Karakterisering av multidrug effluxsystem i Acinetobacter baumannii med hjälp av en bakteriestam med brist på efflux och ett genuttryckssystem med en kopia

Summary

Vi beskriver en enkel procedur för kromosomalt komplement av en effluxpumpgen med hjälp av ett mini-Tn7-baserat expressionssystem till en konstruerad efflux-briststam av Acinetobacter baumannii. Detta exakta genetiska verktyg möjliggör kontrollerat genuttryck, vilket är nyckeln till karakterisering av effluxpumpar i multiresistenta patogener.

Abstract

Acinetobacter baumannii är erkänd som en utmanande gramnegativ patogen på grund av dess utbredda resistens mot antibiotika. Det är viktigt att förstå mekanismerna bakom detta motstånd för att utforma nya och effektiva behandlingsalternativ. Dessvärre hindras vår förmåga att undersöka dessa mekanismer hos A. baumannii av bristen på lämpliga verktyg för genetisk manipulation. Här beskriver vi metoder för att använda ett kromosomalt mini-Tn7-baserat system för att uppnå genuttryck i en A . baumannii-stam som saknar funktionella utflödesmekanismer av RND-typ. Engångsinsättning och inducerbart uttryck av effluxpump är ganska fördelaktigt, eftersom närvaron av RND-effluxoperoner på plasmider med högt antal kopior ofta tolereras dåligt av bakterieceller. Att inkorporera rekombinanta mini-Tn7-uttrycksvektorer i kromosomen hos en surrogatvärd av A. baumannii med ökad utflödeskänslighet hjälper dessutom till att kringgå störningar från andra effluxpumpar. Detta system är värdefullt inte bara för att undersöka okarakteriserade bakteriella effluxpumpar utan också för att bedöma effektiviteten hos potentiella hämmare som riktar sig mot dessa pumpar.

Introduction

Acinetobacter baumannii är en av Världshälsoorganisationens högprioriterade patogener på grund av dess omfattande resistens mot alla klasser av antibiotika¹. Det är en opportunistisk patogen som främst drabbar sjukhusinlagda, skadade eller immunsupprimerade personer. A. baumannii undviker i stor utsträckning antibiotika via effluxpumpar, varav den mest relevanta är exportörsfamiljen Resistance-Nodulation-Division (RND)². Att förstå hur dessa effluxpumpar fungerar mekanistiskt gör det möjligt att utveckla riktade terapeutiska alternativ.

Ett vanligt sätt att särskilja cellulära processer är genom genetisk manipulation. De verktyg som finns tillgängliga för genetiska studier av A. baumannii är dock begränsade, och för att ytterligare förvirra experimentell design är kliniska isolat ofta resistenta mot de antibiotika som rutinmässigt används för selektion i genetiska manipulationer³. Ett annat hinder som man stöter på när man studerar effluxpumpar specifikt är att de är strikt reglerade – ofta av okända faktorer – vilket gör det svårt att exakt isolera och tillskriva funktion till en enda pump⁴. Vi såg detta behov av att utöka forskningsverktygslådan och utvecklade ett mini-Tn7-baserat, single-copy-insertion, inducerbart uttryckssystem som innehåller en Flp recombinase target (FRT)-kassett, vilket gör det möjligt att ta bort markeringsmarkören ^5,6,7 (figur 1). Detta eleganta klonings- och expressionssystem, som först skapades för Pseudomonas ^8,9,10, användes för att generera utflödespumpkomplement i en kopia till en RND-utflödespumpsbristfällig stam av A. baumannii (ATCC 17978::ΔadeIJK,Δ adeFGH,Δ adeAB: hädanefter kallad A. baumannii AB258) som vi genererade¹¹. Genom att kunna studera en effluxpump i taget och inte överväldiga bakteriecellerna med högkopieuttryck (som man vanligtvis ser med plasmidbaserade expressionssystem), kan man bättre lära sig om de kritiska, fysiologiska aspekterna av varje effluxpump med minimal störning och minskade komplikationer.

Den här artikeln beskriver hur man använder mini-Tn7-systemet för att komplettera en borttagen gen av intresse, RND efflux pump adeIJK, i kromosomen av A. baumannii AB258 genom en serie okomplicerade steg som utförs under loppet av 9 dagar⁷. Den första uppsättningen steg återinför de raderade effluxpumpsgenerna som klonats in i den mini-Tn7-baserade insättningsplasmiden (Figur 2A) vid det enda insättningsstället för Tn7nedströms den välbevarade glmS-genen (Figur 3A). Denna process underlättas av en icke-replikativ hjälparplasmid (Figur 2B) som kodar för de transposasgener som behövs för Tn7-driven insättning. Den andra uppsättningen steg använder en excisionsplasmid (Figur 2C) för Flp-rekombinasmedierat avlägsnande av gentamicin-genen flankerad av FRT-platser (Figur 3B) för att skapa en omärkt stam. Även om detta system används för att belysa de väsentliga rollerna och möjliga hämmare av RND-effluxpumpar med avseende på antibiotikaresistens, kan det användas för att undersöka alla gener av intresse.

Protocol

1. Experimentell förberedelse

1. Rena plasmiden pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm⁹ (insertionsplasmid, figur 2A) med genen av intresse.
   OBS: Här är genen av intresse adeIJK. Den slutliga plasmidkoncentrationen bör vara ≥100 ng/μL.
2. Rena hjälparplasmiden (pTNS2)⁹ och excisionsplasmiden (pFLP2^ab)⁶ (figur 2B,C), helst till en slutlig plasmid-DNA-koncentration på ≥100 ng/μL.
3. Förbered 50 ml sterilt ultrarent vatten och 25 ml steril LB (Lennox) buljong (se materialförteckning).
4. Förbered minst 10 LB-agarplattor, var och en med följande tillsatser: vanlig (utan tillsatser), gentamicin (Gm) vid 50 μg/ml, karbenicillin (Cb) vid 200 μg/ml (för val via ampicillinresistensgenen) och 5 % sackaros (se materialtabell).
5. Stryk ut stammen som ska användas för insättning på LB-agar och inkubera vid 37 °C i 16-18 timmar. Här används A. baumannii AB258.
   OBS: Detta protokoll måste utföras i en steril miljö så mycket som möjligt genom att använda en bunsenbrännare vid bänken eller ett biologiskt säkerhetsskåp. Alla förbrukningsvaror (pipettspetsar, inokuleringsöglor, mikrofugerör etc.) måste vara sterila.

2. Förberedelse av kulturen

1. Inokulera en enda koloni av A. baumannii AB258 i 4 ml LB-buljong i ett sterilt 13 ml odlingsrör med hjälp av en steril inokuleringsslinga eller steril inokuleringspinne av trä.
   OBS: En enda 4 ml kultur används för ett sample och en kontroll. Öka antalet kulturer beroende på hur många prover som behövs.
2. Inkubera över natten vid 37 °C med skakning (250 varv/min).
3. Placera en flaska sterilt destillerat vatten (25-50 ml) vid 4 °C över natten för användning i steg 3.

3. Beredning av elektrokompetenta celler

1. Placera alla sterila 1.5 ml mikrofugerör (två per kultur) och sterila elektroporeringskyvetter (två per kultur) på is (se materialförteckning). Håll proverna på is så mycket som möjligt under hela proceduren.
2. Placera flaskan med sterilt vatten som förvarats vid 4 °C på is.
3. Överför 1,5 ml av nattbakteriekulturen till ett av 1,5 ml mikrofugerören.
4. Centrifugera vid 13 000 x g i 2 minuter för att pelletera cellerna.
   OBS: Centrifugering skulle helst utföras vid 4 °C, men centrifugering av omgivningstemperatur är acceptabel och inte skadlig.
5. Använd en 1 ml pipett för att ta bort all supernatant utan att störa cellpelleten.
6. Tillsätt ytterligare 1,5 ml bakteriekultur i samma mikrofugerör. Centrifugera vid 13 000 x g i 2 minuter och ta sedan bort allt supernatant.
7. Upprepa steg 3.6 en sista gång med resterande 1 ml kultur.
8. Tillsätt 1 ml iskallt sterilt vatten till cellpelleten och återsuspendera med försiktig pipettering tills pelleten inte längre sitter i botten av mikrofugeröret.
9. Centrifugera de återsuspenderade cellerna vid 13 000 x g i 2 minuter.
10. Ta försiktigt bort supernatanten med en 1 ml pipett. Häll inte av supernatanten, särskilt inte i de efterföljande tvättstegen när cellerna tenderar att bilda mindre kompakta pellets.
11. Upprepa detta tvättsteg med iskallt sterilt vatten, steg 3.8 till steg 3.10, två gånger till.
12. Återsuspendera försiktigt den slutliga cellpelleten i 200 μL iskallt sterilt vatten.
13. Överför 100 μl av den slutliga cellsuspensionen till det andra iskalla 1,5 ml mikrofugeröret. Denna andra alikvot kommer att bli den negativa kontrollen för elektroporering. Förvara cellproverna på is.

4. Elektroporering

1. Förvärm 1 ml LB-buljong och en LB + Gm 50-agarplatta (beredd i steg 1.4) för varje prov och kontroll i en statisk inkubator inställd på 37 °C.
2. I en sammanlagd volym av 5 μl eller mindre, tillsätt 100–200 ng var och en av pTNS2-hjälparplasmiden och pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm-adeIJK insertionsplasmiden till en alikvot av elektrokompetenta celler.
3. Blanda med försiktig fingertoppsknackning för att säkerställa fullständig blandning av plasmiderna med de elektrokompetenta cellerna utan att införa bubblor.
4. Tillsätt en motsvarande volym sterilt destillerat vatten till alikvoten i den negativa kontrollcellen och blanda försiktigt enligt ovan.
5. Inkubera proverna på is i 20 minuter.
6. Överför hela cellprovet till en iskall elektroporeringskyvett och lägg sedan tillbaka kyvetten på is. Upprepa för det negativa kontrollcellprovet.
7. Elektroporera cellprovet.
   1. Slå på elektroporatorn och ställ in den på 2.0 kV (25 μF, 200 Ω) (se materialförteckning).
   2. Torka av kyvettens yta med en mjuk servett för att ta bort eventuell isbildning eller fukt.
   3. Sätt in kyvetten i elektroporatorn och ge den elektriska stöten.
   4. Tillsätt omedelbart 0.9 ml förvärmd LB-buljong till cellerna i kyvetten och pipettera försiktigt upp och ner för att blanda cellerna med mediet.
   5. Överför hela cellsuspensionen till ett nytt 1,5 ml mikrofugerör (rumstemperatur).
   6. Kontrollera tidskonstantvärdet på elektroporatorn; För bästa resultat bör detta värde vara mellan 4 och 6.
8. Upprepa elektroporeringsproceduren (steg 4.7.1 till steg 4.7.6) för det negativa kontrollcellprovet.
9. Inkubera de elektroporerade proverna vid 37 °C i 1 timme vid 250 varv/min så att cellerna kan återhämta sig.
10. Sprid 100 μl av varje elektroporerat cellprov med hjälp av en inokuleringsspridare på en förvärmd LB + Gm⁵⁰ agarplatta.
    1. Centrifugera de återstående proverna vid 13 000 x g i 2 minuter för att pelletera cellerna.
    2. Efter att ha avlägsnat all supernatant med hjälp av en pipett, återsuspendera cellerna i 100 μl LB-buljong.
    3. Sprid varje hel sample på individuella förvärmda LB + Gm⁵⁰ agarplattor.
       OBS: Elektroporationseffektiviteten kan vara töjningsberoende. När man elektroporerar en stam för första gången kan det vara informativt att plätera ut olika volymer, eller till och med utspädningar, av elektroporationsprovet för att säkerställa att de resulterande plattorna har isolerade kolonier.
11. Inkubera plattorna vid 37 °C i 16-18 timmar.

5. Urval av transformerade kolonier för PCR-baserad screening

1. Kontrollera elektroporeringsplattorna. Den negativa kontrollen bör inte ha några kolonier; Provet ska ha tydliga kolonier.
   OBS: Plattor med kolonier, i detta steg och i alla efterföljande steg där agarplattor med kolonier eller fläckar produceras, kan förvaras vid 4 °C i upp till 3 dagar innan de fortsätter.
2. Använd sterila tandpetare, plocka upp till 10 enskilda kolonier från LB + Gm⁵⁰ agarplattorna och lappa dem på en ny LB + Gm⁵⁰ agarplatta.
3. Inkubera plattorna vid 37 °C i 16-18 timmar.

6. Verifiering av kromosominsättning med koloni-PCR

1. Ta bort LB + Gm 50-agarplattorna som innehåller de lappade kolonierna från inkubatorn.
2. Använd en steril tandpetare eller steril pipettspets och ta bort en liten del (ungefär lika stor som en stor koloni) från ett plåster till 20 μL sterilt destillerat vatten i ett 0,2 ml PCR-rör; Blanda väl. Vattenprovet ska bli synligt grumligt när cellerna frigörs från tandpetaren. Förbered valfritt antal prover som behöver screenas, men 6 bör räcka.
3. Inkubera PCR-röret med bakteriesuspensionen vid 100 °C i 5-10 min.
4. Använd en minicentrifug (se materialtabell) och snurra provet med den fasta maximala hastigheten i 2 minuter för att pelleta cellulärt skräp.
5. Överför supernatanten till en ny 0,2 ml PCR-slang och lägg den på is. Detta prov innehåller mall-DNA för PCR-reaktionen.
   OBS: Denna mall DNA kan förvaras vid -20 °C innan du fortsätter med PCR.
6. Bered en PCR-reaktionsblandning som innehåller 1x polymerasbuffert, 200 μM dNTP, 0,18 μM ABglmS2_F_New framåtriktad primer, 0,18 μM Tn7R omvänd primer (tabell 1), 1 U Taq DNA-polymeras och 1 μL av det beredda mall-DNA:t i en total volym av 25 μL. Förbered en kontroll utan mall (NTC), inklusive allt utom mall-DNA (se materialförteckning).
7. Ange reaktionsförhållandena i en termisk cykler: 95 °C i 2 minuter; 95 °C under 30 s, 49 °C under 30 s och 72 °C under 30 s under totalt 35 cykler. 72 °C i 10 minuter. 12 °C håll. Kör exemplen.
8. Efter tillsats av DNA-laddningsfärgämne till en slutlig koncentration av 1x, fyll 10 μL av varje PCR-reaktion på en 2-procentig agarosgel och kör vid 80 V i 40 minuter. Den förväntade amplikonstorleken för detta primerpar är 382 bp. NTC bör inte ha några band.
9. Identifiera de prover som gav den förväntade PCR-produkten. Förbered en streckplatta på LB + Gm⁵⁰ agarplattor från någon av de PCR-positiva plåstren; inkubera vid 37 °C i 16–18 timmar. Målet är att generera en platta med enstaka kolonier för beredning av ett glycerollager för att bevara denna märkta stam och som utgångspunkt för att skapa en omärkt stam (beskrivs nedan).

7. Borttagning av Gm^R-markören med pFLP2^ab

1. Följ proceduren som nämns i steg 2: Kulturberedning. Provet som används för att bereda nattkulturen är en enda koloni från LB + Gm⁵⁰ agarplattorna som förberetts för att generera diskreta kolonier i steg 6.9.
2. Följ proceduren som nämns i steg 3: Beredning av elektrokompetenta celler. Förbered cellerna från odlingen över natten för elektroporering.
3. Följ proceduren som nämns i steg 4: Elektroporering. Här är plasmiden som ska introduceras i cellerna pFLP2^ab (100-200 ng), som kommer att ta bort genen för gentamicinresistens och flankera den kromosomalt införda genen av intresse.
4. Efter att cellerna har återhämtat sig i 1 timme (steg 4.9), sprid 100 μL av det elektroporerade cellprovet på en förvärmd LB + Cb²⁰⁰ agarplatta (beredd i steg 1.4). Detta selektiva tryck säkerställer att endast celler som hyser pFLP2^ab excisionsplasmiden kommer att växa.
5. Inkubera plattorna vid 37 °C i 16-18 timmar.
6. Kontrollera om det finns kolonier på plattan. Den negativa kontrollplattan bör inte ha några kolonier; LB + Cb²⁰⁰ agarprovplattan bör ha tydliga kolonier.
7. Använd sterila tandpetare, korsa lappar upp till 20 isolerade kolonier på en LB + Cb²⁰⁰ agarplatta och en LB + Gm⁵⁰ agarplatta.
8. Inkubera plattorna i 16–18 timmar vid 37 °C.
9. Kontrollera om det finns några fläckar på plattorna. Kloner som växer på LB + Cb²⁰⁰ agarplattan men inte LB + Gm⁵⁰ agarplattan har fått gentamicinresistensgenen borttagen från den ursprungliga insatsen.
10. Välj de plåster som är karbenicillinresistenta och gentamicinkänsliga för strimmor på enskilda LB-agarplattor kompletterade med 5 % (w/v) sackaros, vilket tvingar utdrivningen av pFLP2^ab-plasmiden från bakterierna. Välj upp till 10 samhällen.
11. Inkubera plattorna i 16–18 timmar vid 37 °C.
12. Kontrollera plattorna för kolonier.
13. Som en slutlig bekräftelse på pFLP2 ab-plasmidförlust, korsa patch 4-6 isolerade kolonier från 5% sackarosplattorna på en LB + Cb²⁰⁰ agarplatta och en LB agarplatta.
14. Inkubera plattorna i 16–18 timmar vid 37 °C.
15. Välj en klon som växer på LB-agarplattan och som är karbenicillinkänslig för beredning av ett glycerollager för att bevara denna omärkta stam.
    1. Genetisk verifiering av den omärkta stammen kan utföras med koloni-PCR (steg 6: Verifiera kromosominsättning med koloni-PCR) med hjälp av de primers som riktar sig mot genen för gentamicinresistens.
    2. Bered en PCR-reaktionsblandning innehållande 1x polymerasbuffert, 200 μM dNTP, 0,18 μM Gm_F framåtriktad primer, 0,18 μM Gm_R omvänd primer (tabell 1), 1 U Taq DNA-polymeras och 1 μL av det beredda mall-DNA:t i en total volym av 25 μL. Förbered en kontroll utan mall (NTC) som omfattar allt utom mall-DNA. och en positiv kontroll med hjälp av DNA från den märkta stammen.
    3. Ange reaktionsförhållandena i en termisk cykler: 95 °C i 2 minuter; 95 °C under 30 s, 50 °C under 30 s och 72 °C under 40 s under totalt 35 cykler. 72 °C i 10 minuter. 12 °C håll. Kör exemplen.
    4. Efter tillsats av DNA-laddningsfärgämne till en slutlig koncentration av 1x, fyll 10 μL av varje PCR-reaktion på en 1-procentig agarosgel och kör vid 80 V i 40 minuter. Den förväntade amplikonstorleken för detta primerpar är 525 bp. Den positiva kontrollen bör ha ett enda band; proverna och NTC bör inte ha några band.

Representative Results

Kromosominsättningsproceduren tar bara 2 timmar totalt under 3 dagar för att se en resultatkoloni växa på en selektiv agarplatta (Figur 1A-C). Det förväntade antalet kolonier på transformationsplattan är töjningsberoende: man kan se 20-30 eller till och med hundratals kolonier eftersom insättning av Tn7 på Tn7-platser är specifik och effektiv⁹. Lappning av kolonier med transformationsplattor på selektiva medier (figur 4A) bevarar den transformerade stammen och ger utgångsmaterial för PCR-screening av kolonier (figur 1E och figur 4B). Screening av kolonier med PCR kan hållas till ett minimum - högst 10 kolonier bör behöva bearbetas, och de flesta bör ge ett positivt resultat för insättning. PCR-produkten för siktprimers, ABglmS2_F_New och Tn7R (tabell 1), är 382 bp (figur 4B bana 4); Negativa kontroller för reaktionen inkluderar vildtyp A. baumannii ATCC 17978 (figur 4B bana 2), AB258 (figur 4B bana 3) och ingen mall (figur 4B bana 5). Kolonier som är PCR-positiva representerar kompletterade, markerade stammar.

Avlägsnande av genen för gentamicinresistens (avmärkning) tar mindre än 3 timmar och sträcker sig över 6 dagar eftersom celler som transformerats med excisionsplasmiden måste väljas genom selektiv plätering, och sedan måste excisionsplasmiden botas från bakterierna (Figur 1F). Flp-FRT rekombinationsbaserad excision är exakt och effektiv och bör resultera i ≥20 kolonier på transformationsplattan. Kolonier som korslappas på karbenicillin (selektion för β-laktamresistens som ges av excisionsplasmiden) och gentamicin (som letar efter förlust av gentamicinresistens) bör alla vara karbenicillinresistenta respektive gentamicinkänsliga. Excisionsplasmiden tvingas ut ur bakterierna genom tillväxt på 5% sackarosagarplattor. Tillväxt på sackaros tvingar cellerna att eliminera pFLP2^ab eftersom sacB-genen på plasmiden främjar omvandlingen av sackaros till levans, en polysackarid som är giftig för bakterierna^12,13. Alla samhällen som växer på 5 % sackarosmedia bör då endast växa på vanliga LB-agarplattor; Det bör inte finnas någon tillväxt på karbenicillinagarplattor. Kolonier som växer på de släta LB-agarplattorna representerar omärkta stammar. Bekräftad förlust av gentamicinmarkören kan uppnås genom koloni-PCR med hjälp av Gm_F och Gm_R primrar (tabell 1 och figur 5). Detta primerpar ger en amplikon på 525 bp endast i den positiva kontrollen (den ursprungligen skapade markerade stammen, figur 5 bana 4); ATCC 17978 av vildtyp (figur 5 körfält 2), AB258 (figur 5 körfält 3), alla testade kolonier (figur 5 körfält 5) och kontrollen utan mall (figur 5 körfält 6) bör inte visa förstärkning.

När den omärkta stammen har bekräftats kan funktionell testning påbörjas med fenotypiska analyser. Här är det självklara förstahandsvalet att bestämma den lägsta hämmande koncentrationen (MIC) för en rad antibiotika: ciprofloxacin är ett känt substrat för AdeIJK, tetracyklin kan avlägsnas med AdeIJK (den största effluxpumpen är AdeAB) och kanamycin har en relativt liten effekt på A. baumannii ATCC 17978 ^2,14. Med hjälp av buljongmikrospädningsmetoden enligt CLSI-riktlinjerna¹⁵ utmanades den kompletterade omärkta stammen AB258::adeIJK med varje antibiotika i frånvaro och närvaro av 50 μM IPTG; vildtypsstammen ATCC 17978 och RND-effluxbriststammen AB258 inkluderades som kontroller (tabell 2). Sammantaget visar trenden som ses i MIC-värdena den förväntade minskade känsligheten för AB258::adeIJK för ciprofloxacin och tetracyklin med inducerat uttryck av effluxpumpen, vilket verifierar att insättningen av adeIJK var framgångsrik.

Figur 1: Översikt över förfarandet. A) En odling över natten av stammen A. baumannii som ska kompletteras bereds. (B) Cellerna från odlingen över natten tvättas med vatten 3 gånger genom centrifugering och hålls på is. (C) Leverans- och hjälparplasmiderna tillsätts cellerna och inkuberas på is i 20 minuter. Provet elektroporeras, LB-media tillsätts och cellerna får återhämta sig i 1 timme vid 37 °C. En alikvot på 100 μl celler sprids på LB + Gm 50-agarplattor och inkuberas vid 37 °C över natten. D) Kolonier från transformationsplattan lappas på en LB + Gm^{50-agarplatta} och odlas över natten vid 37 °C. E) Lappade kolonier förbereds för PCR för att screena förekomsten av en amplifieringsprodukt som spänner över kromosominsättningsstället. PCR-amplifiering visualiseras med agarosgelelektrofores. PCR-positiva prover representerar en framgångsrik insättning av genen i kromosomen och skapandet av en markerad stam. (F) En koloni som är positiv för gentamicin bereds som i steg (A-C), med elektroporering av pLFP2^ab-plasmiden för att avlägsna gentamicinkassetten från kromosominsättningen. Selektiv plätering på LB + Cb²⁰⁰ agar bekräftar upptaget av plasmiden. Duplicerad lappning på LB + Cb²⁰⁰ och LB + Gm⁵⁰ agarplattor avslöjar kolonier som är Cb^R och Gm^S som bekräftar förlust av gentamicinkassetten från insättningen. Tillväxt av utvalda Cb^R-kolonier på 5% sackaros botar pLFP2^ab-plasmiden från cellerna. Kolonier från 5 % sackarosplattan lappas på LB + Cb²⁰⁰ agar och LB agar för att avslöja önskade Cb^S- och GM S-kolonier och bekräfta skapandet av den omärkta stammen. Gm⁵⁰, gentamicin vid 50 μg/ml; Cb²⁰⁰, karbenicillin vid 200 μg/ml; ^R, resistent; ^S, känsligt. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 2: Plasmider som används i detta protokoll. Allmänna plasmidkartor för (A) pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm (insertionsplasmid), (B) pTNS2 (hjälpplasmid) och (C) pFLP2^ab (excisionsplasmid). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 3: Schematisk bild av infogning och avmärkning. (A) Införande. Det enda insättningsstället för Tn7 i A. baumannii-kromosomen ligger 24 bp från slutet av glmS2-genen . Samelektroporering av insättningsplasmiden och hjälparplasmiden möjliggör komplementering av genen av intresse (insatt gen, lila) tillsammans med resten av insättningskassetten (FRT-platser för markörexcision, gul; accC1-genen för gentamicinresistens, grön; lacIq-genen för inducerbart uttryck, blå) i kromosomen. (B) Avmärkning. Elektroporering av den kompletterade, markerade insättningsstammen med pFLP2^ab excisionsplasmiden underlättar avlägsnandet av genen för gentamicinresistens (accC1, grön) via Flp-FRT-rekombination (FRT-platser, gul), vilket skapar en omärkt stam. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 4: Transformation, patchning och insättningsbekräftelse med koloni-PCR. Representativt resultat av (A) tillväxten av transformationskolonier efter patchning, och (B) koloni-PCR-amplifiering med ABglmS_F_New (grå) och Tn7R (orange) primrar för att bekräfta kromosominsättning. Bana 1: DNA-stege med låg molekylvikt; Bana 2: ATCC 179798; Körfält 3: AB258; Bana 4: AB258::adeIJK-LAC-Gm; Körfält 5: ingen mallkontroll. Det förväntade bandet på 382 bp är märkt. Observera att de gentamicinspecifika primrarna (Gm_F och Gm_R, gröna) också kan användas för att bekräfta kromosominsättning. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 5: Bekräftelse av förlust av markör med koloni-PCR. Representativt resultat av koloni-PCR-amplifiering med gentamicinspecifika primers (Gm_F och Gm_R) för att bekräfta förlusten av antibiotikamarkören via pFLP^ab-baserad excision. Bana 1: DNA-stege med låg molekylvikt. Bana 2: ATCC 179798; Körfält 3: AB258; Bana 4: AB258::adeIJK-LAC-Gm; Bana 5: AB258::adeIJK; Körfält 6: ingen mallkontroll. Det förväntade bandet på 525 bp är märkt. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Stammar, plasmider och primers	Relevanta egenskaper	Hänvisning
Fläck
A. baumannii ATCC 17978	Typ stam	ATCC (på engelska)
A. baumannii ATCC 17978 AB258	ΔadeAB,Δ adeFGH,Δ adeIJK	11
Plasmider
pUC18T-miniTn7T-Gm-LAC	GmR, AmpR	9
pUC18T-miniTn7T-Gm-LAC-adeIJK	GmR, AmpR, adeIJK	Denna studie
pTNS2	FörstärkareR	9
pFLP2ab	pWH1266 ursprung eller replikation, sacB, AmpR	7
Grundfärger	Sekvens (5′–3′)
ABglmS_F_New	CACAGCATAACTGGACTGATTTC	7
Tn7R	TATGGAAGAAGTTCAGGCTC	7
Gm_F	TGGAGCAGCAACGATGTTAC	Denna studie
Gm_R	TGTTAGGTGGCGGTACTTGG	Denna studie

Tabell 1: Bakteriestammar, plasmider och primrar som används i detta protokoll. GM, gentamicin; Amp, ampicillin; ^R, resistent.

	Ciprofloxacin		Tetracyklin		Kanamycin Kanamycin
IPTG	−	+	−	+	−	+
ATCC 17978	0.250	Nd	0.500	Nd	1.5	Nd
AB258	0.031	Nd	0.063	Nd	4	Nd
AB258::adeIJK	0.016	0.063	0.031	0.125	8	2
Vik byte		4.01		4.03		0.25

Tabell 2: Testning av de införda genernas funktionalitet med hjälp av antibiotikakänslighet. Jämförelse av värden för minsta hämmande koncentration (MIC) för A. baumannii ATCC 17978, AB258, oinducerad AB258::adeIJK och IPTG-inducerad AB258::adeIJK mot ciprofloxacin, tetracyklin och kanamycin. Vikningsförändring = inducerad (+ IPTG)/icke-inducerad (− IPTG); nd = ej fastställd.

Discussion

Även om denna procedur för kromosomal insättning av ett inducerbart genuttryckssystem i en kopia i A. baumannii är tekniskt okomplicerad och inte arbetskrävande, finns det några viktiga steg som måste betonas. För det första måste beredningen av de kompetenta cellerna göras på is så mycket som möjligt eftersom cellerna blir ömtåliga när mediet byts ut mot iskallt vatten. Helst utförs centrifugeringsstegen vid 4 °C, men centrifugering vid rumstemperatur är acceptabel. Med tanke på cellernas ökande bräcklighet under vattentvättarna är det också viktigt med skonsam pipettering. För det andra är elektroporering känslig för närvaron av joner. Att tvätta cellerna med flera omgångar pelletering och återsuspendera i vatten säkerställer att mediet avlägsnas helt. Plasmider bör också vara nyrenade och kan elueras i vanliga kitelueringsbuffertar (normalt TE-buffert) så länge plasmid-DNA-koncentrationen är tillräckligt hög. Vi strävar efter att lägga till <5 μL plasmid till 100 μL cellsuspension för att hålla provets jonstyrka mycket låg, även om upp till 10 μL bör tolereras. För det tredje bör selektiva agarplattor beredas vid behov för att säkerställa effekten av det tillsatta antibiotikumet. Notera att karbenicillin användes istället för det vanliga ampicillinet för selektion under transformationen av excisionsplasmiden, pFLP2^ab. A. baumannii är i sig resistent mot aminopenicilliner (ampicillin)¹⁶; Genom att ersätta ett karboxypenicillin (karbenicillin) kan man fortsätta selektionen med det plasmidkodade β-laktamas.

Optimeringen av det experimentella protokollet är mer nyanserad och kommer att variera mellan olika arter av Acinetobacter (eller till och med genetiskt manipulerade stammar inom samma art) och möjligen de specifika reagenser som används i laboratoriet. Till exempel kan spänningen som används för elektroporering variera mellan 1,8 och 2,5 kV, och termocykelförhållandena kan behöva ändras något beroende på vilket DNA-polymeras som används för PCR. Användbara tips att tänka på om cellerna växer dåligt efter elektroporering inkluderar att minska koncentrationen av gentamicin i agarplattorna från 50 μg/ml till 30 μg/ml och/eller förlänga inkubationstiden för agarplattorna till ≥24 timmar. När det gäller stegen för att avlägsna gentamicinkassetten kan man få bättre framgång genom att använda LB-agarplattor med 10 % sackaros och/eller inkubera dem vid 30 °C i ≥24 timmar om karbenicillinresistensen kvarstår.

Många A. baumannii-cellberedningsmetoder för användning med elektroporering finns i litteraturen, men de inkluderar ofta ett subkultursteg efter den första odlingen över natten och sedan en lång tillväxtfas till en föreskriven optisk densitet. Vi har funnit att en enkel övernattningskultur kan användas lika effektivt. Elektroporation av A. baumannii har beskrivits väl, och läsarna kan få ytterligare insikt i denna specifika aspekt av protokollet här^17,18. De viktigaste fördelarna med detta mini-Tn7-kromosomala genkomplementeringssystem jämfört med ett plasmidbaserat komplementeringssystem är förmågan att reglera uttrycksnivån för den kompletterade genen genom det IPTG-kontrollerbara lacI q-repressorsystemet och valet att ta bort gentamicinmarkören (aacC1-genen) via de flankerande FRT-platserna. Det observerades att cellernas tolerans för uttrycket av effluxpumpar kan variera beroende på vilken pump som sätts in. Till exempel är celler mer känsliga för uttrycket av AdeIJK jämfört med AdeABC eller AdeFGH; Detta kan åtgärdas genom att modifiera koncentrationen av IPTG under odlingsförhållandena. Avlägsnande av antibiotikamarkören minskar mutationsrisken för stammen på grund av konstant selektionstryck och möjliggör också obegränsade antibiotikakänslighetsundersökningar³.

Detta mini-Tn7-system har använts framgångsrikt med Pseudomonas ^9,10, Yersinia⁹, Burkholderia¹⁹, Xanthomonas²⁰ och Acinetobacter ^5,6,21,22 arter, men vissa begränsningar finns. Till exempel finns det i A. baumannii bara ett funktionellt attTn7-insättningsställe i genomet⁵, så en stam kan skapas med flera deletioner, men bara en gen i taget kan kompletteras. Dessutom har detta system ännu inte visat sig vara effektivt för grampositiva bakterier¹⁰.

RND-effluxpumpar är viktiga faktorer för att underlätta antibiotikaresistens hos A. baumannii. Det som gör dem så kraftfulla är deras tredelade struktur som sträcker sig över de inre och yttre membranen, vilket gör det möjligt att avlägsna antibiotika från periplasman till utsidan av cellen. De mest studerade och allestädes närvarande RND-pumparna – betecknade AdeABC, AdeFGH och AdeIJK – har visat sig eliminera antibiotika som omfattar alla klasser. Att belysa effluxpumpens funktion i detalj kommer att ge en bra utgångspunkt för att designa nya behandlingsalternativ mot multiresistenta stammar. Genom att använda AB258 trippel RND-pumpborttagningsstam och komplettera tillbaka en pump i taget kan man studera varje pump oberoende av de andra, och för var och en urskilja deras unika substratprofiler och mest effektiva hämmare. Naturligtvis har effluxpumpar också en "daglig" roll i bakteriens normala funktion. Att förstå dessa roller skulle kunna leda till indirekt förlamning av pumparna, vilket i sin tur skulle avbryta antibiotikautflödet, vilket möjligen skulle göra multiresistenta bakterier mottagliga för vanligt förekommande antibiotika igen. I allmänhet kan mini-Tn7-systemet användas för att introducera vilken gen som helst av intresse för detaljerade studier eller användbara markörer, till exempel fluorescerande proteiner för mikroskopisk avbildning⁶.

Den ökande förekomsten av multiresistenta bakterier är ett bekymmer för oss alla. Att förstå de skyddsmekanismer som effluxpumpar ger hos patogener som A. baumannii är avgörande för att bekämpa allvarliga infektioner. Detta kromosomala genuttryckssystem är ett kraftfullt verktyg för mekanistiska studier samt för att identifiera hämmare för att motverka effluxpumpens funktion.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL PCR tube	VWR	20170-012	For colony boil preparations and PCR reactions
1.5 mL microfuge tubes	Sarstedt	72-690-301	General use
13-mL culture tubes, Pyrex	Fisher	14-957K	Liquid culture vessels
6x DNA loading buffer	Froggabio	LD010	Agarose gel electrophoresis sample loading dye
Acetic acid, glacial	Fisher	351271-212	Agarose gel running buffer component
Agar	Bioshop	AGR003	Solid growth media
Agarose	BioBasic	D0012	Electrophoretic separation of PCR reaction products; used at a concentration of 0.8–2%
Agarose gel electrophoresis unit	Fisher	29-237-54	Agarose gel electrophoresis; separation of PCR reaction products
Carbenicillin	Fisher	50841231	Selective media
Culture tube closures	Fisher	13-684-138	Stainless steel closure for 13-mL culture tubes
Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) set	Biobasic	DD0058	PCR reaction component; supplied as 100 mM each dATP, dCTP, dGTP, dTTP; mixed and diluted for 10 mM each dNTP
Dry bath/block heater	Fisher	88860023	Isotemp digital dry bath for boil preparations
Electroporation cuvettes	VWR	89047-208	2 mm electroporation cuvettes with round cap
Electroporator	Cole Parmer	940000009	110 VAC, 60 Hz electroporator
Ethidium bromide	Fisher	BP102-1	Visualization of PCR reaction products and DNA marker in agarose gel
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	VWR	CA-EM4050	Agarose gel running buffer component
Gentamicin	Biobasic	GB0217	For the preparation of selective media
Glycerol	Fisher	G33	Preparation of bacterial stocks for long-term storage in an ultra-low freezer
Incubator (shaking)	New Brunswick Scientific	M1352-0000	Excella E24 Incubator Shaker for liquid culture growth
Incubator (static)	Fisher	11-690-550D	Isotemp Incubator Oven Model 550D for solid (LB agar) culture growth
Inoculation loop	Sarstedt	86.1562.050	Streaking colonies onto agar plates
Inoculation spreader	Sarstedt	86.1569.005	Spreading of culture onto agar plates
Lysogeny broth (LB) broth, Lennox	Fisher	BP1427	Liquid growth media (20 g/L: 5 g/L sodium chloride, 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract)
Microfuge	Fisher	75002431	Sorvall Legend Micro 17 for centrifugation of samples
Mini-centrifuge	Fisher	S67601B	Centrifugation of 0.2 mL PCR tubes
Petri dishes	SPL Life Sciences	10090	For solid growth media (agar plates): 90 x 15 mm
Pipettes	Mandel	Various	Gilson single channel pipettes (P10, P20, P200, P1000)
Power supply	Biorad	1645050	PowerPac Basic power supply for electrophoresis
Primers	IDT	NA	PCR reaction component; specific to gene of interest; prepared at 100 μM as directed on the product specification sheet
Sucrose	BioBasic	SB0498	For the preparation of counterselective media for removal of the pFLP2ab plasmid from transformed A. baumannii
Taq DNA polymerase	FroggaBio	T-500	PCR reaction component; polymerase supplied with a 10x buffer
Thermal cycler	Biorad	1861096	Model T100 for PCR
Toothpicks	Fisher	S24559	For patching colonies onto agar plates
Trizma base	Sigma	T1503	Agarose gel running buffer component
Ultrapure water	Millipore Sigma	ZLXLSD51040	MilliQ water purification system: ultra pure water for media and solution preparation, and cell washing
Wide range DNA marker	Biobasic	M103R-2	Size determination of PCR products on an agarose gel
Wooden inoculating sticks	Fisher	29-801-02	Inoculating cultures with colonies from agar plates