenu de la grande variabilité et des changements relativement faibles auxquels on peut s’attendre, les changements de 0,5 à 2,5 fois dans l’alimentation ont tendance à être les limites inférieure et supérieure. Nous recommandons 14 à 21 puits répétés pour chaque condition et au moins deux puits de contrôle d’autolyse, décrits ci-dessous. Ces répétitions sont suffisantes pour générer des courbes dose-réponse quantitatives pour les médicaments qui modifient l’alimentation^11,26.

Contrôles d’autolyse :

L’OD₆₀₀ mesure le nombre de particules dans une solution, la plupart du temps indépendamment de la taille des particules. Cependant, les bactéries mortes se lysent, perdant leur nature particulaire. C’est ce qu’on appelle l’autolyse, qui se produit indépendamment en présence de vers et abaisse les mesures de_{DO 600} sans que les vers ne les mangent. L’autolyse se produit pendant le test et doit être mesurée indépendamment dans au moins deux puits par condition. Ces puits reçoivent le même traitement que les autres dans le même état, sauf qu’ils ne contiennent pas de vers. Nous avons constaté que de nombreux médicaments peuvent également modifier le taux d’autolyse. Ainsi, chaque condition a besoin de puits de contrôle d’autolyse indépendants avec leur concentration respective. La figure 2 montre une configuration de plaque pour quatre ou six conditions avec tous les puits de contrôle d’autolyse au bas de la plaque dans la rangée H.

Population de référence N2 :

Nous avons également noté que la quantité absolue de bactéries consommées peut fluctuer d’une expérience à l’autre, très probablement liée à la qualité des bactéries. Malgré tous nos efforts pour les préparer exactement de la même manière à chaque fois, il y a des fluctuations. Par exemple, les bactéries peuvent être récoltées alors qu’elles sont dans un état de division pendant la phase de croissance logarithmique et, par conséquent, être beaucoup plus grandes que les bactéries récoltées dans la phase stationnaire. Par conséquent, ces simples différences de taille bactérienne peuvent entraîner des changements dans le nombre de bactéries consommées et des valeurs OD₆₀₀ différentes, car les mesures OD₆₀₀ ne font pas de distinction entre les tailles. Pour cette raison, nous incluons toujours une population d’animaux témoins N2 non traités qui servent de valeur de référence, fixée à 1 ou 100 %, pour déterminer si les groupes expérimentaux mangent plus ou moins que le témoin N2. Cette pratique permet des comparaisons entre expériences, même si les valeurs OD₆₀₀ varient.

Intervalles de temps :

L’utilisation des valeurs OD₆₀₀ pour mesurer l’apport alimentaire nécessite une baisse mesurable de la concentration bactérienne. Parce que le volume de culture est beaucoup plus grand que celui des vers, ils doivent manger une quantité importante de bactéries pour faire une différence détectable. Pour rester dans la plage linéaire des valeurs OD₆₀₀ , la concentration bactérienne doit rester entre ~1 mg/mL et 10 mg/mL, de sorte qu’une quantité considérable de bactéries doit disparaître pour la détecter. Les vers mangent le plus de la fin de la L4 au jour 4 de l’âge adulte en raison de la production d’œufs. Ainsi, cet intervalle est idéal. Des intervalles plus courts comme 24 h peuvent être mesurés¹¹, mais c’est considérablement plus difficile et nécessite ~40 puits par condition. Une autre option pour mesurer l’apport alimentaire des larves est de doubler le nombre d’animaux par puits. Cependant, le problème avec cette approche est que trop de vers commenceront à affecter les lectures OD₆₀₀ lorsqu’ils grandissent.

Solutions mères pour les médicaments à tester :

Si des médicaments tels que la sérotonine sont testés pour leur capacité à moduler l’alimentation, tenez compte de ce qui suit lors de la préparation des solutions mères. Nous préparons généralement un stock 50x pour les médicaments solubles dans l’eau et ajoutons 3 μL à chaque puits (1:50), mais d’autres concentrations de stock (100x, 300x) fonctionnent également. Cependant, si les médicaments sont dilués dans des solvants autres que l’eau (p. ex., DMSO), la concentration finale ne doit pas dépasser 0,5 %. Les solvants deviennent rapidement nocifs pour C. elegan. Ainsi, les solutions mères de médicaments dissous dans des solvants organiques tels que le DMSO doivent être 300x ou plus.

Score des vers vivants et morts :

La détermination des animaux vivants et morts est basée sur le mouvement du ver. Une lumière forte, en particulier la lumière bleue, est utilisée car elle fait bouger les animaux. De plus, l’évaluation du nombre d’animaux par puits permettra de déterminer s’il y a une surmortalité. La surmortalité peut survenir avec des substances toxiques ou des concentrations élevées (>0,5 %) de plusieurs solvants, y compris le DMSO. En général, il devrait y avoir moins de 1:100 (1 %) d’animaux morts. Les plaques peuvent être agitées pendant 30 s à 800 tr/min sur l’agitateur à plaques de microtitration si la nourriture s’est stabilisée et que la population devient difficile à compter. Ignorez les puits avec des mâles ou plus de 16 vers (voir problèmes).

Problèmes potentiels :

Secousses inadéquates :

Dans un milieu liquide, les bactéries peuvent facilement s’agglutiner et s’installer au fond des puits. D’après notre expérience, une agitation de moins de 20 minutes peut ne pas permettre de briser les amas bactériens et de les remettre en suspension, ce qui entraîne des mesures inexactes de_{DO 600} . Les mesures de l’OD₆₀₀ en présence d’amas bactériens sous-estimeront la concentration bactérienne. Des réglages excessifs de l’agitateur peuvent faire en sorte que le liquide soit collé à l’étanchéité. Une fois que la scelleuse est retirée pour la lecture OD₆₀₀ , le liquide collé à la scelleuse entraînera une lecture OD₆₀₀ plus basse. S’il y a du liquide sur la scelleuse, faites tourner rapidement la plaque à basse vitesse (500-1 000 tr/min) et secouez à nouveau pendant 5 min. De plus, assurez-vous, comme indiqué pour les lectures du jour 1 et du jour 4, de lire dans les 10 minutes suivant l’agitation des plaques pour éviter que les bactéries ne se déposent.

Différentes valeurs absolues de l’apport alimentaire entre les expériences :

Malgré tous nos efforts pour normaliser les préparations bactériennes, elles diffèrent souvent d’une manière qui affecte l’apport alimentaire chez les vers. Par exemple, en raison de leur état de division, les bactéries diffèrent en taille selon qu’elles ont été récoltées dans la phase de croissance logarithmique ou stationnaire, les bactéries logarithmiques étant plus grandes. Étant donné que les mesures de DO₆₀₀ ne font pas de distinction entre les tailles, les différences de taille des bactéries dues à la phase de récolte des bactéries peuvent conduire aux différences apparentes observées dans l’apport alimentaire de base entre les préparations bactériennes. La meilleure façon de comparer les expériences est de toujours inclure une population témoin N2 non traitée et de normaliser les résultats à cette population N2.

Effets d’encombrement :

La concentration bactérienne dans ce protocole est suffisante pour maintenir la DO₆₀₀ dans la plage linéaire pour 2 à 16 vers par puits pendant ~72 h. Selon le médicament d’intérêt, un puits contenant plus de 16 vers peut épuiser la concentration bactérienne avant la deuxième mesure. Nous avons également constaté que les puits avec un seul animal ont tendance à ne pas être fiables. Le facteur de lyse l’emporte sur ce qu’un seul ver mange. Par conséquent, des erreurs mineures dans la détermination du facteur de lyse affectent de manière disproportionnée les puits avec moins de vers.

Nous recommandons d’exclure les puits des analyses statistiques si l’une des conditions ci-dessous est remplie. Il y a des mâles dans le puits (nous n’avons pas de données comparant l’apport alimentaire entre les mâles et les hermaphrodites) ; il y a moins de 2 vers dans le puits ou plus de 16 vers dans le puits ; les vers sont morts à la deuxième lecture ; ou s’il y a de la progéniture dans les puits parce que le FUdR a échoué. Le FUdR est sensible à la chaleur et s’inactive même à des températures aussi basses que 37 °C. Décongelez toujours le FUdR dans de l’eau à température ambiante.

Valeurs négatives de l’apport alimentaire :

Les valeurs d’apport alimentaire sont parfois négatives, ce qui suggère plus de nourriture le jour 4 que le jour 1. Des valeurs d’apport alimentaire négatives peuvent indiquer l’un des facteurs suivants : un taux d’autolyse élevé, peut-être causé par un médicament ajouté agissant sur les bactéries, ou des valeurs d’apport alimentaire négatives, qui peuvent suggérer que le puits est contaminé et que quelque chose d’autre que des vers se développe. Les taux d’autolyse augmentent également à mesure que les bactéries vieillissent ; Par conséquent, nous vous recommandons d’utiliser des bactéries datant de moins d’une semaine. Un médicament qui précipite avec le temps a été ajouté, affectant la valeur OD₆₀₀ . Une agitation insuffisante le jour 1 peut entraîner une lecture inférieure de_{DO 600} en raison de groupes bactériens. Les vers ont subi un stress hypoxique. Cela se produit lorsque le rapport surface/air n’est pas suffisant pour permettre l’échange d’oxygène. Utilisez la plaque spécifique à 96 puits dans les matériaux et ne dépassez pas 150 μL (120 μL + 30 μL de FUdR) par puits. La distance entre la surface du puits et le fond où vivent les vers détermine la concentration en oxygène.

Limitations:

Ce test est limité à la culture liquide. Les comportements alimentaires observés dans les assiettes solides, tels que se déplacer sur et hors des pelouses alimentaires, ne peuvent pas être évalués avec le test.

Materials

Amphotericin B	RPI	A40030-0.1	solvent: EtOH
Ampicillin	Fisher Scientific	BP176025	solvent: water
Bacto Peptone	BD Biosciences	211677	use to make NGM plates
Carbenicillin	Fisher Scientific	46-100-RG	solvent: water
Cell strainer	Fisher Scientific	22363547	40 µm to remove adults
Cholesterol	MP Biomedicals	02101380-CF	5 mg/mL stock
Difco, Agar, Bacteriological	BD Biosciences	214510	use to make NGM plates
Fluorodeoxyuridine	Sigma Aldrich	F0503	to sterilize worms on L4
Luria Broth	RPI	L24045-1000.0	open capsule, mix with 1 L of water, autoclave
M9 Buffer	Laboratory Prepared		Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L:  15 g Na2HPO4*12H2O (FW: 358) 3 g KH2PO4 (FW: 136)  5 g NaCl (FW: 58), 0.25 g MgSO4*7H2O (FW: 246)  autoclave
Microplate Sealer	Fisher Scientific	236707
OP50	Caenorhabditis Genetics Center
Plate 96-well	Falcon	351172
Plate reader	Tecan	30016056	use 600 nm filter lens
Potassium Citrate, 1 M , pH 6	Laboratory Prepared		Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: 268.8 g Potassium citrate tribasic monohydrate (FW: 324) 26.3 g citric acid monohydrate (FW: 210) 900 mL of dH2O pH to 6 using 5 M KOH autoclave
Potassium Phosphate, 1 M , pH 6	Laboratory Prepared		Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: 136 g KH2PO4 (FW: 136) 900 mL dH2O  pH to 6 using 5 M KOH autoclave
S-Basal	Laboratory Prepared		Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: 5.9 g NaCl (FW: 58)  50 mL 1 M potassium phosphate (pH 6) add 900 mL dH2O autoclave, cool to 55 °C
S-Complete	Laboratory Prepared		Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: Add to 1 L of S-basal (cooled to 55 °C or RT)  10 mL of 1 M potassium citrate  pH 6, 10 mL of trace metal solutions  3 mL of 1 M CaCl2 3 mL of 1 M MgSO4
Serotonin hydrochloride	Thermo Scientific	AAB2126309	used at 5 mM
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S7653-5KG	to make buffers and NGM plates
Terrific Broth	Thermo Scientific	J75856-A1	12.5 g in 250 mL of water, autoclave
Titer plate Shaker	Thermo Scientific	88880023	shaken at 800 rpm, depends on shaker
Trace Metals Solution	Laboratory Prepared		Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: 1.86 g Na2EDTA (FW: 372.24) 0.69 g FeSO4*7H2O (FW: 278)  0.20 g MnCl2*4H2O (FW: 198) 0.29 g ZnSO4*7H2O (FW: 287)  0.016 g CuSO4 (FW: 158) autoclave wrap in aluminum foil to keep in the dark