Quantificazione dell'assunzione di cibo in Caenorhabditis elegans misurando la clearance batterica

Summary

Questo protocollo descrive un test per quantificare la velocità di alimentazione di Caenorhabditis elegans basato sulla misurazione della clearance dei batteri in coltura liquida.

Abstract

L’alimentazione è un processo biologico essenziale per la crescita, la riproduzione e la sopravvivenza di un organismo. Questo test mira a misurare l’assunzione di cibo di Caenorhabditis elegans (C. elegans), un parametro importante quando si studia la genetica dell’invecchiamento o del metabolismo. Nella maggior parte delle specie, l’alimentazione è determinata misurando la differenza tra la quantità di cibo fornita e la quantità rimasta dopo un determinato intervallo di tempo. Il metodo qui presentato utilizza la stessa strategia per determinare l’alimentazione di C. elegans. Misura la quantità di batteri, la fonte alimentare di C. elegans, eliminati entro 72 ore. Questo metodo utilizza piastre per microtitolazione a 96 pozzetti e ha permesso lo screening di centinaia di farmaci per la loro capacità di modulare l’assunzione di cibo a una velocità e una profondità non possibili in altri modelli animali. Il punto di forza di questo test è che consente di misurare contemporaneamente l’alimentazione e la durata della vita e misura direttamente la scomparsa del cibo e, quindi, si basa sugli stessi principi utilizzati per altri organismi, facilitando il confronto tra specie.

Introduction

Caenorhabditis elegans è stato ampiamente utilizzato nella ricerca sull’invecchiamento.  È stato un modello potente per studiare la genetica alla base della longevità mediata dal metabolismo indotta dalla restrizione dietetica, dalla ridotta attività mitocondriale o dalla ridotta segnalazione dell’insulina. 1,2,3,4,5,6,7. Tuttavia, la misurazione dell’alimentazione nel contesto della longevità si è dimostrata difficile per C. elegans a causa delle piccole dimensioni dell’animale 3,8,9,10,11,12,13,14,15.

L’alimentazione è un comportamento biologico fondamentale necessario per la sopravvivenza e la sua stretta regolazione è al centro del mantenimento della salute metabolica, della riproduzione e dell’invecchiamento. Il comportamento alimentare è controllato da molteplici vie di segnalazione sia nel sistema nervoso che nella periferia e, quindi, può essere studiato solo in vivo 16,17,18,19. L’alimentazione rappresenta il primo di tre pilastri: (i) l’assunzione di energia, (ii) l’immagazzinamento di energia e (iii) il dispendio energetico che governa l’omeostasi energetica di un organismo. L’alimentazione in C. elegans è stata principalmente studiata misurando il pompaggio faringeo, come definito dal tasso di contrazioni della faringe. Questo approccio ha fornito informazioni cruciali sul comportamento alimentare di C. elegans 3,4,8,12,13,20,21; Tuttavia, il pompaggio faringeo, misurato soprattutto su brevi intervalli di minuti, non è necessariamente correlato all’assunzione di cibo.

L’assunzione di cibo non è determinata solo dalla velocità di pompaggio faringea, ma anche da parametri come la durata e la frequenza dei cicli di alimentazione e la densità dei batteri alimentari. Un animale può avere un pompaggio faringeo molto elevato, ma la durata dei suoi periodi di alimentazione può essere più breve, compensando l’aumento della velocità. Un altro fattore di confusione è l’efficienza con cui il pompaggio può o meno ingerire e macinare i batteri. Un esempio estremo di disaccoppiamento dell’assunzione di cibo dal pompaggio faringeo è l’aggiunta di serotonina senza la presenza di cibo (batteri). In presenza di serotonina esogena, gli animali pompano ad una velocità elevata, ma senza la presenza di batteri, l’elevata velocità di pompaggio non porta all’assunzione di cibo 2,6,13,22,23.

Il metodo di eliminazione batterica qui presentato misura l’assunzione di cibo delle popolazioni di vermi nei singoli pozzetti come il declino delle concentrazioni batteriche nel tempo (Figura 1). Questo approccio è simile a quelli utilizzati in altre specie in cui la scomparsa del cibo rappresenta una misura dell’assunzione di cibo 10,11,24,25,26,27,28. Nella pubblicazione originale, abbiamo convalidato questo metodo di misurazione dell’assunzione di cibo somministrando a C. elegans batteri marcati con isotopi ¹⁵N¹¹. Successive misurazioni mediante spettrometria di massa hanno dimostrato che la misurazione della scomparsa dei batteri era fortemente correlata con il verificarsi della marcatura isotopica, rivelando l’effettivo assorbimento dei batteri nell’animale¹¹. Pertanto, siamo fiduciosi che il test di clearance batterica rappresenti l’assunzione di cibo nella maggior parte delle circostanze. Lo scopo del test non è quello di sostituire il test di pompaggio faringeo, ma di aggiungere alla cassetta degli attrezzi dei test per studiare l’alimentazione e il metabolismo in C. elegans e come si relaziona con l’invecchiamento e la longevità.

Protocol

Figura 1: Schema del test di clearance batterica. Schema grafico delle sezioni principali del protocollo (dall’alto verso il basso): preparazione dei batteri, sincronizzazione della popolazione di vermi, semina in piastre a 96 pozzetti, sterilizzazione dei vermi, aggiunta di farmaci, misurazione di OD600 il giorno 1 e il giorno 4. Una descrizione dettagliata di questi passaggi specifici è indicata a sinistra di ogni raffigurazione. Abbreviazioni: OD = densità ottica; FUdR = fluorodesossiuridina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 1. Preparazione dei batteri NOTA: Questa sezione descrive in dettaglio la preparazione dei batteri alimentari utilizzati in questo test. Il ceppo specifico di E. coli utilizzato nel test è chiamato OP50. OP50 è il ceppo più utilizzato per l’alimentazione di C. elegans. Il ceppo OP50 utilizzato è resistente alla carbenicillina/ampicillina, il che impedisce la contaminazione incrociata della coltura del verme con altri batteri9. Preparare l’OP50 con 4-5 giorni di anticipo e irradiare a raggi X un giorno prima dell’uso. Assicurarsi che tutti i materiali che incontrano OP50 siano sterili 29,30. Giorno -8: Mercoledì (settimana 1):Preparare il preinoculo inoculando 5 mL di LB con 100 μg/mL di Ampicillina e 0,1 μg/mL di Amfotericina B e una singola colonia di OP50 e incubare per circa 6 ore a 37 °C in un agitatore batterico. Inoculare presto per consentire una crescita sufficiente affinché la coltura diventi torbida. Una volta che la coltura è torbida, diluire la coltura preinoculum di OP50 di 1:2.000 in 250 mL di TB contenente 100 μg/mL di ampicillina. Incubare la coltura per una notte in un agitatore batterico per 17-19 ore a 37 °C.NOTA: La coltura non deve essere lasciata crescere per più di 19 ore. Giorno -7: Giovedì (settimana 1)Dopo l’incubazione di 17-19 ore, trasferire la coltura liquida OP50 in una provetta da centrifugazione sterile e centrifugare per 15 minuti a 3.100 × g in una centrifuga da tavolo a 4 °C. Scartare il surnatante, risospendere il pellet OP50 con acqua sterile e centrifugare nuovamente. Ripetere questo lavaggio 2 volte. Dopo il secondo lavaggio, scartare il surnatante, risospendere il pellet OP50 in acqua sterile a un volume di 50 mL e trasferirlo in una provetta conica da 50 mL prepesata. Pellettare l’OP50 mediante centrifugazione per 20 minuti a 3.100 × g in una centrifuga da tavolo a 4 °C. Dopo il terzo lavaggio, rimuovere con cura tutto il surnatante rimasto, assicurandosi che non rimanga acqua nel tubo. Calcolare il peso del pellet sottraendo il peso della provetta da centrifugazione vuota dal peso della provetta da centrifugazione con il pellet.NOTA: I pesi dei pellet variano in genere da 3 a 3,5 g. Risospendere accuratamente il pellet OP50 nel tampone S-complete a una concentrazione di 100 mg/mL, assicurandosi che non siano presenti grumi. Assicurarsi che la concentrazione di OP50 a 100 mg/mL corrisponda a 2 × 1010 batteri/mL. Se la relazione tra la densità ottica e il numero di batteri per mL è nota, determinare la concentrazione batterica per mL spettrofotometricamente. Se necessario, utilizzare il tampone S-complete per regolare la concentrazione della soluzione di alimentazione OP50 a 2 × 1010 batteri/mL. Testare l’OP50 su una piastra di agar per determinare se è stato contaminato. Conservare l’OP50 sospeso in tampone S-complete a 4 °C. Giorno -3: Lunedì (2ª settimana)Uccidere i batteri tramite irradiazione a raggi X per prevenire la crescita batterica durante il test. 2. Preparazione sincrona della coltura di vermi NOTA: in questa sezione viene illustrata la preparazione di una popolazione di worm sincrona. Tutti i materiali che entrano in contatto con le popolazioni di vermi sono sterili. Tutte le lastre sono conservate a 20 °C se non diversamente specificato. Giorno -6: Venerdì (settimana 1), ore 16:00Trasferisci gli animali in un piatto fresco.Prendete una piastra NGM su cui la maggior parte della popolazione di vermi è costituita da larve di L1 affamate.NOTA: Anche una popolazione mista produrrà risultati. L’uso di vermi L1 che sono stati affamati per molto tempo può influenzare il comportamento alimentare nelle generazioni attuali o future, poiché la fame può lasciare segni epigenetici per almeno tre generazioni. Lavare via i vermi con non più di 1 ml di acqua sterile. Aliquotare ~300 μL della popolazione di vermi lavati su piastre NGM seminate con OP50 concentrato (~300 mg/mL). Lasciare asciugare le piastre sotto un essiccatore a piastre o un bruciatore Bunsen. Incubare le piastre a 20°C fino a quando gran parte della popolazione non contiene adulti gravidi (lunedì).NOTA: Questo intervallo di tempo è ottimizzato per una popolazione di vermi N2 wild-type e può variare da ceppo a ceppo. I vermi con ritardi nello sviluppo dovrebbero essere presi in considerazione ed essere spezzettati prima e/o seminati prima in modo che tutti i ceppi testati raggiungano l’età adulta contemporaneamente. Giorno -3: Lunedì (settimana 2) ore 10:00Stabilire una popolazione sincronaCAUTELA! La candeggina è corrosiva per la pelle e gli occhi. La manipolazione richiede guanti e occhiali di sicurezza.Raccogliere i vermi lavandoli via dalla piastra con un massimo di 10 ml di acqua sterile. Trasferire questa soluzione di vite senza fine/acqua in una provetta conica da 15 mL. Lavare i vermi con lavello a gravità sul piano di lavoro per circa 4 minuti (al contrario, lavare per centrifugazione per 2 minuti in una centrifuga da tavolo a 310 × g. Eliminare il surnatante attraverso l’aspirazione utilizzando una piccola punta e aggiungere fino a 15 ml di acqua sterile. Ripeti 3 volte. Rimuovere il surnatante e aggiungere 5 ml di una soluzione di candeggina/NaOH appena preparata (1,8 ml di candeggina per uso domestico, 0,5 ml di 10 N NaOH, 7,7 ml di dH2O). Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente o fino a quando i vermi non si aprono. Agitare delicatamente ogni minuto per almeno 10 s. Monitorare i progressi al microscopio da dissezione.NOTA: Il tempo necessario per aprire i vermi può variare da ceppo a ceppo. Lasciare i vermi nella soluzione di candeggina per troppo tempo può causare uova non vitali. Aggiungere il tampone M9 per neutralizzare la reazione una volta che tutti gli adulti si aprono o si dissolvono (il volume finale deve essere di 15 ml) e centrifugare per 2 minuti a 1.300 × g. Lavare le uova 3 volte con 13 ml di tampone M9. Lavare le uova una volta con 10 ml di tampone S-complete centrifugando per 2 minuti a 1.300 × g. Aspirare il surnatante, aggiungere 10 mL di S-complete e trasferire la sospensione in una nuova provetta conica da 15 mL. Ruotare delicatamente il tubo a temperatura ambiente durante la notte su un nutator o un dispositivo simile. Opzionale: se dopo la centrifugazione finale sono presenti carcasse adulte in tampone S-completo, filtrare la soluzione di verme attraverso un colino cellulare da 40 μm. Giorno -2: martedì (settimana 2), ore 13:00Semina degli animali in piattiUsando un cannocchiale da dissezione, controlla se i vermi si sono schiusi. Determinare la concentrazione di vermi nel tampone S-completo contando la popolazione di vermi in gocce da 10 μL utilizzando un cannocchiale da dissezione; Conta 5-10 gocce per ogni campione. Se la concentrazione di vermi in ogni goccia da 10 μl supera i 30 vermi per goccia, diluire lo stock totale con S-complete a una densità di vermi per goccia inferiore per facilitare il conteggio. Seminare la miscela di vermi liquidi in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti a un volume di 120 μL come segue (concentrazioni finali): 60 vermi/mL in S-completo, 50 μg/mL di carbenicillina, 0,1 μg/mL di amfotericina e 6 mg/mL di OP50 preparati nella sezione 1.NOTA: Il volume totale da preparare dipende dal numero di piastre (~12 mL per piastra da 96 pozzetti). Dovrebbero esserci 6-12 vermi in ogni pozzo. In alternativa, è possibile utilizzare una citometria a flusso di particelle di grandi dimensioni, come la COPAS FP di Union Biometrica, per ordinare con precisione 10 vermi in ciascun pozzetto (vedere la sezione sull’effetto di affollamento). Includere anche una miscela liquida senza vermi : 50 μg/mL di carbenicillina, 0,1 μg/mL di amfotericina e 6 mg/mL di OP50 preparati nella sezione 1. Mettere 120 μl della miscela no-worms nella riga H della piastra a 96 pozzetti, che viene utilizzata per determinare i valori di autolisi, come accennato in precedenza. Mettere 120 μl per pozzetto della miscela con i vermi nelle file A-G.NOTA: Assicurarsi che i vermi siano tenuti in sospensione durante il pipettaggio (vedere la Figura 2A, B). Utilizziamo piastre trasparenti a 96 pozzetti con fondo piatto. Il nostro layout della piastra divide la piastra per produrre 4 o 6 condizioni in cui ogni coppia di colonne sarà un diverso trattamento farmacologico o ceppo di verme, e la riga inferiore fungerà da controllo “no worm” (Figura 2A, B). Per evitare la contaminazione e l’evaporazione, sigillare la lastra con un sigillante a nastro. Incubare le piastre per circa 65 ore a 20 °C fino a quando gli animali diventano vermi L4. Giorno 0: giovedì (settimana 2) prima di mezzogiorno.Sterilizzazione della popolazione di vermi mediante l’aggiunta di Fluorodesossiuridina (FUdR).Aggiungere 30 μl di una soluzione madre di FUdR 0,6 mM per sterilizzare gli animali in ciascun pozzetto. Richiudere la piastra con sigillanti a nastro adesivo e agitare le piastre per 20 minuti su un agitatore per piastre per microtitolazione a 800 giri/min. Riportare le piastre nell’incubatore a 20 °C.NOTA: In questa fase, la concentrazione finale di OP50 viene ridotta da 6 mg/mL a 5 mg/mL (1 × 109 batteri/mL) e ogni pozzetto ha un volume finale di 150 μL. È fondamentale aggiungere la FUdR allo stadio L4 prima che gli animali raggiungano l’età adulta. Giorno 1: Venerdì (settimana 2)Aggiungi droghe alla cultura.Entro le 9:00, conferma che la maggior parte degli animali è gravida e che ogni pozzetto contiene diverse uova. Se necessario, aggiungere eventuali farmaci alla concentrazione desiderata (vedere la discussione). Dopo aver aggiunto il farmaco, sigillare le piastre con un sigillante a nastro adesivo e agitare le piastre per 20 minuti a 800 giri/min su uno shaker per piastre.NOTA: L’agitazione assicura che tutti i grumi batterici si dissolvano senza toccare il sigillante. Sia i grumi batterici che il liquido sul sigillante distorcono la lettura di OD600 . Se sono presenti gocce di liquido sul sigillante, centrifugarlo brevemente per 10-20 s a 310 × g. Agitare nuovamente sullo shaker per 5 minuti e misurare. Dopo 20 minuti di agitazione sull’agitatore per piastre per microtitolazione, rimuovere il coperchio e il sigillo e misurare l’OD600 in un lettore di piastre; questa è la misura del giorno 1 OD600 . Sigillare e riportare le piastre in un’incubatrice a 20 °C.NOTA: Poiché i batteri si depositano rapidamente, la lettura dovrebbe avvenire entro 10 minuti dall’agitazione delle piastre. Utilizzare un microscopio invertito per controllare la popolazione di vermi alla ricerca di segni di contaminazione o tossicità se è stato aggiunto un farmaco. Rimettere le piastre nell’incubatore a 20 °C. Giorno 4: Lunedì (3ª settimana)Prendi la lettura del giorno 4 OD600 .Ripetere la procedura di lettura dal giorno 1 (passaggio 2.5.1.3) per ottenere il valore del giorno 4 OD600 . Prima della misurazione OD600 , agitare le piastre per 20 minuti a 800 giri/min sull’agitatore per piastre per microtitolazione. Su un microscopio invertito, idealmente con un obiettivo 2x, contare la popolazione di vermi in ogni pozzetto e registrarla in un foglio di calcolo. Rimettere le piastre nell’incubatore a 20 °C dopo il conteggio.NOTA: Consulta un esempio del nostro foglio di punteggio fornito in Materiale supplementare. Dopo la lettura del giorno 4 , le misurazioni dell’assunzione di cibo sono complete. Se necessario, conservare queste piastre per l’analisi della durata della vita.NOTA: Questo protocollo è compatibile con Solis e Petrascheck31. 3. Analisi dei dati sull’assunzione di cibo Figura 2: Progettazione e analisi. (A, B) Possibili design delle piastre per le condizioni 4 e 6 con i pozzetti di controllo “senza vite senza fine” nella fila H. Questi pozzetti sono necessari per determinare il tasso di autolisi. In ogni piastra, includere sempre come riferimento una popolazione di controllo N2 non trattata. (C) Dati campione raccolti nel foglio di calcolo fornito con il numero di vermi (riquadro verde), le due misure OD600 nei giorni 1 e 4 (caselle arancioni), i valori di autolisi (riquadro blu) e la valutazione utilizzando la formula (2) ((OD600 -autolisi)/X0) nel riquadro rosso. L’esempio specifico mostrato qui utilizza il design della piastra mostrato in (B). Abbreviazioni: OD = densità ottica; X0 = numero di vermi per pozzetto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. NOTA: Questa sezione descrive come vengono analizzati i dati sull’assunzione di cibo della sezione 2 di questo protocollo. I primi valori da calcolare sono i valori di controllo dell’autolisi . I batteri si lisano nel tempo in un liquido, anche in assenza di vermi. Questo valore di autolisi può anche essere influenzato da molte sostanze chimiche e deve essere controllato in quanto è relativamente grande rispetto all’assunzione di cibo di un verme. Come descritto al punto 2.3.1.4 e mostrato nel layout della piastra nella Figura 2A, B, la riga H contiene la stessa soluzione, escluse le viti senza fine. Nella nostra configurazione a piastra mostrata nella Figura 2B, ci sono 14 pozzetti per condizione con due rispettivi pozzetti di controllo dell’autolisi (fila H, “senza vermi”). Calcolare i valori di controllo dell’autolisi per i pozzetti di controllo senza vermi in ogni condizione utilizzando l’equazione ( 1). Per ogni gruppo replicato di pozzetti, assicurarsi che ci siano almeno due pozzetti di controllo senza vermi , come indicato nel passaggio 2.3.1.4. Utilizzare la media di tutti i pozzetti di controllo senza vermi per il valore di autolisi per un gruppo replicato.Selfysis = media (OD600 Giorno 1 – OD600 Giorno 4) (1)NOTA: Per la configurazione della piastra mostrata nella Figura 2B, calcoleremo sei valori di autolisi, uno per ciascuno dei sei gruppi, calcolando la media dei due pozzetti di controllo dell’autolisi nella riga H. Calcola l’assunzione di cibo per verme usando l’equazione     (2).NOTA: Formula utilizzata nel foglio di calcolo (riquadro rosso, Figura 2C) dove X0 è il numero di vermi per pozzetto. Dopo aver determinato l’assunzione di cibo per verme per ciascun pozzetto, calcolare le medie e la deviazione standard per l’intera condizione.NOTA: Per la configurazione della piastra mostrata nella Figura 2B, 14 pozzetti di replica per condizione sono sufficienti per i confronti statistici. Normalizzare ciascuna condizione alla rispettiva popolazione di controllo N2 non trattata. Indicare il cambiamento nell’alimentazione come un cambiamento di piega o percentuale di alimentazione di N2.NOTA: La normalizzazione viene eseguita perché i valori assoluti di OD600/X0 dell’equazione (2) possono variare tra gli esperimenti condotti in giorni diversi.

Representative Results

Figura 3: Dati rappresentativi. (A) Il grafico mostra le curve dose-risposta della variazione di piega nell’assunzione di cibo in funzione della concentrazione di serotonina. Tutti i dati mostrano un’assunzione di cibo basale non stimolata normalizzata all’alimentazione basale con N2. Si noti che gli animali daf-16 (mu86) mangiano più del tipo selvatico N2 quando non è stata aggiunta serotonina, ma mostrano un intervallo attenuato nella loro capacità di controllare l’alimentazione. (B) Il grafico mostra un grafico a violino della variazione della piega nell’assunzione di cibo di vermi trattati con 50 μM dell’antipsicotico Loxapina ma alimentati con batteri uccisi dai raggi X, dai raggi γ o dalla paraformaldeide (C) Il grafico mostra un grafico a violino della variazione della piega nell’assunzione di cibo di diversi mutanti con i loro genotipi indicati nell’asse x. Questi dati suggeriscono che i mutanti exc-4 e cgr-1 mangiano meno mentre i mutanti srp-6 mangiano di più. Gli asterischi rappresentano ** p < 0,001, ****p < 0,0001 come determinato da ANOVA e Brown-Forsythe-Welch, corretto post-hoc per tenere conto di più test di ipotesi. Le barre di errore mostrano ±S.E.M. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Nella Figura 1 viene evidenziato il flusso di lavoro complessivo di questo protocollo. Illustra l’intero processo, dalla produzione dei batteri all’acquisizione della lettura OD600 il giorno 1 e il giorno 4. Inoltre, l’infografica fa riferimento alle fasi specifiche dei metodi utilizzati. La Figura 2A, B mostra due possibili layout sperimentali delle piastre, inclusi i pozzetti di controllo “no-worms” nella riga H, necessari per calcolare i tassi di autolisi descritti nella sezione di discussione. Nell’esperienza del nostro laboratorio, è necessario che una delle condizioni da non trattare, il controllo dell’N2, tenga conto della variabilità dell’assunzione batterica di vermi osservata tra gli esperimenti (vedi discussione: Pianificazione [popolazione di riferimento N2]). La Figura 2C è un esempio del foglio di calcolo utilizzato per analizzare i dati generati in questo protocollo. Evidenzia il conteggio dei vermi in verde, l’autolisi in blu, il giorno 1 OD600 e il giorno 4 OD600 in arancione e l’assunzione di cibo per verme in rosso. Inoltre, ogni pozzetto viene monitorato per il ceppo, il farmaco, la concentrazione, la data dell’esperimento e altri trattamenti aggiunti. Ulteriori informazioni sulle equazioni specifiche utilizzate sono disponibili nella sezione 3 del protocollo. Nel complesso, questi fogli di calcolo (modello fornito come materiale supplementare) forniscono un’efficiente raccolta e analisi dei dati di questo protocollo. La Figura 3A mostra i risultati rappresentativi di una curva dose-risposta di come la serotonina modula l’alimentazione nei mutanti N2 e daf-16 utilizzando questo protocollo. In questo esperimento, la variazione della piega rispetto all’assunzione di cibo basale (primo punto nella curva) è stata calcolata attraverso cinque dosi crescenti di serotonina. Come evidenziano questi risultati, il ceppo N2 è in grado di mangiare troppo in modo dose-dipendente. Tuttavia, per il mutante daf-16 (mu86), sebbene l’alimentazione basale sia superiore a quella di N2, il mutante non può rispondere alla serotonina nello stesso modo dose-dipendente del ceppo N2. Questo protocollo ci permette di determinare il comportamento alimentare tra due ceppi in cui la concentrazione di serotonina era il fattore variabile per generare curve dose-risposta. La Figura 3B mostra l’assunzione di cibo di vermi trattati con l’antipsicotico Loxapina ma alimentati con batteri uccisi dai raggi X, dai raggi γ o dalla paraformaldeide. Si noti che questi esperimenti non sono stati condotti in parallelo e che le differenze non sono rappresentative dei diversi metodi per uccidere i batteri, ma sono dovute alla variabilità inter-sperimentale. La Figura 3C mostra l’assunzione di cibo di una serie di ceppi genetici, con due ceppi che mostrano una diminuzione e un ceppo che mostra un aumento del comportamento alimentare rispetto a N2. Questa applicazione del protocollo consente di testare un farmaco in una concentrazione in diversi background genetici. È adatto per identificare background genetici che mostrano una risposta all’assunzione di cibo diversa rispetto ai controlli N2 wild-type quando viene somministrato lo stesso farmaco. Può essere abbinato al nostro protocollo di durata per controllare rapidamente l’assunzione di cibo e la durata nella stessa configurazione della piastra31. Materiale supplementare: Modelli di fogli di calcolo mostrati nella Figura 2C. Clicca qui per scaricare questi materiali.

Discussion

Il protocollo ha presentato misure di clearance batterica come lettura per l’assunzione di cibo di C. elegans in piastre per microtitolazione a 96 pozzetti. Le curve dose-risposta nella sezione dei risultati rappresentativi mostrano che il test misura quantitativamente l’assunzione di cibo, una nozione che è stata confermata in modo indipendente utilizzando batteri marcati con isotopi¹¹. Utilizzando questo test, abbiamo testato con successo farmaci approvati dalla FDA come gli antipsicotici con noti effetti collaterali metabolici umani e abbiamo dimostrato che questi farmaci aumentavano l’alimentazione in C. elegans^10,26. Il test è utile per studiare la genetica o la farmacologia dell’alimentazione e aggiunge un nuovo strumento per la ricerca su C. elegans per studiare il metabolismo. Questo test fornisce un metodo a basso costo per studiare l’alimentazione in modo scalabile e rispettoso del tempo, cosa che non è possibile nella maggior parte degli altri organismi. Il nostro lavoro sui farmaci approvati dalla FDA mostra che molti effetti collaterali osservati nei pazienti umani sono osservati anche in C. elegans, rivelando la conservazione evolutiva 24,26,32.

Il test è limitato dalla concentrazione di batteri che può essere misurata all’interno dell’intervallo lineare della misura OD₆₀₀ . Di conseguenza, il numero di vermi e la gamma di concentrazioni batteriche che possono essere analizzate sono limitati. Troppi vermi influenzeranno l’OD₆₀₀ consumando i batteri troppo rapidamente, quindi “mangiando” la concentrazione batterica dall’OD₆₀₀ lineare. Nella nostra esperienza, la variabilità nella preparazione batterica è il parametro critico che fa variare i risultati da un esperimento all’altro. Abbiamo cercato senza successo di congelare grandi lotti di batteri o di utilizzare batteri liofilizzati. In questi casi, o il tasso di autolisi è diventato troppo alto, o i batteri erano di una qualità tale da rallentare lo sviluppo di C. elegans . Tuttavia, i nostri test non sono stati esaustivi e questo problema potrebbe essere risolvibile.

In generale, il tasso di autolisi dei batteri è il più difficile da controllare e può causare una notevole variabilità. Abbiamo scoperto che alcuni farmaci possono aumentare il tasso di autolisi a livelli che il test non è in grado di determinare in modo affidabile l’assunzione di cibo. Poiché il tasso di autolisi aumenta nel tempo nel test, non abbiamo misurato l’assunzione di cibo oltre il 5° giorno dell’età adulta. A quell’età, i batteri sono ~10 giorni in coltura. Per misurare l’assunzione di cibo oltre il 5° giorno dell’età adulta, i vecchi batteri devono essere lavati via e sostituiti con quelli freschi.

Il test presentato è un’estensione del nostro saggio³¹ sulla durata di vita basato su piastre per microtitolazione a 96 pozzetti. Questa combinazione consente di misurare la durata della vita e l’assunzione di cibo nella stessa popolazione. Sebbene il test di clearance batterica qui presentato non consenta di determinare l’assunzione di cibo per l’intera vita di C. elegans a causa dell’autolisi batterica, fornisce dati solidi per i primi quattro giorni di età adulta, il periodo con la più alta assunzione di cibo. Soprattutto per la scoperta di farmaci a piccole molecole, il controllo dell’assunzione di cibo è essenziale. In sintesi, prevediamo che il test presentato sarà utile alla comunità di C. elegans e amplierà il set di strumenti per studiare il metabolismo o controllarlo nel contesto degli studi sull’invecchiamento e sulla durata della vita.

Pianificazione:

Prima di pianificare la misurazione dell’assunzione di cibo, è necessario fare alcune considerazioni.

Uccidere i batteri:

Uccidiamo i batteri mediante irradiazione con raggi X in una provetta conica da 50 mL (900 Gray per 4 ore impostata a 160,0 kV e 25,0 mA). Per l’irraggiamento utilizziamo l’RS2000 di Rad Source. A seconda dell’apparecchiatura, il tempo specifico e la dose di radiazioni possono variare da struttura a struttura. L’uccisione completa dei batteri deve essere determinata placcando i batteri dopo l’irradiazione per rilevare i sopravvissuti per crescita. È essenziale uccidere tutti i batteri per prevenire la crescita durante il test, poiché ciò causerà una sottostima dell’alimentazione o addirittura valori di alimentazione negativi. È importante sottolineare che i batteri devono essere uccisi in modo che C. elegans possa ancora mangiarli. Nella nostra esperienza, ci sono tre modi per uccidere in modo affidabile grandi quantità di batteri: (i) irradiazione con raggi X, (ii) con raggi γ e (iii) l’aggiunta di formaldeide^29,30. I tassi di autolisi tra questi tre metodi sono comparabili, con un coefficiente di variazione dell’8% tra i tassi di autolisi per gli esperimenti mostrati nella Figura 3B. I metodi che non funzionavano in modo affidabile nelle nostre mani erano l’irradiazione UV, i cocktail di antibiotici, l’inattivazione del calore e l’azide di sodio. Questi metodi non riescono a uccidere completamente i batteri (UV e antibiotici), producono batteri che C. elegans non mangia (calore) o modificano l’assunzione di cibo (azoturo di sodio).

Numero di repliche:

Nella nostra esperienza, le variazioni di piega nell’alimentazione sono generalmente piccole rispetto alla variazione osservata. Pertanto, la misurazione dei cambiamenti nell’assunzione di cibo richiede diversi pozzetti replicati. Le figure 2A, B mostrano piastre a 96 pozzetti progettate per quattro o sei condizioni diverse, con 21 o 14 pozzetti di replica e due pozzetti di controllo dell’autolisi senza vermi. Data l’ampia variabilità e le variazioni relativamente piccole che ci si può aspettare, le variazioni di 0,5-2,5 volte nell’alimentazione tendono ad essere i limiti inferiore e superiore. Si raccomandano da 14 a 21 pozzetti di replica per ogni condizione e almeno due pozzetti di controllo dell’autolisi, descritti di seguito. Queste repliche sono sufficienti per generare curve dose-risposta quantitative per farmaci che cambiano l’alimentazione^11,26.

Controlli di autolisi:

OD₆₀₀ misura il numero di particelle in una soluzione, per lo più indipendentemente dalla dimensione delle particelle. Tuttavia, i batteri morti lisano, perdendo la loro natura di particelle. Chiamiamo questa autolisi, che avviene indipendentemente in presenza di vermi e abbassa le misurazioni di OD₆₀₀ senza che i vermi mangino. L’autolisi avviene durante il test e deve essere misurata in modo indipendente in almeno due pozzetti per condizione. Questi pozzetti ricevono lo stesso trattamento degli altri nelle stesse condizioni, tranne per il fatto che non contengono vermi. Abbiamo scoperto che molti farmaci possono anche alterare il tasso di autolisi. Pertanto, ogni condizione necessita di pozzetti di controllo dell’autolisi indipendenti con la rispettiva concentrazione. La Figura 2 mostra una configurazione della piastra per quattro o sei condizioni con tutti i pozzetti di controllo dell’autolisi nella parte inferiore della piastra nella riga H.

Popolazione di riferimento N2:

Abbiamo anche notato che la quantità assoluta di batteri consumati può fluttuare tra gli esperimenti, molto probabilmente correlata alla qualità dei batteri. Nonostante i nostri migliori sforzi per prepararli esattamente allo stesso modo ogni volta, ci sono delle fluttuazioni. Ad esempio, i batteri possono essere raccolti mentre si trovano in uno stato di divisione durante la fase di crescita logaritmica e, quindi, essere di dimensioni molto più grandi rispetto ai batteri raccolti nella fase stazionaria. Pertanto, queste semplici differenze nelle dimensioni dei batteri possono portare a cambiamenti nel numero di batteri consumati e a diversi valori di OD₆₀₀ poiché le misurazioni di OD₆₀₀ non distinguono tra le dimensioni. Per questo motivo, includiamo sempre una popolazione di animali di controllo N2 non trattati che fungono da valore di riferimento, impostato su 1 o 100%, per determinare se i gruppi sperimentali mangiano più o meno del controllo N2. Questa pratica consente confronti tra esperimenti, anche se i valori OD₆₀₀ variano.

Intervalli di tempo:

L’utilizzo di valori OD₆₀₀ per misurare l’assunzione di cibo richiede che la concentrazione batterica diminuisca in modo misurabile. Poiché il volume di coltura è molto più grande dei vermi, devono mangiare una quantità significativa di batteri per fare una differenza rilevabile. Rimanere nell’intervallo lineare per i valori di OD₆₀₀ richiede che la concentrazione batterica rimanga compresa tra ~1 mg/mL e 10 mg/mL in modo che una notevole quantità di batteri debba scomparire per rilevarlo. I vermi mangiano di più dalla fine dell’L4 al quarto giorno dell’età adulta a causa della produzione di uova. Pertanto, questo intervallo è l’ideale. Intervalli più brevi come 24 ore possono essere misurati¹¹, ma è considerevolmente più difficile e richiede ~40 pozzetti per condizione. Un’altra opzione per misurare l’assunzione di cibo delle larve è quella di raddoppiare il numero di animali per pozzo. Tuttavia, il problema con questo approccio è che troppi vermi inizieranno a influenzare le letture OD₆₀₀ quando crescono.

Soluzioni stock per i farmaci da testare:

Se farmaci come la serotonina vengono testati per la loro capacità di modulare l’alimentazione, considerare quanto segue quando si preparano le soluzioni stock. Generalmente prepariamo una riserva 50x per i farmaci idrosolubili e aggiungiamo 3 μl a ciascun pozzetto (1:50), ma funzionano anche altre concentrazioni di stock (100x, 300x). Tuttavia, se i farmaci sono diluiti in solventi diversi dall’acqua (ad esempio, DMSO), la concentrazione finale non deve superare lo 0,5%. I solventi diventano rapidamente dannosi per C. elegans. Pertanto, le soluzioni stock di farmaci disciolti in solventi organici come il DMSO devono essere 300x o superiori.

Punteggio di vermi vivi e morti:

La determinazione degli animali vivi e morti si basa sul movimento del verme. La luce forte, in particolare la luce blu, viene utilizzata perché fa muovere gli animali. Inoltre, il punteggio del numero di animali per pozzo rivelerà se ci sono morti in eccesso. Morti in eccesso possono verificarsi con sostanze tossiche o alte concentrazioni (>0,5%) di diversi solventi, incluso il DMSO. In generale, dovrebbero esserci meno di 1:100 (1%) animali morti. Le piastre possono essere agitate per 30 s a 800 giri/min sull’agitatore per piastre per microtitolazione se il cibo si è depositato e la popolazione diventa difficile da contare. Ignora i pozzi con maschi o più di 16 vermi (vedi problemi).

Potenziali problemi:

Agitazione inadeguata:

In un mezzo liquido, i batteri possono facilmente aggregarsi e depositarsi sul fondo dei pozzetti. Nella nostra esperienza, l’agitazione per meno di 20 minuti potrebbe non riuscire a rompere i grumi batterici e risospenderli, causando misurazioni imprecise di OD₆₀₀ . Le misurazioni OD₆₀₀ in presenza di grumi batterici sottostimeranno la concentrazione batterica. Impostazioni eccessive dell’agitatore possono causare l’adesione del liquido al sigillante. Una volta rimosso il sigillante per la lettura OD₆₀₀ , il liquido attaccato al sigillante risulterà in una lettura OD₆₀₀ inferiore. Se c’è del liquido sulla sigillatrice, girare rapidamente la piastra a bassa velocità (500-1.000 giri/min) e agitare di nuovo per 5 minuti. Inoltre, assicurati, come indicato per le letture del giorno 1 e del giorno 4, di leggere entro 10 minuti dallo scuotimento delle piastre per evitare che i batteri si depositino.

Diversi valori assoluti di assunzione di cibo tra gli esperimenti:

Nonostante i nostri migliori sforzi per standardizzare i preparati batterici, spesso differiscono in modi che influenzano l’assunzione di cibo nei vermi. Ad esempio, a causa del loro stato di divisione, i batteri differiscono in dimensioni a seconda che siano stati raccolti nella fase di crescita logaritmica o stazionaria, con i batteri logaritmici più grandi. A causa delle misurazioni OD₆₀₀ che non distinguono tra le dimensioni, le differenze nelle dimensioni del batterio dovute alla fase in cui il batterio è stato raccolto possono portare alle apparenti differenze osservate nell’assunzione di cibo basale tra i preparati batterici. Il modo migliore per confrontare gli esperimenti è includere sempre una popolazione di controllo N2 non trattata e normalizzare i risultati a questa popolazione N2.

Effetti di affollamento:

La concentrazione batterica in questo protocollo è sufficiente per mantenere l’OD₆₀₀ nell’intervallo lineare per 2-16 vermi per pozzetto per ~72 ore. A seconda del farmaco di interesse, un pozzetto contenente più di 16 vermi può esaurire la concentrazione batterica prima della seconda misurazione. Abbiamo anche scoperto che i pozzi con un solo animale tendono ad essere inaffidabili. Il fattore di lisi supera ciò che mangia un singolo verme. Pertanto, piccoli errori nella determinazione del fattore di lisi influenzano in modo sproporzionato i pozzi con meno vermi.

Si consiglia di escludere i pozzi dalle analisi statistiche se è soddisfatta una delle condizioni seguenti. Ci sono maschi nel pozzo (non abbiamo dati che confrontino l’assunzione di cibo tra maschi ed ermafroditi); ci sono meno di 2 vermi nel pozzo o più di 16 vermi nel pozzo; i vermi sono morti alla seconda lettura; o se ci sono progenie nei pozzi perché il FUdR ha fallito. Il FUdR è sensibile al calore e si inattiva anche a temperature fino a 37 °C. Scongelare sempre il FUdR in acqua a temperatura ambiente.

Valori negativi di assunzione di cibo:

I valori di assunzione di cibo sono occasionalmente negativi, suggerendo che il giorno 4 è presente una quantità maggiore di cibo rispetto al giorno 1. Valori negativi di assunzione di cibo possono indicare uno dei seguenti fattori: un alto tasso di autolisi , probabilmente causato da un farmaco aggiunto che agisce sui batteri, o valori negativi di assunzione di cibo, che possono suggerire che il pozzo è contaminato e che sta crescendo qualcosa di diverso dai vermi. I tassi di autolisi aumentano anche con l’avanzare dell’età dei batteri; Pertanto, si consiglia di utilizzare batteri di età non superiore a una settimana. È stato aggiunto un farmaco che precipita nel tempo, influenzando il valore di OD₆₀₀ . Un agitazione insufficiente il giorno 1 può portare a una lettura OD₆₀₀ inferiore a causa di grumi batterici. I vermi sono stati sottoposti a stress ipossico. Ciò si verifica quando il rapporto superficie-aria non è sufficiente per consentire lo scambio di ossigeno. Utilizzare la piastra specifica a 96 pozzetti nei materiali e non superare i 150 μL (120 μL + 30 μL di FUdR) per pozzetto. La distanza tra la superficie del pozzo e il fondo dove vivono i vermi determina la concentrazione di ossigeno.

Limitazioni:

Questo test è limitato alla coltura liquida. I comportamenti alimentari osservati nelle piastre solide, come muoversi su e fuori dai prati alimentari, non possono essere valutati con il test.

Materials

Amphotericin B	RPI	A40030-0.1	solvent: EtOH
Ampicillin	Fisher Scientific	BP176025	solvent: water
Bacto Peptone	BD Biosciences	211677	use to make NGM plates
Carbenicillin	Fisher Scientific	46-100-RG	solvent: water
Cell strainer	Fisher Scientific	22363547	40 µm to remove adults
Cholesterol	MP Biomedicals	02101380-CF	5 mg/mL stock
Difco, Agar, Bacteriological	BD Biosciences	214510	use to make NGM plates
Fluorodeoxyuridine	Sigma Aldrich	F0503	to sterilize worms on L4
Luria Broth	RPI	L24045-1000.0	open capsule, mix with 1 L of water, autoclave
M9 Buffer	Laboratory Prepared		Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L:  15 g Na2HPO4*12H2O (FW: 358) 3 g KH2PO4 (FW: 136)  5 g NaCl (FW: 58), 0.25 g MgSO4*7H2O (FW: 246)  autoclave
Microplate Sealer	Fisher Scientific	236707
OP50	Caenorhabditis Genetics Center
Plate 96-well	Falcon	351172
Plate reader	Tecan	30016056	use 600 nm filter lens
Potassium Citrate, 1 M , pH 6	Laboratory Prepared		Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: 268.8 g Potassium citrate tribasic monohydrate (FW: 324) 26.3 g citric acid monohydrate (FW: 210) 900 mL of dH2O pH to 6 using 5 M KOH autoclave
Potassium Phosphate, 1 M , pH 6	Laboratory Prepared		Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: 136 g KH2PO4 (FW: 136) 900 mL dH2O  pH to 6 using 5 M KOH autoclave
S-Basal	Laboratory Prepared		Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: 5.9 g NaCl (FW: 58)  50 mL 1 M potassium phosphate (pH 6) add 900 mL dH2O autoclave, cool to 55 °C
S-Complete	Laboratory Prepared		Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: Add to 1 L of S-basal (cooled to 55 °C or RT)  10 mL of 1 M potassium citrate  pH 6, 10 mL of trace metal solutions  3 mL of 1 M CaCl2 3 mL of 1 M MgSO4
Serotonin hydrochloride	Thermo Scientific	AAB2126309	used at 5 mM
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S7653-5KG	to make buffers and NGM plates
Terrific Broth	Thermo Scientific	J75856-A1	12.5 g in 250 mL of water, autoclave
Titer plate Shaker	Thermo Scientific	88880023	shaken at 800 rpm, depends on shaker
Trace Metals Solution	Laboratory Prepared		Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: 1.86 g Na2EDTA (FW: 372.24) 0.69 g FeSO4*7H2O (FW: 278)  0.20 g MnCl2*4H2O (FW: 198) 0.29 g ZnSO4*7H2O (FW: 287)  0.016 g CuSO4 (FW: 158) autoclave wrap in aluminum foil to keep in the dark