Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

توصيف أنظمة تدفق الأدوية المتعددة في الراكدة البوماني باستخدام سلالة بكتيرية تعاني من نقص التدفق ونظام التعبير الجيني أحادي النسخة

Published: January 5, 2024 doi: 10.3791/66471
Automatic Translation
1, 1
1Department of Microbiology, University of Manitoba

Summary

وصفنا إجراء سهلا لتكملة الكروموسومات أحادية النسخة لجين مضخة التدفق باستخدام نظام تعبير صغير قائم على Tn7 في سلالة مهندسة تعاني من نقص التدفق من Acinetobacter baumannii. تسمح هذه الأداة الجينية الدقيقة بالتعبير الجيني الخاضع للرقابة ، وهو أمر أساسي لتوصيف مضخات التدفق في مسببات الأمراض المقاومة للأدوية المتعددة.

Abstract

يتم التعرف على Acinetobacter baumannii كممرض صعب سالبة الجرام بسبب مقاومته الواسعة للمضادات الحيوية. من الأهمية بمكان فهم الآليات الكامنة وراء هذه المقاومة لتصميم خيارات علاجية جديدة وفعالة. لسوء الحظ ، فإن قدرتنا على التحقيق في هذه الآليات في A. baumannii يعوقها ندرة أدوات التلاعب الجيني المناسبة. هنا ، نصف طرق استخدام نظام قائم على الكروموسومات المصغرة Tn7 لتحقيق التعبير الجيني أحادي النسخة في سلالة A. baumannii التي تفتقر إلى آليات التدفق الوظيفية من نوع RND. يعد إدخال نسخة واحدة وتعبير مضخة التدفق المستحث مفيدا جدا ، حيث أن وجود operons تدفق RND على البلازميدات ذات العدد العالي غالبا ما تتحمله الخلايا البكتيرية بشكل سيئ. علاوة على ذلك ، فإن دمج متجهات التعبير الصغيرة Tn7 المؤتلفة في كروموسوم مضيف بديل A. baumannii مع زيادة حساسية التدفق يساعد على التحايل على التداخل من مضخات التدفق الأخرى. هذا النظام ذو قيمة ليس فقط للتحقيق في مضخات التدفق البكتيري غير المميزة ولكن أيضا لتقييم فعالية المثبطات المحتملة التي تستهدف هذه المضخات.

Introduction

Acinetobacter baumannii هو أحد مسببات الأمراض ذات الأولوية القصوى لمنظمة الصحة العالمية نظرا لمقاومته الشاملة لجميع فئات المضادات الحيوية1. إنه ممرض انتهازي يؤثر في الغالب على الأشخاص في المستشفى أو المصابين أو الذين يعانون من نقص المناعة. A. baumannii يتهرب إلى حد كبير من المضادات الحيوية عن طريق مضخات التدفق ، وأكثرها صلة هي عائلة مصدري قسم المقاومة (RND)2. إن فهم كيفية عمل مضخات التدفق هذه ميكانيكيا سيسمح للمرء بتطوير خيارات علاجية مستهدفة.

إحدى الطرق الشائعة التي يمكن من خلالها تمييز العمليات الخلوية على وجه التحديد هي من خلال التلاعب الجيني. ومع ذلك ، فإن الأدوات المتاحة للدراسات الجينية A. baumannii محدودة ، ولزيادة إرباك التصميم التجريبي ، غالبا ما تكون العزلات السريرية مقاومة للمضادات الحيوية المستخدمة بشكل روتيني للاختيار في التلاعب الجيني3. العقبة الثانية التي تمت مواجهتها عند دراسة مضخات التدفق على وجه التحديد هي أنها منظمة بشكل صارم - غالبا بعوامل غير معروفة - مما يجعل من الصعب عزل الوظيفة بدقة وعزوها إلى مضخة واحدة4. نظرا لهذه الحاجة إلى توسيع صندوق أدوات البحث ، قمنا بتطوير نظام تعبير قابل للحث قائم على TN7 ، وإدراج نسخة واحدة ، يشتمل على كاسيت هدف Flp recombinase (FRT) ، والذي يسمح بإزالة علامة التحديد5،6،7 (الشكل 1). تم إنشاء نظام الاستنساخ والتعبير الأنيق هذا لأول مرة ل Pseudomonas8،9،10 ، وقد تم استخدامه لتوليد مكملات مضخة تدفق أحادية النسخة في سلالة تعاني من نقص مضخة تدفق RND من A. baumannii (ATCC 17978::ΔadeIJK ، ΔadeFGH ، ΔadeAB: يشار إليها فيما يلي باسم A. baumannii AB258) التي أنشأناها11. القدرة على دراسة مضخة تدفق واحدة في كل مرة وعدم إرباك الخلايا البكتيرية بتعبير عالي النسخ (كما هو موضح عموما مع أنظمة التعبير القائمة على البلازميد) ، يمكن للمرء أن يتعلم بشكل أفضل عن الجوانب الفسيولوجية الحرجة لكل مضخة تدفق مع الحد الأدنى من التداخل وتقليل المضاعفات.

توضح هذه المقالة كيفية استخدام نظام mini-Tn7 لاستكمال جين محذوف من الأهمية ، مضخة تدفق RND adeIJK ، في كروموسوم A. baumannii AB258 من خلال سلسلة من الخطوات غير المعقدة التي يتم إجراؤها على مدار 9 أيام7. تعيد المجموعة الأولى من الخطوات إدخال جينات مضخة التدفق المحذوفة المستنسخة في بلازميد الإدخال المصغر القائم على Tn7 (الشكل 2A) في موقع إدخال attTn7 الفردي في اتجاه مجرى جين glmS المحفوظ جيدا (الشكل 3A). يتم تسهيل هذه العملية من خلال بلازميد مساعد غير متماثل (الشكل 2 ب) يشفر جينات الترانسبوزاز اللازمة للإدخال المدفوع ب Tn7. تستخدم المجموعة الثانية من الخطوات بلازميد الاستئصال (الشكل 2C) لإزالة جين الجنتاميسين بوساطة Flp المجاور بمواقع FRT (الشكل 3B) لإنشاء سلالة غير مميزة. على الرغم من أن هذا النظام يستخدم لتوضيح الأدوار الأساسية والمثبطات المحتملة لمضخات تدفق RND فيما يتعلق بمقاومة المضادات الحيوية ، إلا أنه يمكن استخدامه للتحقيق في أي جين مهم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. التحضير التجريبي

  1. تنقية البلازميد pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm9 (إدخال البلازميد ، الشكل 2A) مع الجين محل الاهتمام.
    ملاحظة: هنا ، الجين محل الاهتمام هو adeIJK. يجب أن يكون تركيز البلازميد النهائي ≥100 نانوغرام / ميكرولتر.
  2. تنقية البلازميد المساعد (pTNS2)9 وبلازميد الاستئصال (pFLP2ab)6 (الشكل 2B ، C ، على التوالي) ، من الناحية المثالية إلى تركيز الحمض النووي البلازميد النهائي من ≥100 نانوغرام / ميكرولتر.
  3. تحضير 50 مل من الماء المعقم عالي النقاء و 25 مل من مرق LB المعقم (Lennox) (انظر جدول المواد).
  4. قم بإعداد ما لا يقل عن 10 ألواح أجار رطل ، ولكل منها الإضافات التالية: عادي (بدون إضافات) ، جنتاميسين (جرام) عند 50 ميكروغرام / مل ، كاربينيسيلين (Cb) عند 200 ميكروغرام / مل (للاختيار عبر جين مقاومة الأمبيسلين) ، وسكروز 5٪ (انظر جدول المواد).
  5. قم بإخراج السلالة المراد استخدامها للإدخال على أجار LB واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 16-18 ساعة. هنا ، يتم استخدام A. baumannii AB258.
    ملاحظة: يجب تنفيذ هذا البروتوكول في بيئة معقمة قدر الإمكان باستخدام موقد بنسن على المقعد أو خزانة السلامة البيولوجية. يجب أن تكون جميع المواد الاستهلاكية (أطراف الماصة ، وحلقات التلقيح ، وأنابيب microfuge ، وما إلى ذلك) معقمة.

2. إعداد الثقافة

  1. قم بتلقيح مستعمرة واحدة من A. baumannii AB258 إلى 4 مل من مرق LB في أنبوب استزراع معقم سعة 13 مل باستخدام حلقة تلقيح معقمة أو عصا تلقيح خشبية معقمة.
    ملاحظة: يتم استخدام مزرعة واحدة سعة 4 مل لعينة واحدة وعنصر تحكم واحد. زيادة عدد الثقافات اعتمادا على عدد العينات المطلوبة.
  2. احتضان بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية مع الهز (250 دورة في الدقيقة).
  3. ضع زجاجة من الماء المقطر المعقم (25-50 مل) على حرارة 4 درجات مئوية طوال الليل لاستخدامها في الخطوة 3.

3. إعداد الخلايا الكهربائية

  1. ضع جميع أنابيب الميكروفوج المعقمة سعة 1.5 مل (اثنان لكل مزرعة) وأنابيب التثقيب الكهربائي المعقمة (اثنان لكل مستزرع) على الجليد (انظر جدول المواد). احتفظ بالعينات على الثلج قدر الإمكان طوال العملية.
  2. ضع زجاجة الماء المعقم التي تم تخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية على الثلج.
  3. انقل 1.5 مل من المستزرع البكتيري الليلي إلى أحد أنابيب الميكروفوج سعة 1.5 مل.
  4. أجهزة الطرد المركزي في 13000 × غرام لمدة 2 دقيقة لبيليه الخلايا.
    ملاحظة: من الأفضل إجراء الطرد المركزي عند 4 درجات مئوية ، لكن الطرد المركزي في درجة الحرارة المحيطة مقبول وليس ضارا.
  5. باستخدام ماصة سعة 1 مل ، قم بإزالة كل المادة الطافية دون إزعاج حبيبات الخلية.
  6. أضف 1.5 مل أخرى من المستنبتة البكتيرية إلى نفس أنبوب الميكروفوج (microfuge). أجهزة الطرد المركزي في 13000 × غرام لمدة 2 دقيقة ، ثم إزالة كل من طاف .
  7. كرر الخطوة 3.6 مرة أخيرة مع 1 مل المتبقية من الثقافة.
  8. أضف 1 مل من الماء المعقم المثلج إلى حبيبات الخلية وأعد تعليقها بسحب لطيف حتى تختفي الحبيبات في قاع أنبوب الميكروفوج .
  9. أجهزة الطرد المركزي الخلايا المعاد تعليقها عند 13000 × جم لمدة 2 دقيقة.
  10. قم بإزالة المادة الطافية بعناية باستخدام ماصة سعة 1 مل. لا تصب المادة الطافية ، خاصة في خطوات الغسيل اللاحقة عندما تميل الخلايا إلى تكوين كريات أقل إحكاما.
  11. كرر خطوة الغسيل هذه بالماء المعقم المثلج ، الخطوات 3.8 إلى الخطوة 3.10 ، مرتين أخريين.
  12. أعد تعليق حبيبات الخلية النهائية برفق في 200 ميكرولتر من الماء المعقم المثلج.
  13. نقل 100 ميكرولتر من معلق الخلية النهائي إلى أنبوب الميكروفوج الثاني المثلج سعة 1.5 مل. ستصبح هذه القسمة الثانية هي التحكم السلبي في التثقيب الكهربائي. احتفظ بعينات الخلايا على الجليد.

4. التثقيب الكهربائي

  1. قم بالتسخين المسبق 1 مل من مرق LB وطبق أجار LB + Gm50 (محضر في الخطوة 1.4) لكل عينة والتحكم في حاضنة ثابتة مضبوطة على 37 درجة مئوية.
  2. في حجم مجمع يبلغ 5 ميكرولتر أو أقل ، أضف 100-200 نانوغرام لكل من البلازميد المساعد pTNS2 وبلازميد إدخال pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm-adeIJK إلى حصة من الخلايا المختصة كهربائيا.
  3. امزجه بنقرة لطيفة بأطراف الأصابع لضمان الخلط الكامل للبلازميدات مع الخلايا المختصة كهربائيا دون إدخال فقاعات.
  4. أضف حجما مكافئا من الماء المقطر المعقم إلى قسمة خلية التحكم السلبية واخلطها برفق على النحو الوارد أعلاه.
  5. احتضان العينات على الجليد لمدة 20 دقيقة.
  6. انقل عينة الخلية بأكملها إلى كوفيت التثقيب الكهربائي المثلج ، ثم ضع الكوفيت مرة أخرى على الثلج. كرر لعينة خلية التحكم السالبة.
  7. إلكتروبور عينة الخلية.
    1. قم بتشغيل جهاز الحفر الكهربائي واضبطه على 2.0 كيلو فولت (25 μF ، 200 Ω) (انظر جدول المواد).
    2. امسح سطح الكوفيت بمنديل رخو لإزالة أي ثلج أو رطوبة ملتصقة.
    3. أدخل الكوفيت في جهاز الحفر الكهربائي وقم بتوصيل الصدمة الكهربائية.
    4. أضف على الفور 0.9 مل من مرق LB المسخن مسبقا إلى الخلايا الموجودة في الكوفيت وماصة بلطف لأعلى ولأسفل لخلط الخلايا مع الوسائط.
    5. انقل معلق الخلية بالكامل إلى أنبوب معطل دقيق جديد سعة 1.5 مل (درجة حرارة الغرفة).
    6. تحقق من قيمة الوقت الثابت على الكهربائي ؛ للحصول على أفضل النتائج ، يجب أن تكون هذه القيمة بين 4 و 6.
  8. كرر إجراء التثقيب الكهربائي (الخطوات 4.7.1 إلى 4.7.6) لعينة خلية التحكم السالبة.
  9. احتضان العينات الكهربائية عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة عند 250 دورة في الدقيقة للسماح باستعادة الخلايا.
  10. باستخدام موزع التلقيح ، انشر 100 ميكرولتر من كل عينة خلية كهربائية على لوحة أجار LB + Gm50 تم تسخينها مسبقا.
    1. أجهزة الطرد المركزي العينات المتبقية في 13000 × غرام لمدة 2 دقيقة لبيليه الخلايا.
    2. بعد إزالة كل المادة الطافية باستخدام ماصة ، أعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من مرق LB.
    3. انشر كل عينة كاملة على ألواح أجار فردية LB + Gm50 تم تسخينها مسبقا.
      ملاحظة: يمكن أن تعتمد كفاءة التثقيب الكهربائي على الإجهاد. عند التفريغ الكهربائي لسلالة لأول مرة ، قد يكون من المفيد إخراج أحجام مختلفة ، أو حتى تخفيفات ، من عينة التثقيب الكهربائي للتأكد من أن الألواح الناتجة لها مستعمرات معزولة.
  11. احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية لمدة 16-18 ساعة.

5. اختيار المستعمرات المحولة للفحص القائم على تفاعل البوليميراز المتسلسل

  1. تحقق من لوحات التثقيب الكهربائي. يجب ألا يكون للسيطرة السلبية مستعمرات. يجب أن تحتوي العينة على مستعمرات متميزة.
    ملاحظة: يمكن تخزين الألواح ذات المستعمرات ، في هذه الخطوة وفي جميع الخطوات اللاحقة حيث يتم إنتاج ألواح أجار ذات مستعمرات أو بقع ، عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 3 أيام قبل المتابعة.
  2. باستخدام أعواد أسنان معقمة ، التقط ما يصل إلى 10 مستعمرات مفردة من ألواح أجار LB + Gm50 وقم بتصحيحها على لوحة أجار LB + Gm50 جديدة.
  3. احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية لمدة 16-18 ساعة.

6. التحقق من إدخال الكروموسومات بواسطة مستعمرة PCR

  1. قم بإزالة ألواح أجار LB + Gm50 التي تحتوي على المستعمرات المرقعة من الحاضنة.
  2. باستخدام عود أسنان معقم أو طرف ماصة معقم ، قم بإزالة جزء صغير (بحجم مستعمرة كبيرة) من رقعة إلى 20 ميكرولتر من الماء المقطر المعقم في أنبوب PCR سعة 0.2 مل ؛ تخلط جيدا. يجب أن تصبح عينة الماء غائمة بشكل واضح حيث يتم إطلاق الخلايا من المسواك. قم بإعداد أي عدد من العينات التي تحتاج إلى فحص ، ولكن يجب أن تكون 6 كافية.
  3. احتضان أنبوب PCR الذي يحتوي على المعلق البكتيري عند 100 درجة مئوية لمدة 5-10 دقائق.
  4. باستخدام جهاز طرد مركزي صغير (انظر جدول المواد) ، قم بتدوير العينة بالسرعة القصوى الثابتة لمدة 2 دقيقة لحبيبات الحطام الخلوي.
  5. انقل المادة الطافية إلى أنبوب PCR جديد سعة 0.2 مل وضعه على الثلج. تحتوي هذه العينة على قالب الحمض النووي لتفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل.
    ملاحظة: يمكن تخزين هذا القالب DNA عند -20 درجة مئوية قبل متابعة تفاعل البوليميراز المتسلسل.
  6. تحضير خليط تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل الذي يحتوي على 1x بوليميراز المخزن المؤقت ، 200 μM dNTPs ، 0.18 μM ABglmS2_F_New التمهيدي الأمامي ، 0.18 μM Tn7R التمهيدي العكسي (الجدول 1) ، 1 U من Taq DNA polymerase ، و 1 μL من DNA القالب المحضر بحجم إجمالي 25 ميكرولتر. قم بإعداد عنصر تحكم بدون قالب (NTC) ، بما في ذلك كل ما عدا قالب الحمض النووي (انظر جدول المواد).
  7. أدخل ظروف التفاعل في دورة حرارية: 95 °C لمدة 2 دقيقة ؛ 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 49 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية لما مجموعه 35 دورة ؛ 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ؛ عقد 12 درجة مئوية. قم بتشغيل العينات.
  8. بعد إضافة صبغة تحميل الحمض النووي إلى تركيز نهائي قدره 1x ، قم بتحميل 10 ميكرولتر من كل تفاعل PCR على هلام أغاروز 2٪ وقم بتشغيله عند 80 فولت لمدة 40 دقيقة. حجم amplicon المتوقع لهذا الزوج التمهيدي هو 382 bp. يجب ألا يكون للمجلس الوطني الانتقالي نطاقات.
  9. تحديد العينات التي أنتجت منتج PCR المتوقع. قم بإعداد لوحة خط على ألواح أجار LB + Gm50 من أي من بقع PCR الإيجابية ؛ احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 16-18 ساعة. الهدف هو إنشاء صفيحة ذات مستعمرات مفردة لإعداد مخزون الجلسرين للحفاظ على هذه السلالة المميزة وكنقطة انطلاق لإنشاء سلالة غير مميزة (موصوفة أدناه).

7. إزالة علامة GmR باستخدام pFLP2ab

  1. اتبع الإجراء المذكور في الخطوة 2: إعداد الثقافة. العينة المستخدمة لإعداد الاستزراع الليلي هي مستعمرة واحدة من ألواح أجار LB + Gm50 معدة لتوليد مستعمرات منفصلة في الخطوة 6.9.
  2. اتبع الإجراء المذكور في الخطوة 3: تحضير الخلايا الكهربية. تحضير الخلايا من الثقافة بين عشية وضحاها للتثقيب الكهربائي.
  3. اتبع الإجراء المذكور في الخطوة 4: التثقيب الكهربائي. هنا ، البلازميد الذي يجب إدخاله إلى الخلايا هو pFLP2ab (100-200 نانوغرام) ، والذي سيزيل جين مقاومة الجنتاميسين ، ويحيط بالجين الذي تم إدخاله في الكروموسومات محل الاهتمام.
  4. بعد تعافي الخلايا لمدة ساعة واحدة (الخطوة 4.9) ، انشر 100 ميكرولتر من عينة الخلية الكهربائية على صفيحة أجار LB + Cb200 تم تسخينها مسبقا (محضرة في الخطوة 1.4). يضمن هذا الضغط الانتقائي أن الخلايا التي تؤوي بلازميداستئصال pFLP2 ab فقط هي التي تنمو.
  5. احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية لمدة 16-18 ساعة.
  6. تحقق من لوحة المستعمرات. يجب ألا تحتوي لوحة التحكم السلبية على مستعمرات ؛ يجب أن تحتوي لوحة عينة أجار LB + Cb200 على مستعمرات متميزة.
  7. باستخدام أعواد أسنان معقمة ، قم بتصحيح ما يصل إلى 20 مستعمرة معزولة على صفيحة أجار LB + Cb200 وصفيحة أجار LB + Gm50 .
  8. احتضان الألواح لمدة 16-18 ساعة عند 37 درجة مئوية.
  9. تحقق من اللوحات بحثا عن بقع. المستنسخة التي تنمو على صفيحة أجار LB + Cb200 ولكن ليس صفيحة أجار LB + Gm50 تمت إزالة جين مقاومة الجنتاميسين من الإدخال الأصلي.
  10. حدد البقع المقاومة للكاربينيسيلين والجنتاميسين المعرضة للخطوط على ألواح أجار LB الفردية المكملة ب 5٪ (وزن / حجم) من السكروز ، مما يفرض طرد بلازميد pFLP2ab من البكتيريا. اختر ما يصل إلى 10 مستعمرات.
  11. احتضان الألواح لمدة 16-18 ساعة عند 37 درجة مئوية.
  12. تحقق من لوحات المستعمرات.
  13. كتأكيد نهائي لفقدان البلازميد pFLP2ab ، عبر التصحيح 4-6 مستعمرات معزولة من ألواح السكروز 5٪ على صفيحة أجار LB + Cb200 وصفيحة أجار LB.
  14. احتضان الألواح لمدة 16-18 ساعة عند 37 درجة مئوية.
  15. اختر نسخة تنمو على صفيحة أجار LB ، وهي حساسة للكاربينيسيلين لإعداد مخزون الجلسرين للحفاظ على هذه السلالة غير المميزة.
    1. يمكن إجراء التحقق الجيني من السلالة غير المميزة باستخدام مستعمرة PCR (الخطوة 6: التحقق من إدخال الكروموسومات بواسطة مستعمرة PCR) باستخدام البادئات التي تستهدف جين مقاومة الجنتاميسين.
    2. تحضير خليط تفاعل تفاعل تفاعل PCR يحتوي على 1x بوليميراز عازلة ، 200 ميكرومتر dNTPs ، 0.18 ميكرومتر Gm_F التمهيدي الأمامي ، 0.18 ميكرومتر Gm_R التمهيدي العكسي (الجدول 1) ، 1 U من Taq DNA polymerase ، و 1 μL من DNA القالب المحضر بحجم إجمالي 25 ميكرولتر. إعداد عنصر تحكم بدون قالب (NTC) بما في ذلك كل ما عدا قالب الحمض النووي ، والتحكم الإيجابي باستخدام الحمض النووي من السلالة الملحوظة.
    3. أدخل ظروف التفاعل في دورة حرارية: 95 °C لمدة 2 دقيقة ؛ 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 50 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 72 درجة مئوية لمدة 40 ثانية لما مجموعه 35 دورة ؛ 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ؛ عقد 12 درجة مئوية. قم بتشغيل العينات.
    4. بعد إضافة صبغة تحميل الحمض النووي إلى تركيز نهائي قدره 1x ، قم بتحميل 10 ميكرولتر من كل تفاعل PCR على هلام أغاروز 1٪ وقم بتشغيله عند 80 فولت لمدة 40 دقيقة. حجم amplicon المتوقع لهذا الزوج التمهيدي هو 525 نقطة أساس. يجب أن يكون للتحكم الإيجابي نطاق واحد ؛ يجب ألا يكون للعينات والمجلس الوطني الانتقالي نطاقات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يستغرق إجراء إدخال الكروموسومات 2 ساعة فقط إجمالا خلال 3 أيام لرؤية مستعمرات النتيجة تنمو على صفيحة أجار انتقائية (الشكل 1A-C). يعتمد العدد المتوقع للمستعمرات على لوحة التحويل على الإجهاد: يمكن للمرء أن يرى 20-30 أو حتى مئات المستعمرات حيث أن إدخال Tn7 في مواقع attTn7 محدد وفعال9. يحافظ ترقيع مستعمرات صفيحة التحويل على وسائط انتقائية (الشكل 4 أ) على السلالة المحولة ويوفر مادة أولية لفحص تفاعل البوليميراز المتسلسل للمستعمرة (الشكل 1E والشكل 4 ب). يمكن الاحتفاظ بفحص المستعمرات بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى الحد الأدنى - لا ينبغي معالجة أكثر من 10 مستعمرات ، ويجب أن يسفر معظمها عن نتيجة إيجابية للإدخال. منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل لبادئات الفحص ، ABglmS2_F_New و Tn7R (الجدول 1) ، هو 382 نقطة أساس (الشكل 4B حارة 4) ؛ تشمل الضوابط السلبية للتفاعل النوع البري A. baumannii ATCC 17978 (الشكل 4B حارة 2) ، AB258 (الشكل 4B حارة 3) ، ولا يوجد قالب (الشكل 4B حارة 5). تمثل المستعمرات الإيجابية لتفاعل البوليميراز المتسلسل سلالات مكملة وملحوظة.

تستغرق إزالة جين مقاومة الجنتاميسين (غير العلامات) أقل من 3 ساعات ، وتمتد 6 أيام حيث يجب اختيار الخلايا التي تتحول مع بلازميد الاستئصال من خلال الطلاء الانتقائي ، ومن ثم يحتاج بلازميد الاستئصال إلى الشفاء من البكتيريا (الشكل 1F). الاستئصال القائم على إعادة التركيب Flp-FRT دقيق وفعال ويجب أن يؤدي إلى ≥20 مستعمرة على لوحة التحويل. يجب أن تكون المستعمرات التي يتم ترقيعها على الكربينيسيلين (اختيار مقاومة β لاكتام التي يمنحها بلازميد الختان) والجنتاميسين (تبحث عن فقدان مقاومة الجنتاميسين) مقاومة للكاربينيسيلين وحساسة للجنتاميسين ، على التوالي. يتم إجبار بلازميد الاستئصال على الخروج من البكتيريا عن طريق النمو على ألواح أجار السكروز بنسبة 5٪. النمو على السكروز يجبر الخلايا على القضاء على pFLP2ab لأن جين sacB على البلازميد يعزز تحويل السكروز إلى ليفان ، وهو عديد السكاريد السام للبكتيريا12,13. يجب أن تنمو جميع المستعمرات التي تنمو على وسائط السكروز بنسبة 5٪ فقط على ألواح أجار LB عادية ؛ يجب ألا يكون هناك نمو على ألواح أجار كاربينيسيلين. تمثل المستعمرات التي تنمو على صفائح أجار LB العادية سلالات غير مميزة. يمكن تحقيق تأكيد فقدان علامة الجنتاميسين عن طريق مستعمرة PCR باستخدام Gm_F وبادئات Gm_R (الجدول 1 والشكل 5). ينتج هذا الزوج التمهيدي amplicon من 525 bp فقط في السيطرة الإيجابية (سلالة ملحوظ تم إنشاؤها في البداية ، الشكل 5 حارة 4) ؛ يجب ألا يظهر ATCC 17978 من النوع البري (الشكل 5 حارة 2) ، AB258 (الشكل 5 حارة 3) ، أي مستعمرة تم اختبارها (الشكل 5 حارة 5) ، وعنصر التحكم بدون قالب (الشكل 5 حارة 6) تضخيما.

بمجرد تأكيد السلالة غير المميزة ، يمكن أن يبدأ الاختبار الوظيفي بمقايسات النمط الظاهري. هنا ، الخيار الأول الواضح هو تحديد الحد الأدنى للتركيز المثبط (MIC) لمجموعة من المضادات الحيوية: سيبروفلوكساسين هو ركيزة معروفة من AdeIJK ، ويمكن إزالة التتراسيكلين بواسطة AdeIJK (مضخة التدفق الرئيسية هي AdeAB) ، والكاناميسين له تأثير طفيف نسبيا على A. baumannii ATCC 17978 2,14. باستخدام طريقة التخفيف الدقيق للمرق وفقا لإرشادات CLSI15 ، تم تحدي السلالة غير المميزة المتممة AB258::adeIJK مع كل مضاد حيوي في غياب ووجود 50 ميكرومتر IPTG. تم تضمين السلالة البرية ATCC 17978 والسلالة التي تعاني من نقص تدفق RND AB258 كضوابط (الجدول 2). بشكل عام ، يخبرنا الاتجاه الذي شوهد في قيم MIC بانخفاض حساسية القصة المتوقعة ل AB258::adeIJK للسيبروفلوكساسين والتتراسيكلين مع التعبير المستحث لمضخة التدفق ، مما يؤكد أن إدخال adeIJK كان ناجحا.

Figure 1
الشكل 1: نظرة عامة على الإجراء. (أ) يتم تحضير مزرعة ليلية لسلالة A. baumannii لاستكمالها. (ب) تغسل خلايا مزرعة الليل بالماء 3 مرات عن طريق الطرد المركزي وتحفظ على الجليد. (ج) تضاف بلازميدات التوصيل والبلازميدات المساعدة إلى الخلايا وتحتضن على الجليد لمدة 20 دقيقة. يتم حفر العينة بالكهرباء ، وتتم إضافة وسائط LB ، ويسمح للخلايا بالتعافي لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. يتم نشر حصة 100 ميكرولتر من الخلايا على ألواح أجار LB + Gm50 ويتم حضنها عند 37 درجة مئوية طوال الليل. (د) يتم ترقيع المستعمرات من لوحة التحويل على صفيحة أجار LB + Gm50 وتنمو طوال الليل عند 37 درجة مئوية. (ه) يتم تحضير المستعمرات المرقعة لفحص تفاعل البوليميراز المتسلسل لفحص وجود منتج تضخيم يمتد عبر موقع إدخال الكروموسومات. يتم تصور تضخيم PCR بواسطة الرحلان الكهربائي هلام الأغاروز. تمثل العينات الإيجابية لتفاعل البوليميراز المتسلسل الإدخال الناجح للجين محل الاهتمام في الكروموسوم وإنشاء سلالة ملحوظة. (F) يتم تحضير مستعمرة موجبة للجنتاميسين كما في الخطوات (A-C) ، مع التثقيب الكهربائي لبلازميد pLFP2ab لإزالة كاسيت الجنتاميسين من إدخال الكروموسومات. الطلاء الانتقائي على LB + Cb200 أجار يؤكد امتصاص البلازميد. يكشف الترقيع المكرر على ألواح أجار LB + Cb200 و LB + Gm50 عن مستعمرات CbR و GmS تؤكد فقدان كاسيت الجنتاميسين من الإدراج. نمو مستعمرات CbR المختارة على 5٪ سكروز يعالج بلازميد pLFP2ab من الخلايا. يتم ترقيع المستعمرات من صفيحة السكروز بنسبة 5٪ على LB + Cb200 agar و LB agar للكشف عن مستعمرات CbS و GmS المرغوبة وتأكيد إنشاء السلالة غير المميزة. جم50 ، جنتاميسين عند 50 ميكروغرام / مل ؛ Cb200 ، كاربينيسيلين عند 200 ميكروغرام / مل ؛ R ، مقاومة. S ، حساسة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: البلازميدات المستخدمة في هذا البروتوكول. خرائط البلازميد العامة ل (A) pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm (بلازميد الإدراج) ، (B) pTNS2 (البلازميد المساعد) ، و (C) pFLP2ab (بلازميد الختان). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: رسم تخطيطي للإدراج وإلغاء العلامات. (أ) الإدراج. يقع موقع إدخال Tn7 الفردي في كروموسوم A. baumannii على بعد 24 نقطة أساس من نهاية جين glmS2 . يسمح التثقيب الكهربائي المشترك لبلازميد الإدخال والبلازميد المساعد باستكمال الجين محل الاهتمام (الجين المدرج ، الأرجواني) جنبا إلى جنب مع بقية شريط الإدخال (مواقع FRT لاستئصال العلامة ، الأصفر ؛ جين accC1 لمقاومة الجنتاميسين ، أخضر ؛ lacIq الجين للتعبير المستحث ، الأزرق) في الكروموسوم. (ب) رفع العلامات. يسهل التثقيب الكهربائي لسلالة الإدخال التكميلية والملحوظة مع بلازميد استئصال pFLP2ab إزالة جين مقاومة الجنتاميسين (accC1 ، الأخضر) عبر إعادة تركيب Flp-FRT (مواقع FRT ، صفراء) ، مما يخلق سلالة غير مميزة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تأكيد التحويل والترقيع والإدراج بواسطة مستعمرة PCR. نتيجة تمثيلية ل (أ) نمو مستعمرات التحول بعد الترقيع ، و (ب) تضخيم مستعمرة تفاعل البوليميراز المتسلسل مع ABglmS_F_New (رمادي) و Tn7R (برتقالي) بادئات لتأكيد إدخال الكروموسومات. الحارة 1: سلم الحمض النووي منخفض الوزن الجزيئي ؛ حارة 2: ATCC 179798 ؛ حارة 3: AB258 ؛ حارة 4: AB258::adeIJK-LAC-Gm; الحارة 5: التحكم بدون قالب. تم تصنيف النطاق المتوقع البالغ 382 نقطة أساس. لاحظ أنه يمكن أيضا استخدام البادئات الخاصة بالجنتاميسين (Gm_F و Gm_R ، الأخضر) لتأكيد إدخال الكروموسومات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: تأكيد فقدان العلامة بواسطة مستعمرة PCR. نتيجة تمثيلية لتضخيم PCR للمستعمرة باستخدام مواد أولية خاصة بالجنتاميسين (Gm_F و Gm_R) لتأكيد فقدان علامة المضادات الحيوية عن طريق الاستئصال القائم علىpFLP ab. الحارة 1: سلم الحمض النووي منخفض الوزن الجزيئي ؛ حارة 2: ATCC 179798 ؛ حارة 3: AB258 ؛ حارة 4: AB258::adeIJK-LAC-Gm; حارة 5: AB258::adeIJK ؛ الحارة 6: التحكم بدون قالب. تم تصنيف النطاق المتوقع البالغ 525 نقطة أساس. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

السلالات والبلازميدات والبادئات الخصائص ذات الصلة مرجع
وصمه عار
أ. بوماني ATCC 17978 سلالة النوع أتش تيه تي سي
أ. بوماني ATCC 17978 AB258 ΔadeAB,Δ adeFGH,Δ adeIJK 11
البلازميدات
pUC18T-miniTn7T-Gm-LAC جي إمآر ، أمبيرآر 9
pUC18T-miniTn7T-Gm-LAC-adeIJK جي إمآر ، أمبيرآر ، أديجك هذه الدراسة
pTNS2 أمبيرص 9
pFLP2أب pWH1266 الأصل أو النسخ المتماثل ، sacB ، AmpR 7
الاشعال التسلسل (5′–3′)
ABglmS_F_New CACAGCATAACTGGACTGATTTC 7
Tn7R TATGGAAGAAGTTCAGGCTC 7
Gm_F TGGAGCAGCAACGATGTTAC هذه الدراسة
Gm_R TGTTAGGTGGCGGTACTTGG هذه الدراسة

الجدول 1: السلالات البكتيرية والبلازميدات والبادئات المستخدمة في هذا البروتوكول. جنرال موتورز ، جنتاميسين. أمبير ، الأمبيسلين. R ، مقاومة.

سيبروفلوكساسين التتراسيكلين كاناميسين
إيبتج − + − + − +
ATCC 17978 0.250 الثانية 0.500 الثانية 1.5 الثانية
AB258 0.031 الثانية 0.063 الثانية 4 الثانية
AB258 :: أديجك 0.016 0.063 0.031 0.125 8 2
أضعاف التغيير 4.01 4.03 0.25

الجدول 2: اختبار وظائف الجينات المدرجة عن طريق الحساسية للمضادات الحيوية. مقارنة قيم الحد الأدنى للتركيز المثبط (MIC) ل A. baumannii ATCC 17978 و AB258 غير المستحث :: adeIJK و AB258::adeIJK الناجم عن IPTG مقابل سيبروفلوكساسين والتتراسيكلين والكاناميسين. تغيير الطي = المستحث (+ IPTG) / غير المستحث (- IPTG) ؛ الثانية = غير محدد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

على الرغم من أن هذا الإجراء الخاص بالإدخال الكروموسومي لنظام التعبير الجيني أحادي النسخة القابل للحث في A. baumannii واضح تقنيا وليس كثيف العمالة ، إلا أن هناك بعض الخطوات المهمة التي يجب التأكيد عليها. أولا ، يجب أن يتم تحضير الخلايا المختصة على الجليد قدر الإمكان حيث تصبح الخلايا هشة أثناء استبدال الوسائط بالماء المثلج. من الناحية المثالية ، يتم تنفيذ خطوات الطرد المركزي عند 4 درجات مئوية ، ولكن الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة مقبول. نظرا للهشاشة المتزايدة للخلايا أثناء غسل الماء ، فإن السحب اللطيف أمر بالغ الأهمية أيضا. ثانيا ، التثقيب الكهربائي حساس لوجود الأيونات. يضمن غسل الخلايا بجولات متعددة من التكوير وتعليقها في الماء إزالة الوسائط بالكامل. أيضا ، يجب تنقية البلازميدات حديثا ويمكن استخلاصها في مخازن شطف المجموعة القياسية (عادة عازلة TE) طالما أن تركيز الحمض النووي للبلازميد مرتفع بدرجة كافية. نهدف إلى إضافة <5 ميكرولتر من البلازميد إلى 100 ميكرولتر من معلق الخلية للحفاظ على القوة الأيونية للعينة منخفضة جدا ، على الرغم من أنه يجب تحمل ما يصل إلى 10 ميكرولتر. ثالثا ، يجب تحضير ألواح الآجار الانتقائية حسب الحاجة لضمان فعالية المضاد الحيوي المضاف. لاحظ أنه تم استخدام carbenicillin بدلا من الأمبيسلين المعتاد للاختيار أثناء تحويل بلازميد الاستئصال ، pFLP2ab. A. baumannii مقاوم جوهريا للأمينوبينيسيلين (الأمبيسلين)16 ؛ يسمح استبدال كربوكسي بنسلين (كاربينيسيلين) بالانتقاء المستمر باستخدام β-lactamase المشفر بالبلازميد.

يعد تحسين البروتوكول التجريبي أكثر دقة وسيختلف بين الأنواع المختلفة من Acinetobacter (أو حتى السلالات التي تم التلاعب بها وراثيا داخل نفس النوع) وربما الكواشف المعينة المستخدمة في المختبر. على سبيل المثال ، يمكن أن يتراوح الجهد المستخدم في التثقيب الكهربائي بين 1.8 و 2.5 كيلو فولت ، وقد تحتاج ظروف التدوير الحراري إلى تغيير طفيف اعتمادا على بوليميراز الحمض النووي المستخدم في تفاعل البوليميراز المتسلسل. تتضمن التلميحات المفيدة التي يجب مراعاتها فيما إذا كانت الخلايا تنمو بشكل سيئ بعد التثقيب الكهربائي تقليل تركيز الجنتاميسين في ألواح الآجار من 50 ميكروغرام / مل إلى 30 ميكروغرام / مل و / أو تمديد وقت حضانة ألواح الآجار إلى ≥24 ساعة. فيما يتعلق بخطوات إزالة كاسيت الجنتاميسين ، يمكن تحقيق نجاح أفضل باستخدام ألواح أجار LB مع 10٪ سكروز و / أو حضنها عند 30 درجة مئوية لمدة ≥24 ساعة إذا استمرت مقاومة الكاربينيسيلين.

يمكن العثور على العديد من طرق تحضير خلايا A. baumannii للاستخدام مع التثقيب الكهربائي في الأدبيات ، ولكنها غالبا ما تتضمن خطوة تثاقف فرعية بعد الثقافة الأولية بين عشية وضحاها ثم مرحلة نمو طويلة إلى كثافة بصرية محددة. لقد وجدنا أنه يمكن استخدام ثقافة بسيطة بين عشية وضحاها بنفس الفعالية. تم وصف التثقيب الكهربائي ل A. baumannii بشكل جيد ، ويمكن للقراء اكتساب مزيد من التبصر في هذا الجانب المحدد من البروتوكول هنا17,18. تتمثل المزايا الرئيسية لنظام تكملة الجينات الكروموسومية mini-Tn7 مقارنة بنظام التكملة القائم على البلازميد في القدرة على تنظيم مستوى التعبير عن الجين المكمل من خلال نظام قمع lacIq الذي يمكن التحكم فيه بواسطة IPTG واختيار إزالة علامة الجنتاميسين (جين aacC1) عبر مواقع FRT المرافقة. وقد لوحظ أن تحمل الخلايا للتعبير عن مضخات التدفق يمكن أن يختلف اعتمادا على المضخة المدخلة. على سبيل المثال ، تكون الخلايا أكثر حساسية للتعبير عن AdeIJK مقارنة ب AdeABC أو AdeFGH ؛ ويمكن معالجة ذلك عن طريق تعديل تركيز IPTG في ظروف الاستزراع. تقلل إزالة علامة المضادات الحيوية من خطر الطفرات على السلالة بسبب ضغط الاختيار المستمر وتسمح أيضا بإجراء فحوصات غير مقيدة لحساسية المضادات الحيوية3.

تم استخدام نظام mini-Tn7 هذا بنجاح مع أنواع Pseudomonas9،10 و Yersinia9 و Burkholderia19 و Xanthomonas20 و Acinetobacter5،6،21،22 ، ومع ذلك ، توجد بعض القيود. على سبيل المثال ، في A. baumannii ، يوجد موقع إدخال وظيفي واحد فقط attTn7 في الجينوم5 ، لذلك يمكن إنشاء سلالة بعمليات حذف متعددة ، ولكن يمكن استكمال جين واحد فقط في كل مرة. أيضا ، لم يثبت هذا النظام فعاليته بعد للبكتيريا إيجابية الجرام10.

مضخات تدفق RND هي ميسرات مهمة لمقاومة المضادات الحيوية في A. baumannii. ما يجعلها قوية للغاية هو هيكلها المكون من ثلاثة أجزاء يمتد عبر الأغشية الداخلية والخارجية ، مما يسمح بإزالة المضادات الحيوية من المحيط إلى خارج الخلية. لقد ثبت أن مضخات RND الأكثر دراسة وانتشارا - AdeABC و AdeFGH و AdeIJK - تقضي على المضادات الحيوية التي تشمل جميع الفئات. سيوفر توضيح وظيفة مضخة التدفق بالتفصيل نقطة انطلاق جيدة لتصميم خيارات علاجية جديدة ضد السلالات المقاومة للأدوية المتعددة. يسمح استخدام سلالة حذف مضخة RND الثلاثية AB258 واستكمال مضخة واحدة في كل مرة بدراسة كل مضخة بشكل مستقل عن المضخات الأخرى ، وتمييز كل منها ملامح الركيزة الفريدة والمثبطات الأكثر فعالية. بالطبع ، تلعب مضخات التدفق أيضا دورا "يوميا" في الوظيفة الطبيعية للبكتيريا. إن فهم هذه الأدوار يمكن أن يؤدي إلى شلل غير مباشر للمضخات، الأمر الذي من شأنه بدوره أن يوقف تدفق المضادات الحيوية، وربما يجعل البكتيريا المقاومة للأدوية المتعددة عرضة للمضادات الحيوية شائعة الاستخدام مرة أخرى. بشكل عام ، يمكن استخدام نظام mini-Tn7 لإدخال أي جين مهم للدراسة التفصيلية أو العلامات المفيدة ، على سبيل المثال ، البروتينات الفلورية للتصوير المجهري6.

إن الانتشار المتزايد للبكتيريا المقاومة للأدوية المتعددة هو مصدر قلق لنا جميعا. إن فهم آليات الحماية التي توفرها مضخات التدفق في مسببات الأمراض مثل A. baumannii أمر بالغ الأهمية لمكافحة العدوى الخطيرة. يعد نظام التعبير الجيني أحادي النسخة الكروموسومي هذا أداة قوية للدراسات الميكانيكية وكذلك لتحديد مثبطات إحباط وظيفة مضخة التدفق.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من خلال منحة اكتشاف من مجلس العلوم الطبيعية والهندسة في كندا إلى AK. يتم إنشاء المخططات المستخدمة في الأشكال باستخدام BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 mL PCR tube VWR 20170-012 For colony boil preparations and PCR reactions
1.5 mL microfuge tubes Sarstedt 72-690-301 General use
13-mL culture tubes, Pyrex Fisher 14-957K Liquid culture vessels
6x DNA loading buffer Froggabio LD010 Agarose gel electrophoresis sample loading dye
Acetic acid, glacial Fisher 351271-212 Agarose gel running buffer component
Agar Bioshop AGR003 Solid growth media
Agarose BioBasic D0012 Electrophoretic separation of PCR reaction products; used at a concentration of 0.8–2%
Agarose gel electrophoresis unit Fisher 29-237-54 Agarose gel electrophoresis; separation of PCR reaction products
Carbenicillin Fisher 50841231 Selective media
Culture tube closures Fisher 13-684-138 Stainless steel closure for 13-mL culture tubes
Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) set Biobasic DD0058 PCR reaction component; supplied as 100 mM each dATP, dCTP, dGTP, dTTP; mixed and diluted for 10 mM each dNTP
Dry bath/block heater Fisher 88860023 Isotemp digital dry bath for boil preparations
Electroporation cuvettes VWR 89047-208 2 mm electroporation cuvettes with round cap
Electroporator Cole Parmer 940000009 110 VAC, 60 Hz electroporator
Ethidium bromide Fisher BP102-1 Visualization of PCR reaction products and DNA marker in agarose gel
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) VWR CA-EM4050 Agarose gel running buffer component
Gentamicin Biobasic GB0217 For the preparation of selective media
Glycerol Fisher G33 Preparation of bacterial stocks for long-term storage in an ultra-low freezer
Incubator (shaking) New Brunswick Scientific M1352-0000 Excella E24 Incubator Shaker for liquid culture growth
Incubator (static) Fisher 11-690-550D Isotemp Incubator Oven Model 550D for solid (LB agar) culture growth
Inoculation loop Sarstedt 86.1562.050 Streaking colonies onto agar plates
Inoculation spreader Sarstedt 86.1569.005 Spreading of culture onto agar plates
Lysogeny broth (LB) broth, Lennox Fisher BP1427 Liquid growth media (20 g/L: 5 g/L sodium chloride, 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract)
Microfuge Fisher 75002431 Sorvall Legend Micro 17 for centrifugation of samples
Mini-centrifuge Fisher S67601B Centrifugation of 0.2 mL PCR tubes
Petri dishes SPL Life Sciences 10090 For solid growth media (agar plates): 90 x 15 mm
Pipettes  Mandel Various Gilson single channel pipettes (P10, P20, P200, P1000)
Power supply Biorad 1645050 PowerPac Basic power supply for electrophoresis
Primers IDT NA PCR reaction component; specific to gene of interest; prepared at 100 μM as directed on the product specification sheet
Sucrose BioBasic SB0498 For the preparation of counterselective media for removal of the pFLP2ab plasmid from transformed A. baumannii
Taq DNA polymerase FroggaBio T-500 PCR reaction component; polymerase supplied with a 10x buffer
Thermal cycler Biorad 1861096 Model T100 for PCR
Toothpicks Fisher S24559 For patching colonies onto agar plates
Trizma base Sigma T1503 Agarose gel running buffer component
Ultrapure water Millipore Sigma ZLXLSD51040 MilliQ water purification system: ultra pure water for media and solution preparation, and cell washing
Wide range DNA marker Biobasic M103R-2 Size determination of PCR products on an agarose gel
Wooden inoculating sticks Fisher 29-801-02 Inoculating cultures with colonies from agar plates

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Prioritization of pathogens to guide research, discovery, research and development of new antibiotics for drug-resistant bacterial infections, including tuberculosis. World Health Organization. , Geneva, Switzerland . Available from: https://www.who.int/publications/i/item/WHO-EMP-IAU-2017.12 (2017).
  2. Kornelsen, V., Kumar, A. Update on multidrug resistance efflux pumps in Acinetobacter spp. Antimicrob Agents Chemother. 65 (7), e00514-00521 (2021).
  3. Sykes, E. M., Deo, S., Kumar, A. Recent advances in genetic tools for Acinetobacter baumannii. Front Genet. 11, 601380 (2020).
  4. Kumar, A., Chua, K. L., Schweizer, H. P. Method for regulated expression of single-copy efflux pump genes in a surrogate Pseudomonas aeruginosa strain: identification of the BpeEF-OprC chloramphenicol and trimethoprim efflux pump of Burkholderia pseudomallei 1026b. Antimicrob Agents Chemother. 50 (10), 3460-3463 (2006).
  5. Kumar, A., Dalton, C., Cortez-Cordova, J., Schweizer, H. P. Mini-Tn7 vectors as genetic tools for single copy gene cloning in Acinetobacter baumannii. J Microbiol Methods. 82 (3), 296-300 (2010).
  6. Ducas-Mowchun, K., et al. Next generation of Tn7-based single-copy insertion elements for use in multi- and pan-drug resistant strains of Acinetobacter baumannii. Appl Environ Microbiol. 85 (11), e00066-00119 (2019).
  7. Ducas-Mowchun, K., De Silva, P. M., Patidar, R., Schweizer, H. P., Kumar, A. Tn7-based single-copy insertion vectors for Acinetobacter baumannii. Methods Mol Biol. 1946, 135-150 (2019).
  8. Schweizer, H. P. Applications of the Saccharomyces cerevisiae Flp-FRT system in bacterial genetics. J Mol Microbiol Biotechnol. 5 (2), 67-77 (2003).
  9. Choi, K. H., et al. A Tn7-based broad-range bacterial cloning and expression system. Nat Methods. 2 (6), 443-448 (2005).
  10. Choi, K. H., Schweizer, H. P. Mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa. Nat Protoc. 1 (1), 153-161 (2006).
  11. Kornelsen, V., Unger, M., Kumar, A. Atorvastatin does not display an antimicrobial activity on its own nor potentiates the activity of other antibiotics against Acinetobacter baumannii ATCC 17978 or A. baumannii AB030. Access Microbiol. 3, 000288 (2021).
  12. Reyrat, J. M., et al. Counterselectable markers: untapped tools for bacterial genetics and pathogenesis. Infect Immun. 66 (9), 4011-4017 (1998).
  13. Gay, P., et al. Positive selection procedure for entrapment of insertion sequence elements in gram-negative bacteria. J Bacteriol. 164, 918-921 (1985).
  14. Kyriakidis, I., Vasileiou, E., Pana, Z. D. Tragiannidis, Acinetobacter baumannii antibiotic resistance mechanisms. Pathogens. 10 (3), 373 (2021).
  15. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. CLSI Supplement M100., 31st edn. , Clinical and Laboratory Standards Institute. (2021).
  16. Dijkshoorn, L., Nemec, A., Seifert, H. An increasing threat in hospitals: multidrug-resistant Acinetobacter baumannii. Nature Reviews Microbiology. 5, 939-951 (2007).
  17. Yildirim, S., Thompson, M. G., Jacobs, A. C., Zurawski, D. V., Kirkup, B. C. Evaluation of parameters for high efficiency transformation of Acinetobacter baumannii. Sci Rep. 25 (6), 22110 (2016).
  18. Thompson, M. G., Yildirim, S. Transformation of Acinetobacter baumannii: electroporation. Methods Mol Biol. 1946, 69-74 (2019).
  19. Choi, K. H., DeShazer, D., Schweizer, H. P. Mini-Tn7 insertion in bacteria with multiple glmS-linked attTn7 sites: example Burkolderia mallei ATCC 2334. Nat Protoc. 1 (1), 162-169 (2006).
  20. Jittawuttipoka, T., et al. Mini-Tn7 vectors as genetic tools for gene cloning at a single copy number in an industrially important and phytopathogenic bacteria, Xanthomonas spp. FEMS Microbiol Lett. 298 (1), 111-117 (2009).
  21. Pérez-Varela, M., Tierney, A. R. P., Kim, J. S., Vázquez-Torres, A., Rather, P. Characterization of RelA in Acinetobacter baumannii. J Bacteriol. 202 (12), e00045 (2020).
  22. Williams, C. L., et al. Characterization of Acinetobacter baumannii copper resistance reveals a role in virulence. Front Microbiol. 11, 16 (2020).

Tags

المناعة والعدوى العدد 203
توصيف أنظمة تدفق الأدوية المتعددة في <i>الراكدة البوماني</i> باستخدام سلالة بكتيرية تعاني من نقص التدفق ونظام التعبير الجيني أحادي النسخة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

White, D., Kumar, A. Characterizing… More

White, D., Kumar, A. Characterizing Multidrug Efflux Systems in Acinetobacter baumannii Using an Efflux-Deficient Bacterial Strain and a Single-Copy Gene Expression System. J. Vis. Exp. (203), e66471, doi:10.3791/66471 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter