Bakteriyel Klerensi Ölçerek Caenorhabditis elegans'ta Gıda Alımının Ölçülmesi

Summary

Bu protokol, sıvı kültürdeki bakterilerin klirensinin ölçülmesine dayalı olarak Caenorhabditis elegans besleme hızını ölçmek için bir testi tanımlar.

Abstract

Beslenme, bir organizmanın büyümesi, üremesi ve hayatta kalması için gerekli bir biyolojik süreçtir. Bu test, yaşlanma veya metabolizmanın genetiğini incelerken önemli bir parametre olan Caenorhabditis elegans’ın (C. elegans) gıda alımını ölçmeyi amaçlamaktadır. Çoğu türde beslenme, sağlanan besin miktarı ile belirli bir zaman aralığından sonra kalan miktar arasındaki farkın ölçülmesiyle belirlenir. Burada sunulan yöntem, C. elegans’ın beslenmesini belirlemek için aynı stratejiyi kullanır. C. elegans’ın besin kaynağı olan bakteri miktarını 72 saat içinde temizler. Bu yöntem, 96 oyuklu mikrotitre plakaları kullanır ve yüzlerce ilacın, diğer hayvan modellerinde mümkün olmayan bir hız ve derinlikte gıda alımını modüle etme yetenekleri açısından taranmasına izin vermiştir. Bu tahlilin gücü, beslenme ve yaşam süresinin aynı anda ölçülmesine izin vermesi ve gıdanın yok oluşunu doğrudan ölçmesi ve bu nedenle, diğer organizmalar için kullanılan aynı ilkelere dayanması ve türden türe karşılaştırmayı kolaylaştırmasıdır.

Introduction

Caenorhabditis elegans, yaşlanma araştırmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır.  Diyet kısıtlaması, azalmış mitokondriyal aktivite veya azalmış insülin sinyalizasyonunun neden olduğu metabolizma aracılı uzun ömürlülüğün altında yatan genetiği incelemek için güçlü bir model olmuştur. 1,2,3,4,5,6,7. Bununla birlikte, hayvanın küçük boyutu nedeniyle C. elegans için uzun ömürlülük bağlamında beslenmenin ölçülmesinin zor olduğu kanıtlanmıştır ^{3,8,9,10,11,12,13,14,15}.

Beslenme, hayatta kalmak için gerekli olan temel bir biyolojik davranıştır ve sıkı düzenlemesi, metabolik sağlığın, üremenin ve yaşlanmanın sürdürülmesinin merkezinde yer alır. Beslenme davranışı, hem sinir sisteminde hem de çevrede çoklu sinyal yolları tarafından kontrol edilir ve bu nedenle yalnızca in vivo olarak incelenebilir 16,17,18,19. Beslenme, üç sütundan ilkini temsil eder: (i) enerji alımı, (ii) enerji depolama ve (iii) bir organizmanın enerji homeostazını yöneten enerji harcaması. C. elegans’ta beslenme, esas olarak, farenksin kasılma hızı ile tanımlandığı gibi, faringeal pompalamanın ölçülmesiyle araştırılmıştır. Bu yaklaşım, C. elegans’ın beslenme davranışı 3,4,8,12,13,20,21; Bununla birlikte, özellikle kısa dakika aralıklarında ölçülen faringeal pompalama, mutlaka gıda alımı ile ilişkili değildir.

Gıda alımı sadece faringeal pompalama hızı ile değil, aynı zamanda beslenme nöbetlerinin süresi ve sıklığı ve gıda bakterilerinin yoğunluğu gibi parametreler tarafından da belirlenir. Bir hayvan çok yüksek bir faringeal pompalamaya sahip olabilir, ancak beslenme nöbetlerinin uzunluğu daha kısa olabilir ve bu da artan oranı dengeler. Diğer bir kafa karıştırıcı faktör, pompalamanın bakterileri yutabileceği veya yutamayacağı veya öğütemeyeceği verimliliktir. Gıda alımının faringeal pompalamadan ayrılmasının aşırı bir örneği, herhangi bir gıda (bakteri) bulunmadan serotonin ilavesidir. Eksojen serotonin varlığında, hayvanlar yüksek oranda pompalanır, ancak bakteri olmadan, yüksek pompalama hızı gıda alımına yol açmaz 2,6,13,22,23.

Burada sunulan bakteri temizleme yöntemi, zaman içinde bakteri konsantrasyonlarının azalması olarak tek tek kuyucuklardaki solucan popülasyonlarının gıda alımını ölçer (Şekil 1). Bu yaklaşım, gıdanın ortadan kaybolmasının gıda alımının bir ölçüsünü temsil ettiği diğer türlerde kullanılanlara benzer 10,11,24,25,26,27,28. Orijinal yayında, C. elegans’ı ¹⁵N izotop etiketli bakteri¹¹ ile besleyerek gıda alımını ölçmek için bu yöntemi doğruladık. Kütle spektrometresi ile yapılan müteakip ölçümler, bakterilerin yok oluşunun ölçülmesinin, izotop etiketlemesinin oluşumu ile güçlü bir şekilde ilişkili olduğunu ve bakterilerin hayvana gerçek alımını ortaya çıkardığını gösterdi¹¹. Bu nedenle, bakteri temizleme testinin çoğu durumda gıda alımını temsil ettiğinden eminiz. Testin amacı, faringeal pompalama testinin yerini almak değil, C. elegans’ta beslenme ve metabolizmayı ve bunun yaşlanma ve uzun ömür ile nasıl ilişkili olduğunu incelemek için tahlillerin araç kutusuna eklemektir.

Protocol

Şekil 1: Bakteriyel klirens testinin şeması. Protokolün ana bölümlerinin grafiksel taslağı (Yukarıdan aşağıya): Bakterilerin hazırlanması, solucan popülasyonunun senkronize edilmesi, 96 oyuklu plakalarda tohumlama, solucanların sterilize edilmesi, ilaç eklenmesi, 1. ve 4. günlerde OD600’ün ölçülmesi. Bu belirli adımların ayrıntılı bir açıklaması, her tasvirin solunda belirtilmiştir. Kısaltmalar: OD = optik yoğunluk; FUdR = florodeoksiüridin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. 1. Bakteri hazırlama NOT: Bu bölüm, bu tahlilde kullanılan besleme bakterilerinin hazırlanmasını detaylandırır. Testte kullanılan spesifik E. coli suşu OP50 olarak adlandırılır. OP50, C. elegans’ı beslemek için en yaygın kullanılan türdür. Kullanılan OP50 suşu, solucan kültürünün diğer bakterilerle çapraz kontaminasyonunu önleyen Karbenisilin/Ampisilin’e dirençlidir9. OP50’yi 4-5 gün önceden hazırlayın ve kullanımdan bir gün önce röntgen ışınlayın. OP50 ile karşılaşan tüm malzemelerin steril olduğundan emin olun29,30. Gün -8: Çarşamba (1. hafta):5 mL LB’yi 100 μg/mL Ampisilin ve 0.1 μg/mL Amfoterisin B ve tek bir OP50 kolonisi ile aşılayarak preinokülumu hazırlayın ve bir bakteri çalkalayıcıda 37 ° C’de yaklaşık 6 saat inkübe edin. Kültürün bulanıklaşması için yeterli büyümeye izin vermek için erken aşılayın. Kültür bulanıklaştığında, OP50’nin preinokülum kültürünü 100 μg / mL Ampisilin içeren 250 mL TB içinde 1: 2.000 oranında seyreltin. Kültürü gece boyunca bir bakteri çalkalayıcıda 37 ° C’de 17-19 saat inkübe edin.NOT: Kültürün 19 saatten daha uzun süre büyümesine izin verilmemelidir. Gün -7: Perşembe (1. hafta)17-19 saatlik inkübasyondan sonra, OP50 sıvı kültürünü steril bir santrifüj tüpüne aktarın ve 4 ° C’de bir masa üstü santrifüjde 3.100 × g’da 15 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın, OP50 peletini steril suyla yeniden süspanse edin ve yeniden santrifüjleyin. Bu yıkamayı 2 kez tekrarlayın. İkinci yıkamadan sonra, süpernatanı atın, OP50 peletini steril suda 50 mL’lik bir hacme kadar yeniden süspanse edin ve önceden tartılmış 50 mL’lik bir konik tüpe aktarın. OP50’yi 4 °C’de bir masa üstü santrifüjde 3.100 × g’da 20 dakika santrifüjleyerek peletleyin. Üçüncü yıkamadan sonra, kalan tüm süpernatanı dikkatlice çıkarın ve tüpte su kalmadığından emin olun. Boş santrifüj tüpünün ağırlığını pelet ile santrifüjleme tüpünün ağırlığından çıkararak peletin ağırlığını hesaplayın.NOT: Pelet ağırlıkları tipik olarak 3-3,5 g arasında değişir. OP50 peletini S-tam tampon içinde 100 mg / mL’lik bir konsantrasyona iyice yeniden süspanse edin ve topak olmadığından emin olun. 100 mg / mL’deki OP50 konsantrasyonunun 2 × 1010 bakteri / mL’ye karşılık geldiğinden emin olun. Optik yoğunluk ile mL başına bakteri sayısı arasındaki ilişki biliniyorsa, mL başına bakteri konsantrasyonunu spektrofotometrik olarak belirleyin. Gerekirse, OP50 besleme çözeltisinin konsantrasyonunu 2 × 1010 bakteri / mL’ye ayarlamak için S-tam tampon kullanın. Kontamine olup olmadığını belirlemek için OP50’yi bir agar plakası üzerinde test edin. OP50’yi 4 °C’de S-tam tamponda asılı olarak saklayın. Gün -3: Pazartesi (2. hafta)Test sırasında bakteri üremesini önlemek için bakterileri X-ışını ışınlaması yoluyla öldürün. 2. Senkron solucan kültürü hazırlama NOT: Bu bölümde, senkron bir solucan popülasyonunun hazırlanması anlatılmaktadır. Solucan popülasyonları ile temas eden tüm materyaller sterildir. Aksi belirtilmedikçe tüm plakalar 20 °C’de tutulur. Gün -6: Cuma (1. hafta), 16:00Hayvanları taze bir tabağa aktarın.Solucan popülasyonunun çoğunun aç L1 larvalarından oluştuğu bir NGM plakası alın.NOT: Karışık bir popülasyon da sonuç verecektir. Uzun süre aç bırakılan L1 solucanlarının kullanılması, mevcut veya gelecek nesillerdeki beslenme davranışını etkileyebilir, çünkü açlık en az üç nesil boyunca epigenetik izler bırakabilir. Solucanları 1 mL’den fazla steril su ile yıkayın. Yıkanmış solucan popülasyonunun ~ 300 μL’sini konsantre OP50 (~ 300 mg / mL) ile tohumlanmış NGM plakalarına alıkoyun. Plakaların bir plaka kurutucu veya bir Bunsen brülörü altında kurumasına izin verin. Plakaları 20 ° C’de, popülasyonun çoğu gravid yetişkinleri içerene kadar (Pazartesi) kuluçkaya yatırın.NOT: Bu zaman dilimi, vahşi tip bir N2 solucan popülasyonu için optimize edilmiştir ve suştan türe değişebilir. Gelişme gecikmeleri olan solucanlar dikkate alınmalı ve daha erken parçalanmalı ve/veya daha erken tohumlanmalıdır, böylece test edilen tüm suşlar aynı anda yetişkinliğe ulaşacaktır. Gün -3: Pazartesi (2. hafta) 10:00Eşzamanlı bir popülasyon oluşturmaDİKKAT! Çamaşır suyu cilt ve gözler için aşındırıcıdır. Kullanımı eldiven ve koruyucu gözlük gerektirir.Solucanları plakadan 10 mL’ye kadar steril su ile yıkayarak toplayın. Bu solucan / su çözeltisini 15 mL’lik konik bir tüpe aktarın. Solucanları yaklaşık 4 dakika boyunca tezgah üstünde yerçekimi lavabosu ile yıkayın (tersine, 310 × g’da bir masa üstü santrifüjde 2 dakika santrifüjle yıkayın. Süpernatanı küçük bir uç kullanarak aspirasyon yoluyla atın ve 15 mL’ye kadar steril su ekleyin. 3x tekrarlayın. Süpernatanı çıkarın ve 5 mL taze hazırlanmış çamaşır suyu / NaOH çözeltisi (1.8 mL ev tipi çamaşır suyu, 0.5 mL 10 N NaOH, 7.7 mL dH2O) ekleyin. Oda sıcaklığında veya solucanlar açılana kadar 5 dakika inkübe edin. En az 10 saniye boyunca her dakika nazikçe girdap yapın. Diseksiyon mikroskobu altında ilerlemeyi izleyin.NOT: Solucanları kırmak için gereken süre suştan suşa değişebilir. Solucanları çamaşır suyu solüsyonunda çok uzun süre bırakmak, cansız yumurtalara neden olabilir. Tüm yetişkinler açıldığında veya çözündüğünde (son hacim 15 mL olacak) reaksiyonu nötralize etmek için M9 tamponu ekleyin ve 1.300 × g’da 2 dakika santrifüjleyin. Yumurtaları 3 kez 13 mL M9 tamponu ile yıkayın. Yumurtaları 1.300 × g’da 2 dakika santrifüj ederek 10 mL S-tam tampon ile bir kez yıkayın. Süpernatanı aspire edin, 10 mL S-complete ekleyin ve süspansiyonu 15 mL’lik yeni bir konik tüpe aktarın. Tüpü gece boyunca bir nutatör veya benzeri bir cihaz üzerinde oda sıcaklığında yavaşça döndürün. İsteğe bağlı: S-tam tamponda son santrifüjlemeden sonra yetişkin karkaslar mevcutsa, solucan çözeltisini 40 μm’lik bir hücre süzgecinden süzün. Gün -2: Salı (2. hafta), 13:00Hayvanları tabaklara tohumlamakBir diseksiyon kapsamı kullanarak, solucanların yumurtadan çıkıp çıkmadığını kontrol edin. Bir diseksiyon kapsamı kullanarak solucan popülasyonunu 10 μL’lik damlalar halinde sayarak S-tam tamponundaki solucan konsantrasyonunu belirleyin; Her numune için 5-10 damla sayın. Her 10 μL’lik damladaki solucan konsantrasyonu damla başına 30 solucanı aşarsa, saymayı kolaylaştırmak için toplam stoğu S-complete ile damla başına daha düşük bir solucan yoğunluğuna seyreltin. Sıvı solucan karışımını, 120 μL’lik bir hacimde 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna aşağıdaki gibi tohumlayın (nihai konsantrasyonlar): S-tam içinde 60 solucan / mL, 50 μg / mL Karbenisilin, 0.1 μg / mL Amfoterisin ve 6 mg / mL OP50 bölüm 1’de hazırlanan.NOT: Hazırlanacak toplam hacim plaka sayısına bağlıdır (96 oyuklu plaka başına ~ 12 mL). Her oyukta 6-12 solucan bulunmalıdır. Alternatif olarak, Union Biometrica’nın COPAS FP’si gibi büyük bir partikül akış sitometrisi, her bir kuyucuğa 10 solucanı hassas bir şekilde ayırmak için kullanılabilir (Bkz. kalabalık etkisi bölümü). Ayrıca solucan içermeyen bir sıvı karışımı da içerir: 50 μg/mL Karbenisilin, 0.1 μg/mL Amfoterisin ve 6 mg/mL OP50 bölüm 1’de hazırlanır. Daha önce de belirtildiği gibi, kendi kendine değerlerini belirlemek için kullanılan 96 oyuklu plakanın H sırasına 120 μL solucansız karışım koyun. AG sıralarında solucanlar ile karışımın oyuğuna 120 μL koyun.NOT: Pipetleme sırasında solucanların süspansiyon halinde tutulduğundan emin olun (bkz. Şekil 2A, B). Düz tabanlı şeffaf 96 oyuklu plakalar kullanıyoruz. Plaka düzenimiz, her bir sütun çiftinin farklı bir ilaç tedavisi veya solucan suşu olacağı ve alt sıranın “solucan yok” kontrolü olarak hizmet edeceği 4 veya 6 koşul üretmek için plakayı böler (Şekil 2A, B). Kirlenmeyi ve buharlaşmayı önlemek için plakayı bir bant kapatıcı ile kapatın. Plakaları, hayvanlar L4 solucanı haline gelene kadar 20 ° C’de yaklaşık 65 saat kuluçkaya yatırın. 0. Gün: Perşembe (2. hafta) öğleden önce.Florodeoksiüridin (FUdR) ilavesiyle solucan popülasyonunun sterilizasyonu.Her oyuktaki hayvanları sterilize etmek için 30 μL 0.6 mM FUdR stok çözeltisi ekleyin. Bant kapatıcılar kullanarak plakayı yeniden kapatın ve plakaları 800 rpm’de bir mikro titre plaka çalkalayıcı üzerinde 20 dakika sallayın. Plakaları 20 °C inkübatöre geri koyun.NOT: Bu adımda, nihai OP50 konsantrasyonu 6 mg / mL’den 5 mg / mL’ye (1 × 109 bakteri / mL) düşürülür ve her bir kuyucuğun nihai hacmi 150 μL’dir. Hayvanlar yetişkinliğe ulaşmadan önce FUdR’yi L4 aşamasına eklemek çok önemlidir. 1. Gün: Cuma (2. hafta)Kültüre ilaç ekleyin.Sabah 9:00’a kadar, çoğu hayvanın gravid olduğunu ve her oyuğun birkaç yumurta içerdiğini onaylayın. Gerekirse, istenen konsantrasyona herhangi bir ilaç ekleyin (tartışmaya bakın). İlacı ekledikten sonra, plakaları bant kapatıcı ile kapatın ve plakaları bir plaka çalkalayıcı üzerinde 800 rpm’de 20 dakika çalkalayın.NOT: Çalkalama, tüm bakteri kümelerinin sızdırmazlık maddesine dokunmadan çözülmesini sağlar. Sızdırmazlık maddesi üzerindeki hem bakteri kümeleri hem de sıvı OD600 okumasını bozacaktır. Sızdırmazlık maddesinin üzerinde sıvı damlaları varsa, 310 × g’da 10-20 saniye kısaca döndürün. Çalkalayıcı üzerinde tekrar 5 dakika çalkalayın ve ölçün. Mikrotitre plaka çalkalayıcı üzerinde 20 dakika çalkaladıktan sonra, kapağı ve contayı çıkarın ve OD600’ü bir plaka okuyucuda ölçün; bu, Gün 1 OD600 ölçümüdür. Plakaları kapatın ve 20 °C’lik bir inkübatöre geri koyun.NOT: Bakteriler hızlı bir şekilde yerleştiğinden, okuma plakaları salladıktan sonra 10 dakika içinde yapılmalıdır. Bir ilaç eklenmişse, solucan popülasyonunu kontaminasyon veya toksisite belirtileri açısından kontrol etmek için ters çevrilmiş bir mikroskop kullanın. Plakaları 20 °C inkübatöre geri koyun. 4. Gün: Pazartesi (3. hafta)Gün 4 OD600 okumasını alın.Gün 1 OD 2.5.1.3 değerini elde etmek için 4 . günden (600 . adım) itibaren okuma prosedürünü tekrarlayın. OD600 ölçümünden önce, plakaları mikrotitre plaka çalkalayıcı üzerinde 800 rpm’de 20 dakika çalkalayın. Ters çevrilmiş bir mikroskopta, ideal olarak 2x objektifle, her bir oyuktaki solucan popülasyonunu sayın ve bir elektronik tabloya kaydedin. Plakaları saydıktan sonra 20 °C inkübatöre geri koyun.NOT: Ek Materyal’de sağlanan puanlama sayfamızın bir örneğine bakın. 4. Gün okumasından sonra, gıda alımı ölçümleri tamamlanır. Gerekirse, bu plakaları kullanım ömrü analizi için saklayın.NOT: Bu protokol Solis ve Petrascheck31 ile uyumludur. 3. Gıda alım verilerinin analizi Şekil 2: Tasarım ve analiz. (A, B) H satırında “solucansız” kontrol kuyuları ile 4 ve 6 koşulları için olası plaka tasarımları. Bu kuyular kendi kendine analiz oranını belirlemek için gereklidir. Her plakada, referans olarak her zaman bir N2 işlenmemiş kontrol popülasyonu ekleyin. (C) Sağlanan elektronik tabloda solucan sayısı (yeşil kutu), 1. ve 4. günlerdeki iki OD600 ölçümü (turuncu kutular), kendi kendine analiz değerleri (mavi kutu) ve kırmızı kutuda formül (2) ((OD600 -kendi kendine analiz)/X0) kullanılarak yapılan değerlendirme ile toplanan örnek veriler. Burada gösterilen özel örnek, (B)’de gösterilen plaka tasarımını kullanır. Kısaltmalar: OD = optik yoğunluk; X0 = kuyucuk başına solucan sayısı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. NOT: Bu bölüm, bu protokolün 2. bölümündeki gıda alımı verilerinin nasıl analiz edildiğini açıklamaktadır. Hesaplanacak ilk değerler kendi kendine kontrol değerleridir. Bakteriler, solucanların yokluğunda bile zamanla sıvı içinde parçalanır. Bu selflysis değeri de birçok kimyasaldan etkilenebilir ve bir solucanın besin alımına kıyasla nispeten büyük olduğu için kontrol edilmesi gerekir. Adım 2.3.1.4’te açıklandığı ve Şekil 2A, B’deki plaka düzeninde gösterildiği gibi, H satırı solucanlar hariç aynı çözeltiyi içerir. Şekil 2B’de gösterilen plaka kurulumumuzda, iki ilgili kendi kendine kontrol kuyusu ile koşul başına 14 kuyu vardır (satır H, “solucan yok”). Denklem (1) kullanarak her koşulda solucansız kontrol kuyuları için kendi kendine kontrol değerlerini hesaplayın. Her bir çoğaltma kuyusu grubu için, adım 2.3.1.4’te belirtildiği gibi en az iki solucansız kontrol kuyusu olduğundan emin olun. Bir çoğaltma grubu için özanaliz değeri için tüm solucansız kontrol kuyularından gelen ortalamayı kullanın.Selfysis = ortalama(OD600 Gün 1 – OD600 Gün 4) (1)NOT: Şekil 2B’de gösterilen plaka kurulumu için, H satırındaki iki kendi kendine kontrol kuyusunun ortalamasını hesaplayarak, altı grubun her biri için bir tane olmak üzere altı özsellik değerini hesaplayacağız. Denklemi kullanarak solucan başına gıda alımını hesaplayın     (2).NOT: Elektronik tabloda kullanılan formül (kırmızı kutu, Şekil 2C) ve X0 kuyucuk başına solucan sayısıdır. Her kuyucuk için solucan başına gıda alımı belirlendikten sonra, tüm durum için ortalamaları ve standart sapmayı hesaplayın.NOT: Şekil 2B’de gösterilen plaka kurulumu için, istatistiksel karşılaştırmalar için koşul başına 14 çoğaltma kuyusu yeterlidir. Her koşulu ilgili N2 işlenmemiş kontrol popülasyonuna normalleştirin. Beslemedeki değişikliği kat değişikliği veya N2 beslemesinin yüzdesi olarak belirtin.NOT: Denklem (2)’deki OD600/X0’ın mutlak değerleri farklı günlerde yapılan deneyler arasında farklılık gösterebileceğinden normalleştirme yapılır.

Representative Results

Şekil 3: Temsili veriler. (A) Grafik, serotonin konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak gıda alımındaki kıvrım değişiminin doz-yanıt eğrilerini göstermektedir. Tüm veriler, N2 bazal beslenmeye normalize edilmiş uyarılmamış bazal gıda alımını göstermektedir. Daf-16 (mu86) hayvanlarının, serotonin eklenmediğinde vahşi tip N2’den daha fazla yediğini, ancak beslenmeyi kontrol etme yeteneklerinde körelmiş bir aralık gösterdiğini unutmayın. (B) Grafik, 50 μM antipsikotik Loxapine ile tedavi edilen ancak X-ışınları, γ-ışınları veya paraformaldehit tarafından öldürülen bakterilerle beslenen solucanların gıda alımındaki kıvrım değişiminin bir keman grafiğini göstermektedir (C) Grafik, x ekseninde belirtilen genotipleri ile farklı mutantların gıda alımındaki kıvrım değişiminin bir keman grafiğini göstermektedir. Bu veriler, exc-4 ve cgr-1 mutantlarının daha az yediğini, srp-6 mutantlarının ise daha fazla yediğini göstermektedir. Yıldız işaretleri, ANOVA ve Brown-Forsythe-Welch tarafından belirlendiği üzere ** p < 0.001, ****p < 0.0001'i temsil eder, çoklu hipotez testini hesaba katmak için post-hoc düzeltilmiştir. Hata Çubukları ±S.E.M. gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 1, bu protokolün genel iş akışını vurgulamaktadır. Bakterilerin yapımından 1. ve 4. günlerde OD600 okumasının elde edilmesine kadar tüm süreci göstermektedir. Ek olarak, infografik, kullanılan yöntemlerin belirli adımlarına atıfta bulunur. Şekil 2A, B, tartışma bölümünde açıklanan kendi kendine analiz oranlarını hesaplamak için gerekli olan H sırasındaki “solucansız” kontrol kuyuları da dahil olmak üzere iki olası deneysel plaka düzenini göstermektedir. Laboratuvarımızın deneyimlerine göre, deneyler arasında gözlemlenen solucanların bakteri alımının değişkenliğini hesaba katmak için tedavi edilmemiş N2 kontrolünün koşullarından biri için gereklidir (tartışmaya bakınız: Planlama [N2 referans popülasyonu]). Şekil 2C, bu protokolde oluşturulan verileri analiz etmek için kullanılan elektronik tablonun bir örneğidir. Yeşil renkte solucan sayısını, mavi renkte bencillik , turuncu renkte 1. gün OD600 ve 4. gün OD600’ü ve kırmızı renkte solucan başına gıda alımını vurgular. Ek olarak, her kuyucuk suş, ilaç, konsantrasyon, deney tarihi ve eklenen diğer tedaviler için izlenir. Kullanılan spesifik denklemler hakkında daha fazla bilgi protokol bölüm 3’te bulunabilir. Genel olarak, bu elektronik tablolar (Ek Materyaller olarak sağlanan şablon), bu protokolün verimli bir şekilde veri toplanmasını ve analiz edilmesini sağlar. Şekil 3A , bu protokolü kullanarak serotoninin N2 ve daf-16 mutantlarında beslenmeyi nasıl modüle ettiğine dair bir doz-yanıt eğrisi için temsili sonuçları göstermektedir. Bu deneyde, bazal gıda alımından (eğrideki ilk nokta) kat değişimi, artan beş serotonin dozu boyunca hesaplandı. Bu sonuçların vurguladığı gibi, N2 suşu doza bağlı bir şekilde aşırı yemek yiyebilir. Bununla birlikte, daf-16 (mu86) mutantı için, bazal besleme N2’den daha yüksek olmasına rağmen, mutant, N2 suşu ile aynı doza bağlı şekilde serotonine yanıt veremez. Bu protokol, doz-yanıt eğrileri oluşturmak için serotonin konsantrasyonunun değişken faktör olduğu iki suş arasındaki beslenme davranışını belirlememizi sağlar. Şekil 3B , antipsikotik Loxapine ile tedavi edilen ancak X-ışınları, γ-ışınları veya paraformaldehit tarafından öldürülen bakterilerle beslenen solucanların gıda alımını göstermektedir. Bu deneylerin paralel olarak yürütülmediğini ve farklılıkların bakterileri öldürmek için farklı yöntemleri temsil etmediğini, ancak deneyler arası değişkenlikten kaynaklandığını unutmayın. Şekil 3C , bir dizi genetik suşun gıda alımını göstermektedir, iki suş bir azalma ve bir suş N2’ye göre beslenme davranışında bir artış göstermektedir. Protokolün bu uygulaması, bir ilacın farklı genetik arka planlarda bir konsantrasyonda test edilmesini sağlar. Aynı ilaç verildiğinde vahşi tip N2 kontrollerinden farklı bir gıda alımı yanıtı gösteren genetik geçmişleri tanımlamak için uygundur. Aynı tabak kurulumunda gıda alımını ve kullanım ömrünü hızlı bir şekilde taramak için kullanım ömrü protokolümüzle eşleştirilebilir31. Ek Materyal: Şekil 2C’de gösterilen elektronik tablo şablonları. Bu materyalleri indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Sunulan protokol, 96 oyuklu mikrotitre plakalarında C. elegans gıda alımı için bir okuma olarak bakteri klerensini ölçer. Temsili sonuçlar bölümündeki doz-yanıt eğrileri, tahlilin, izotop etiketli bakteriler¹¹ kullanılarak bağımsız olarak doğrulanan bir kavram olan gıda alımını kantitatif olarak ölçtüğünü göstermektedir. Bu testi kullanarak, bilinen insan metabolik yan etkileri olan antipsikotikler gibi FDA onaylı ilaçları başarıyla test ettik ve bu ilaçların C. elegans^10,26’da beslenmeyi artırdığını gösterdik. Tahlil, beslenmenin genetiğini veya farmakolojisini incelemek için yararlıdır ve metabolizmayı incelemek için C. elegans araştırmaları için yeni bir araç ekler. Bu tahlil, diğer organizmaların çoğunda mümkün olmayan, ölçeklenebilir ve zaman dostu bir şekilde beslenmeyi incelemek için düşük maliyetli bir yöntem sağlar. FDA onaylı ilaçlar üzerinde yaptığımız çalışmalar, insan hastalarda görülen birçok yan etkinin C. elegans’ta da görüldüğünü göstermekte ve evrimsel korumayı ortaya koymaktadır 24,26,32.

Test, OD₆₀₀ ölçümünün doğrusal aralığında ölçülebilen bakteri konsantrasyonu ile sınırlıdır. Sonuç olarak, solucan sayısı ve test edilebilecek bakteri konsantrasyonları aralığı sınırlıdır. Çok fazla solucan, bakterileri çok hızlı tüketerek OD_600’ü etkileyecektir, bu nedenle bakteri konsantrasyonunu doğrusal OD_600’den “yiyecektir”. Deneyimlerimize göre, bakteri preparasyonundaki değişkenlik, sonuçların bir deneyden diğerine değişmesine neden olan kritik parametredir. Büyük bakteri gruplarını dondurmayı veya liyofilize bakterileri kullanmayı başarısız bir şekilde denedik. Bu durumlarda, ya kendi kendine analiz oranı çok yükseldi ya da bakteriler C. elegans gelişimini yavaşlatan bir kalitedeydi. Ancak, testlerimiz kapsamlı değildir ve bu sorun çözülebilir.

Genel olarak, bakterilerin kendi kendini analiz etme hızı, kontrol edilmesi en zor olanıdır ve önemli ölçüde değişkenliğe neden olabilir. Bazı ilaçların kendi kendine analiz oranını, tahlilin gıda alımını güvenilir bir şekilde belirleyemediği seviyelere çıkarabildiğini bulduk. Tahlilde kendi kendine analiz oranı zamanla arttığından, yetişkinliğin 5. gününden sonra gıda alımını ölçmedik. Bu yaşa kadar, bakteriler kültürde ~ 10 gündür. Yetişkinliğin 5. gününden sonraki gıda alımını ölçmek için eski bakteriler yıkanmalı ve yenileriyle değiştirilmelidir.

Sunulan tahlil, 96 oyuklu mikrotitre plakalarına dayalı ömür testi^31’in bir uzantısıdır. Bu kombinasyon, aynı popülasyonda yaşam süresinin ve gıda alımının ölçülmesini sağlar. Burada sunulan bakteri klirens testi, bakteriyel kendi kendine oluşması nedeniyle C. elegans’ın tüm yaşamı boyunca gıda alımının belirlenmesine izin vermezken, en yüksek gıda alımının olduğu zaman olan yetişkinliğin ilk dört günü için sağlam veriler sağlar. Özellikle küçük moleküllü ilaç keşfi için, gıda alımını kontrol etmek çok önemlidir. Özetle, sunulan testin C. elegans topluluğu için yararlı olacağını ve yaşlanma ve yaşam süresi çalışmaları bağlamında metabolizmayı incelemek veya kontrol etmek için araç setini genişleteceğini tahmin ediyoruz.

Planlama:

Gıda alımını ölçmeyi planlamadan önce, birkaç husus göz önünde bulundurulmalıdır.

Bakterileri öldürmek:

50 mL’lik konik bir tüpte (160.0 kV ve 25.0 mA’da ayarlanmış 4 saat boyunca 900 Gri) X-ışınları ile ışınlayarak bakterileri öldürürüz. Işınlama için Rad Source tarafından RS2000 kullanıyoruz. Ekipmana bağlı olarak, belirli süre ve radyasyon dozu tesisten tesise değişebilir. Bakterilerin tamamen öldürülmesinin, hayatta kalanları büyüme yoluyla tespit etmek için ışınlamadan sonra bakterilerin kaplanmasıyla belirlenmesi gerekir. Test sırasında üremeyi önlemek için tüm bakterileri öldürmek önemlidir, çünkü bu, beslenmenin hafife alınmasına ve hatta negatif besleme değerlerine neden olacaktır. Daha da önemlisi, bakterilerin öldürülmesi gerekir, böylece C. elegans onları yemeye devam eder. Deneyimlerimize göre, büyük miktarlarda bakteriyi güvenilir bir şekilde öldürmenin üç yolu vardır: (i) X-ışınları ile ışınlama, (ii) γ ışınları ile ışınlama ve (iii) formaldehit^{ilavesi 29,30}. Bu üç yöntem arasındaki özanaliz oranları, Şekil 3B’de gösterilen deneyler için kendi kendine analiz oranları arasında% 8’lik bir varyasyon katsayısı ile karşılaştırılabilir. Elimizde güvenilir bir şekilde işe yaramayan yöntemler UV ışınlaması, antibiyotik kokteyller, ısı inaktivasyonu ve sodyum aziddi. Bu yöntemler ya bakterileri tamamen öldüremez (UV ve antibiyotikler), C. elegans’ın yemediği bakterileri üretir (ısı) ya da gıda alımını değiştirir (sodyum azid).

Çoğaltma sayısı:

Deneyimlerimize göre, beslenmedeki kıvrım değişiklikleri, gözlemlenen varyasyona kıyasla genellikle küçüktür. Bu nedenle, gıda alımındaki değişikliklerin ölçülmesi birkaç kopya kuyu gerektirir. Şekil 2A, B, 21 veya 14 replike kuyusu ve solucansız iki kendi kendine kontrol kuyusu ile dört veya altı farklı koşul için tasarlanmış 96 kuyulu plakayı göstermektedir. Büyük değişkenlik ve beklenen nispeten küçük değişiklikler göz önüne alındığında, beslemedeki 0,5-2,5 kat değişiklik alt ve üst sınırlar olma eğilimindedir. Her koşul için 14 ila 21 çoğaltma kuyusu ve aşağıda açıklanan en az iki kendi kendine kontrol kuyusu öneririz. Bu replikasyonlar, beslenmeyi değiştiren ilaçlar için kantitatif doz-yanıt eğrileri oluşturmak için yeterlidir^11,26.

Selflysis kontrolleri:

OD₆₀₀, çoğunlukla parçacık boyutundan bağımsız olarak bir çözeltideki parçacık sayısını ölçer. Bununla birlikte, ölü bakteriler parçacıklı doğalarını kaybederek parçalanacaktır. Solucanların varlığında bağımsız olarak gerçekleşen ve solucanlar yemeden OD₆₀₀ ölçümlerini düşüren bu kendi kendine analiz diyoruz. Selflysis, tahlil sırasında gerçekleşir ve koşul başına en az iki kuyuda bağımsız olarak ölçülmesi gerekir. Bu kuyular, herhangi bir solucan içermemeleri dışında, aynı durumda diğerleriyle aynı muameleyi görür. Birçok ilacın kendi kendine analiz oranını da değiştirebileceğini bulduk. Bu nedenle, her koşul, kendi konsantrasyonları ile bağımsız kendi kendine kontrol kuyularına ihtiyaç duyar. Şekil 2, H satırındaki plakanın altındaki tüm kendi kendine kontrol kuyuları ile dört veya altı koşul için bir plaka kurulumunu göstermektedir.

N2 referans popülasyonu:

Ayrıca, tüketilen mutlak bakteri miktarının, büyük olasılıkla bakterilerin kalitesiyle ilgili olarak deneyler arasında dalgalanabileceğini de belirttik. Onları her seferinde tam olarak aynı şekilde hazırlamak için elimizden gelenin en iyisini yapmamıza rağmen, dalgalanmalar oluyor. Örneğin, bakteriler logaritmik büyüme fazı sırasında bölünme durumundayken hasat edilebilir ve bu nedenle durağan fazda hasat edilen bakterilerden çok daha büyük olabilir. Bu nedenle, bakteri boyutundaki bu basit farklılıklar, tüketilen bakteri sayısında değişikliklere ve OD₆₀₀ ölçümleri boyutlar arasında ayrım yapmadığından, farklı OD₆₀₀ değerlerine yol açabilir. Bu nedenle, deney gruplarının N2 kontrolünden daha fazla mı yoksa daha az mı yediğini belirlemek için her zaman 1 veya %100’e ayarlanmış bir referans değer olarak hizmet eden, tedavi edilmemiş N2 kontrol hayvanlarından oluşan bir popülasyonu dahil ederiz. Bu uygulama, OD₆₀₀ değerleri değişse bile deneyler arasında karşılaştırmalara izin verir.

Zaman aralıkları:

Gıda alımını ölçmek için OD₆₀₀ değerlerinin kullanılması, bakteri konsantrasyonunun ölçülebilir şekilde azalmasını gerektirir. Kültür hacmi solucanlardan çok daha büyük olduğu için, tespit edilebilir bir fark yaratmak için önemli miktarda bakteri yemeleri gerekir. OD₆₀₀ değerleri için doğrusal aralıkta kalmak, bakteri konsantrasyonunun ~ 1 mg / mL ile 10 mg / mL arasında kalmasını gerektirir, böylece onu tespit etmek için önemli miktarda bakterinin yok olması gerekir. Solucanlar, yumurta üretimi nedeniyle L4’ün sonlarından yetişkinliğin 4. gününe kadar en çok yerler. Bu nedenle, bu aralık idealdir. 24 saat gibi daha kısa aralıklar¹¹ ölçülebilir, ancak bu çok daha zordur ve koşul başına ~ 40 kuyu gerektirir. Larvaların besin alımını ölçmek için başka bir seçenek, kuyu başına hayvan sayısını iki katına çıkarmaktır. Bununla birlikte, bu yaklaşımla ilgili sorun, çok fazla solucanın büyüdüklerinde OD₆₀₀ okumalarını etkilemeye başlamasıdır.

Test edilecek ilaçlar için stok çözeltileri:

Serotonin gibi ilaçlar beslenmeyi modüle etme yetenekleri açısından test edilirse, stok çözeltileri hazırlarken aşağıdakileri göz önünde bulundurun. Genellikle suda çözünür ilaçlar için 50x’lik bir stok hazırlarız ve her oyuğa 3 μL ekleriz (1:50), ancak diğer stok konsantrasyonları (100x, 300x) da işe yarar. Bununla birlikte, ilaçlar su dışındaki çözücülerde seyreltilirse (ör., DMSO), nihai konsantrasyon% 0.5’i geçmemelidir. Çözücüler hızla C. elegans için zararlı hale gelir. Bu nedenle, DMSO gibi organik çözücüler içinde çözünen ilaçların stok çözeltileri 300x veya daha yüksek olmalıdır.

Canlı ve ölü solucanları puanlama:

Canlı ve ölü hayvanların belirlenmesi solucanın hareketine dayanır. Güçlü ışık, özellikle mavi ışık, hayvanların hareket etmesine neden olduğu için kullanılır. Ayrıca, kuyu başına hayvan sayısının puanlanması, fazla ölüm olup olmadığını ortaya çıkaracaktır. Toksik maddeler veya DMSO dahil olmak üzere çeşitli çözücülerin yüksek konsantrasyonları (% >0.5) ile aşırı ölümler meydana gelebilir. Genel olarak, 1:100’den (%1) az ölü hayvan olmalıdır. Yiyecekler çökerse ve popülasyonun sayılması zorlaşırsa, plakalar mikrotitre plaka çalkalayıcı üzerinde 800 rpm’de 30 saniye boyunca çalkalanabilir. Erkekleri veya 16’dan fazla solucanı olan kuyuları görmezden gelin (sorunlara bakın).

Olası sorunlar:

Yetersiz çalkalama:

Sıvı bir ortamda, bakteriler kolayca bir araya toplanabilir ve kuyuların dibine yerleşebilir. Deneyimlerimize göre, 20 dakikadan daha kısa bir süre çalkalamak, bakteri kümelerini parçalayamayabilir ve yeniden askıya alamayabilir, bu da yanlış OD₆₀₀ ölçümlerine neden olabilir. Bakteri kümelerinin varlığında OD₆₀₀ ölçümleri, bakteri konsantrasyonunu hafife alacaktır. Aşırı çalkalayıcı ayarları, sıvının sızdırmazlık maddesine yapışmasına neden olabilir. OD₆₀₀ okuması için kapatıcı çıkarıldıktan sonra, kapatıcıya yapışan sıvı daha düşük bir OD₆₀₀ okuması ile sonuçlanacaktır. Kapatıcı üzerinde sıvı varsa, plakayı hızlı bir şekilde düşük hızda (500-1.000 rpm) döndürün ve tekrar 5 dakika çalkalayın. Ayrıca, 1. ve 4. gündeki okumalarda belirtildiği gibi , bakterilerin yerleşmesini önlemek için plakaları salladıktan sonraki 10 dakika içinde okuduğunuzdan emin olun.

Deneyler arasında farklı mutlak gıda alım değerleri:

Bakteri preparatlarını standartlaştırmak için elimizden gelenin en iyisini yapmamıza rağmen, bunlar genellikle solucanlarda gıda alımını etkileyen şekillerde farklılık gösterir. Örneğin, bölünme durumları nedeniyle bakteriler, logaritmik büyümede mi yoksa durağan fazda mı hasat edildiğine bağlı olarak boyut olarak farklılık gösterir ve logaritmik bakteriler daha büyüktür. OD₆₀₀ ölçümlerinin boyutlar arasında ayrım yapmaması nedeniyle, bakterilerin hasat edildiği aşamaya bağlı olarak bakteri boyutundaki farklılıklar, bakteri preparatları arasındaki bazal gıda alımında gözlenen belirgin farklılıklara yol açabilir. Deneyler arasında karşılaştırma yapmanın en iyi yolu, her zaman tedavi edilmemiş bir N2 kontrol popülasyonunu dahil etmek ve sonuçları bu N2 popülasyonuna normalleştirmektir.

Kalabalık etkileri:

Bu protokoldeki bakteri konsantrasyonu, OD_{600’ü ~ 72} saat boyunca oyuk başına 2-16 solucan için doğrusal aralıkta tutmak için yeterlidir. İlgilenilen ilaca bağlı olarak, 16’dan fazla solucan içeren bir kuyu, ikinci ölçümden önce bakteri konsantrasyonunu tüketebilir. Ayrıca, bir hayvanın bulunduğu kuyuların güvenilmez olma eğiliminde olduğunu da bulduk. Lizis faktörü, tek bir solucanın yediklerinden daha ağır basar. Bu nedenle, lizis faktörünün belirlenmesindeki küçük hatalar, daha az solucan içeren kuyuları orantısız bir şekilde etkiler.

Aşağıdaki koşullardan birinin karşılanması durumunda kuyuların istatistiksel analizlerden hariç tutulmasını öneririz. Kuyuda erkekler var (erkekler ve hermafroditler arasındaki gıda alımını karşılaştıran hiçbir veriye sahip değiliz); kuyuda 2’den az solucan veya kuyuda 16’dan fazla solucan vardır; ikinci okumada solucanlar öldü; ya da FUdR başarısız olduğu için kuyularda döl varsa. FUdR ısıya duyarlıdır ve 37 °C’ye kadar düşük sıcaklıklarda bile etkisiz hale gelir. FUdR’yi her zaman oda sıcaklığındaki suda çözdürün.

Negatif gıda alım değerleri:

Yiyecek alım değerleri bazen negatiftir, bu da 4. günde 1. güne göre daha fazla yiyecek olduğunu gösterir. Negatif gıda alım değerleri aşağıdaki faktörlerden birini gösterebilir: muhtemelen bakterilere etki eden bir ilacın neden olduğu yüksek bir benlik analizi oranı veya kuyunun kontamine olduğunu ve solucanlardan başka bir şeyin büyüdüğünü düşündürebilecek negatif gıda alım değerleri. Bakteriler yaşlandıkça benlik oranları da artar; Bu nedenle, bir haftadan daha eski olmayan bakterileri kullanmanızı öneririz. OD₆₀₀ değerini etkileyen zamanla çökelen bir ilaç eklenmiştir. 1. Günde yetersiz çalkalama, bakteri kümeleri nedeniyle daha düşük bir OD₆₀₀ okumasına neden olabilir. Solucanlar hipoksik strese maruz kaldı. Bu, yüzey-hava oranı oksijen değişimine izin vermek için yeterli olmadığında meydana gelir. Malzemelerde özel 96 oyuklu plakayı kullanın ve kuyucuk başına 150 μL’yi (120 μL + 30 μL FUdR) aşmayın . Kuyu yüzeyi ile solucanların yaşadığı dip arasındaki mesafe oksijen konsantrasyonunu belirler.

Sınırlama:

Bu tahlil sıvı kültür ile sınırlıdır. Yiyecek çimlerine girip çıkma gibi katı plakalarda gözlemlenen beslenme davranışları tahlil ile değerlendirilemez.

Materials

Amphotericin B	RPI	A40030-0.1	solvent: EtOH
Ampicillin	Fisher Scientific	BP176025	solvent: water
Bacto Peptone	BD Biosciences	211677	use to make NGM plates
Carbenicillin	Fisher Scientific	46-100-RG	solvent: water
Cell strainer	Fisher Scientific	22363547	40 µm to remove adults
Cholesterol	MP Biomedicals	02101380-CF	5 mg/mL stock
Difco, Agar, Bacteriological	BD Biosciences	214510	use to make NGM plates
Fluorodeoxyuridine	Sigma Aldrich	F0503	to sterilize worms on L4
Luria Broth	RPI	L24045-1000.0	open capsule, mix with 1 L of water, autoclave
M9 Buffer	Laboratory Prepared		Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L:  15 g Na2HPO4*12H2O (FW: 358) 3 g KH2PO4 (FW: 136)  5 g NaCl (FW: 58), 0.25 g MgSO4*7H2O (FW: 246)  autoclave
Microplate Sealer	Fisher Scientific	236707
OP50	Caenorhabditis Genetics Center
Plate 96-well	Falcon	351172
Plate reader	Tecan	30016056	use 600 nm filter lens
Potassium Citrate, 1 M , pH 6	Laboratory Prepared		Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: 268.8 g Potassium citrate tribasic monohydrate (FW: 324) 26.3 g citric acid monohydrate (FW: 210) 900 mL of dH2O pH to 6 using 5 M KOH autoclave
Potassium Phosphate, 1 M , pH 6	Laboratory Prepared		Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: 136 g KH2PO4 (FW: 136) 900 mL dH2O  pH to 6 using 5 M KOH autoclave
S-Basal	Laboratory Prepared		Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: 5.9 g NaCl (FW: 58)  50 mL 1 M potassium phosphate (pH 6) add 900 mL dH2O autoclave, cool to 55 °C
S-Complete	Laboratory Prepared		Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: Add to 1 L of S-basal (cooled to 55 °C or RT)  10 mL of 1 M potassium citrate  pH 6, 10 mL of trace metal solutions  3 mL of 1 M CaCl2 3 mL of 1 M MgSO4
Serotonin hydrochloride	Thermo Scientific	AAB2126309	used at 5 mM
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S7653-5KG	to make buffers and NGM plates
Terrific Broth	Thermo Scientific	J75856-A1	12.5 g in 250 mL of water, autoclave
Titer plate Shaker	Thermo Scientific	88880023	shaken at 800 rpm, depends on shaker
Trace Metals Solution	Laboratory Prepared		Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: 1.86 g Na2EDTA (FW: 372.24) 0.69 g FeSO4*7H2O (FW: 278)  0.20 g MnCl2*4H2O (FW: 198) 0.29 g ZnSO4*7H2O (FW: 287)  0.016 g CuSO4 (FW: 158) autoclave wrap in aluminum foil to keep in the dark