유출 결핍 박테리아 균주 및 단일 복제 유전자 발현 시스템을 사용한 Acinetobacter baumannii 의 다제 유출 시스템 특성 분석

Summary

우리는 mini-Tn7 기반 발현 시스템을 사용하여 Acinetobacter baumannii의 조작된 유출 결핍 균주에 유출 펌프 유전자의 단일 복제 염색체 보완을 위한 손쉬운 절차를 설명합니다. 이 정밀한 유전 도구는 유전자 발현을 제어할 수 있으며, 이는 다제내성 병원체에서 유출 펌프의 특성 분석에 핵심입니다.

Abstract

아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii )는 항생제에 대한 광범위한 내성으로 인해 까다로운 그람 음성 병원체로 인식되고 있습니다. 새롭고 효과적인 치료 옵션을 설계하기 위해 이러한 내성 이면의 메커니즘을 이해하는 것이 중요합니다. 불행히도, A. baumannii 에서 이러한 메커니즘을 조사할 수 있는 우리의 능력은 적절한 유전자 조작 도구의 부족으로 인해 방해를 받고 있습니다. 여기서, 우리는 기능적 RND 유형 유출 메커니즘이 결여된 A. baumannii 균주에서 단일 복제 유전자 발현을 달성하기 위해 염색체 mini-Tn7 기반 시스템을 활용하는 방법을 설명합니다. single-copy insertion 및 inducible efflux pump 발현은 매우 유리한데, 이는 high-copy number plasmid에서 RND efflux operon의 존재가 종종 박테리아 세포에 의해 잘 견디지 못하기 때문입니다. 또한, 재조합 mini-Tn7 발현 벡터를 향상된 유출 민감도를 가진 대리 A. baumannii 숙주의 염색체에 통합하면 다른 유출 펌프의 간섭을 우회하는 데 도움이 됩니다. 이 시스템은 특성화되지 않은 박테리아 유출 펌프를 조사할 뿐만 아니라 이러한 펌프를 표적으로 하는 잠재적 억제제의 효과를 평가하는 데에도 유용합니다.

Introduction

아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii )는 모든 종류의 항생제에 대한 내성으로 인해 세계보건기구(WHO)의 최우선 순위 병원체입니다¹. 주로 입원, 부상 또는 면역력이 저하된 사람들에게 영향을 미치는 기회 병원체입니다. A. baumannii 는 유출 펌프 를 통해 항생제를 주로 회피하며, 가장 관련성이 높은 것은 RND(Resistance-Nodulation-Division) 수출업체^{제품군입니다 2}. 이러한 유출 펌프가 기계적으로 어떻게 작동하는지 이해하면 표적 치료 옵션을 개발할 수 있습니다.

세포 과정을 구체적으로 구별할 수 있는 한 가지 일반적인 방법은 유전자 조작을 통해서입니다. 그러나 A. baumannii 유전자 연구에 사용할 수 있는 도구는 제한적이며, 실험 설계를 더욱 혼란스럽게 하기 위해 임상 분리물은 종종 유전자 조작에서 선택에 일상적으로 사용되는 항생제에 내성이 있습니다³. 특히 유출 펌프를 연구할 때 직면하는 두 번째 장애물은 종종 알려지지 않은 요인에 의해 엄격하게 규제되어 단일 펌프로 기능을 정확하게 분리하고 귀속시키기가 어렵다는 것입니다⁴. 연구 도구 상자를 확장해야 할 필요성을 인식하여 선택 마커 ^5,6,7을 제거할 수 있는 Flp 재조합 표적(FRT) 카세트를 통합하는 mini-Tn7 기반의 단일 복제 삽입 유도 발현 시스템을 개발했습니다(그림 1). 슈도모나스 ^8,9,10을 위해 처음 만들어진 이 우아한 클로닝 및 발현 시스템은 A. baumannii(ATCC 17978::ΔadeIJK,Δ adeFGH,Δ adeAB: 이하 A. baumannii AB258)의 RND 유출 펌프 결핍 균주에 단일 복제 유출 펌프 보완체를 생성하는 데 사용되었으며,¹¹. 한 번에 하나의 유출 펌프를 연구할 수 있고 높은 복제 발현으로 박테리아 세포를 압도하지 않을 수 있기 때문에(일반적으로 플라스미드 기반 발현 시스템에서 볼 수 있음) 간섭을 최소화하고 합병증을 줄이면서 각 유출 펌프의 중요한 생리학적 측면에 대해 더 잘 배울 수 있습니다.

이 논문은 mini-Tn7 시스템을 사용하여 9일 동안 수행된 일련의 복잡하지 않은 단계를 통해 A. baumannii AB258의 염색체에 삭제된 관심 유전자인 RND 유출 펌프 adeIJK를 보완하는 방법을 설명합니다⁷. 첫 번째 단계는 잘 보존된 glmS 유전자(그림 3A)의 단일 attTn7 삽입 부위에서 mini-Tn7 기반 삽입 플라스미드(그림 2A)에 클로닝된 삭제된 유출 펌프 유전자를 다시 도입합니다. 이 과정은 Tn7 유도 삽입에 필요한 transposase 유전자를 암호화하는 non-replicative helper plasmid (그림 2B)에 의해 촉진됩니다. 두 번째 단계는 FRT 부위 측면에 있는 겐타마이신 유전자의 Flp 재조합 효소 매개 제거를 위해 절제 플라스미드(그림 2C)를 사용하여 표시되지 않은 균주를 생성합니다(그림 3B). 이 시스템은 항생제 내성과 관련하여 RND 유출 펌프의 필수 역할과 가능한 억제제를 밝히는 데 사용되지만 관심 유전자를 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

Protocol

1. 실험 준비

1. 플라스미드 pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm⁹ (삽입 플라스미드, 그림 2A)를 관심 유전자로 정제합니다.
   참고: 여기서 관심 유전자는 adeIJK입니다. 최종 플라스미드 농도는 ≥100ng/μL입니다.
2. helper plasmid (pTNS2)⁹ 및 excision plasmid (pFLP2^ab)⁶ (각각 그림 2B,C)를 최종 plasmid DNA 농도 ≥100 ng/μL로 정제합니다.
3. 멸균 초순수 50mL와 멸균 LB(Lennox) 육수 25mL를 준비합니다( 재료 표 참조).
4. 각각 플레인(첨가제 없음), 50μg/mL의 겐타마이신(Gm), 200μg/mL의 카르베니실린(Cb)(암피실린 내성 유전자를 통한 선택용) 및 5% 자당( 재료 표 참조)과 같은 첨가제가 포함된 최소 10LB 한천 플레이트를 준비합니다.
5. LB 한천에 삽입하는 데 사용할 균주를 줄무늬 제거하고 37°C에서 16-18시간 동안 배양합니다. 여기서, A. baumannii AB258이 사용된다.
   알림: 이 프로토콜은 벤치 또는 생물 안전 캐비닛에서 Bunsen 버너를 사용하여 가능한 한 멸균 환경에서 수행해야 합니다. 모든 소모품(피펫 팁, 접종 루프, 마이크로퓨지 튜브 등)은 멸균해야 합니다.

2. 문화 준비

1. 멸균 접종 루프 또는 멸균 나무 접종 스틱을 사용하여 멸균 13mL 배양 튜브의 LB 육수 4mL에 A. baumannii AB258 단일 콜로니를 접종합니다.
   참고: 단일 4mL 배양액이 하나의 시료와 대조군에 사용됩니다. 필요한 샘플 수에 따라 배양 수를 늘립니다.
2. 37°C에서 진탕(250 rpm)하여 밤새 배양합니다.
3. 멸균 증류수(25-50mL) 한 병을 4°C에서 밤새 두어 3단계에서 사용합니다.

3. 전기 유능한 셀의 준비

1. 모든 멸균 1.5mL 마이크로프리지 튜브(배양액당 2개)와 멸균 전기천공법 큐벳(배양액당 2개)을 얼음 위에 놓습니다( 재료 표 참조). 절차 내내 샘플을 가능한 한 얼음 위에 두십시오.
2. 4 °C에서 보관된 멸균수 병을 얼음 위에 놓습니다.
3. 하룻밤 동안 배양된 박테리아 배양 1.5mL를 1.5mL 마이크로퓨지 튜브 중 하나에 옮깁니다.
4. 13,000 x g 에서 2분 동안 원심분리하여 세포를 펠트합니다.
   알림: 원심분리는 4°C에서 수행하는 것이 이상적이지만 주변 온도 원심분리는 허용되며 해롭지 않습니다.
5. 1mL 피펫을 사용하여 세포 펠릿을 방해하지 않고 모든 상층액을 제거합니다.
6. 동일한 미세분리 튜브에 1.5mL의 박테리아 배양액을 추가합니다. 13,000 x g 에서 2분 동안 원심분리한 다음 모든 상층액을 제거합니다.
7. 나머지 배양액 1mL로 마지막으로 3.6단계를 반복합니다.
8. 1mL의 얼음처럼 차가운 멸균수를 세포 펠릿에 넣고 펠릿이 더 이상 마이크로퓨지 튜브 바닥에 놓이지 않을 때까지 부드러운 피펫팅으로 재현탁합니다.
9. 재현탁 세포를 13,000 x g 에서 2분 동안 원심분리합니다.
10. 1mL 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 특히 세포가 덜 조밀한 펠릿을 형성하는 경향이 있는 후속 세척 단계에서 상층액을 붓지 마십시오.
11. 얼음처럼 차가운 멸균수로 이 세척 단계를 3.8단계부터 3.10단계까지 두 번 더 반복합니다.
12. 최종 세포 펠릿을 200μL의 얼음처럼 차가운 멸균수에 부드럽게 재현탁시킵니다.
13. 최종 셀 현탁액 100μL를 두 번째 얼음처럼 차가운 1.5mL 마이크로퓨지 튜브로 옮깁니다. 이 두 번째 부분 표본은 electroporation에 대한 음성 대조군이 될 것입니다. 세포 샘플을 얼음 위에 보관하십시오.

4. 전기천공법

1. 각 샘플에 대해 LB 육수 1mL와 LB + Gm⁵⁰ 한천 플레이트 1개(1.4단계에서 준비)를 예열하고 37°C로 설정된 정적 인큐베이터에서 대조군을 예열합니다.
2. 5 μL 이하의 결합 부피에서, pTNS2 helper plasmid 및 pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm-adeIJK insertion plasmid를 각각 100-200 ng를 electrocompetent cell의 분취액에 첨가합니다.
3. 손가락 끝으로 가볍게 두드려 혼합하여 기포를 발생시키지 않고 플라스미드와 전기 능력이 있는 세포가 완전히 혼합되도록 합니다.
4. 동일한 양의 멸균 증류수를 음성 대조군 세포 부분 표본에 넣고 위와 같이 부드럽게 혼합합니다.
5. 샘플을 얼음 위에서 20분 동안 배양합니다.
6. 전체 세포 샘플을 얼음처럼 차가운 전기천공법 큐벳으로 옮긴 다음 큐벳을 다시 얼음 위에 놓습니다. 음성 대조군 세포 샘플에 대해 반복합니다.
7. 세포 샘플을 전기합니다.
   1. electroporator를 켜고 2.0kV(25μF, 200 Ω)로 설정합니다( 재료 표 참조).
   2. 부드러운 티슈로 큐벳 표면을 닦아 붙은 얼음이나 습기를 제거합니다.
   3. 큐벳을 electroporator에 삽입하고 전기 충격을 가하십시오.
   4. 즉시 0.9mL의 미리 데워진 LB 육수를 큐벳의 세포에 추가하고 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 세포를 배지와 혼합합니다.
   5. 전체 세포 현탁액을 새로운 1.5mL 미세분리 튜브(실온)로 옮깁니다.
   6. electroporator의 시간 상수 값을 확인하십시오. 최상의 결과를 얻으려면 이 값이 4에서 6 사이여야 합니다.
8. 음성 대조군 세포 샘플에 대해 전기천공법 절차(4.7.1 - 4.7.6 단계)를 반복합니다.
9. 세포 회수를 위해 37°C에서 250rpm에서 1시간 동안 전기천공된 샘플을 배양합니다.
10. 접종 스프레더를 사용하여 각 전기천공법 셀 샘플 100μL를 예열된 LB + Gm⁵⁰ 한천 플레이트에 펴 바릅니다.
    1. 나머지 샘플을 13,000 x g 에서 2분 동안 원심분리하여 세포를 펠트합니다.
    2. 피펫을 사용하여 모든 상층액을 제거한 후 100μL의 LB 육수에 세포를 재현탁시킵니다.
    3. 각 전체 샘플을 미리 예열된 개별 LB + Gm⁵⁰ 한천 플레이트에 펼칩니다.
       참고: 전기천공법 효율은 변형률에 따라 달라질 수 있습니다. 변형을 처음으로 전기포칭할 때 전기천공법 샘플의 다양한 부피 또는 희석을 도금하여 결과 플레이트에 분리된 콜로니가 있는지 확인하는 것이 도움이 될 수 있습니다.
11. 플레이트를 37°C에서 16-18시간 동안 배양합니다.

5. PCR 기반 스크리닝을 위한 형질전환된 콜로니 선택

1. electroporation 플레이트를 확인하십시오. 네거티브 컨트롤에는 식민지가 없어야 합니다. 샘플에는 고유한 콜로니가 있어야 합니다.
   참고: 콜로니가 있는 플레이트는 이 단계와 콜로니 또는 패치가 있는 한천 플레이트가 생산되는 모든 후속 단계에서 진행하기 전에 최대 4°C에서 최대 3일 동안 보관할 수 있습니다.
2. 멸균 이쑤시개를 사용하여 LB + Gm⁵⁰ 한천 플레이트에서 최대 10개의 단일 콜로니를 선택하여 새 LB + Gm⁵⁰ 한천 플레이트에 패치합니다.
3. 플레이트를 37°C에서 16-18시간 동안 배양합니다.

6. 콜로니 PCR에 의한 염색체 삽입 확인

1. 패치된 콜로니가 들어 있는 LB + Gm⁵⁰ 한천 플레이트를 인큐베이터에서 제거합니다.
2. 멸균 이쑤시개 또는 멸균 피펫 팁을 사용하여 패치에서 0.2mL PCR 튜브에 있는 20μL의 멸균 증류수에 소량(큰 콜로니 크기)을 제거합니다. 잘 섞는다. 물 sample은 세포가 이쑤시개에서 방출될 때 눈에 띄게 뿌옇게 변해야 합니다. 스크리닝해야 하는 샘플을 원하는 수만큼 준비하되 6개면 충분합니다.
3. 박테리아 현탁액이 들어 있는 PCR 튜브를 100°C에서 5-10분 동안 배양합니다.
4. 미니 원심분리기( 재료 표 참조)를 사용하여 샘플을 고정된 최대 속도로 2분 동안 회전시켜 세포 파편을 펠릿화합니다.
5. 상층액을 새 0.2mL PCR 튜브로 옮기고 얼음 위에 놓습니다. 이 샘플에는 PCR 반응에 대한 템플릿 DNA가 포함되어 있습니다.
   참고: 이 템플릿 DNA는 PCR을 진행하기 전에 -20°C에서 보관할 수 있습니다.
6. 총 부피 25μL에서 1x 중합효소 완충액, 200μM dNTP, 0.18μM ABglmS2_F_New 순방향 프라이머, 0.18μM Tn7R 역방향 프라이머(표 1), Taq DNA 중합효소 1U 및 준비된 템플릿 DNA 1μL를 포함하는 PCR 반응 혼합물을 준비합니다. 템플릿 DNA를 제외한 모든 것을 포함하는 템플릿 없는 대조군(NTC)을 준비합니다( 재료 표 참조).
7. 반응 조건을 열 순환기에 입력: 95분 동안 2°C; 95초 동안 30°C, 49초 동안 30°C, 총 35주기 동안 72초 동안 30°C; 72분 동안 10°C; 12 °C 유지. 샘플을 실행합니다.
8. DNA 로딩 염료를 최종 농도 1x에 첨가한 후 각 PCR 반응의 10μL를 2% 아가로스 겔에 로드하고 80V에서 40분 동안 실행합니다. 이 프라이머 쌍의 예상 앰플리콘 크기는 382bp입니다. NTC에는 밴드가 없어야 합니다.
9. 예상 PCR 산물을 생산한 샘플을 식별합니다. PCR 양성 패치의 LB + Gm⁵⁰ 한천 플레이트에 줄무늬 플레이트를 준비합니다. 37 °C에서 16-18 시간 동안 배양합니다. 목표는 글리세롤 스톡을 준비하기 위해 단일 콜로니를 갖는 플레이트를 생성하여 이 표시된 균주를 보존하고 표시되지 않은 균주를 생성하기 위한 출발점으로 만드는 것입니다(아래 설명 참조).

7.pFLP2 ab를 이용한 Gm^R 마커 제거

1. 2단계: 문화권 준비에 설명된 절차를 따릅니다. 오버나이트 배양을 제조하기 위해 사용된 샘플은 단계 6.9에서 개별 콜로니를 생성하기 위해 제조된 LB+Gm⁵⁰ 한천 플레이트로부터의 단일 콜로니이다.
2. 3 단계 : 전기 능력 전지 준비에 언급 된 절차를 따르십시오. 전기천공법을 위해 하룻밤 배양에서 세포를 준비합니다.
3. 4단계: 전기천공법에서 언급한 절차를 따르십시오. 여기서 세포에 도입할 플라스미드는 pFLP2^ab (100-200 ng)이며, 이는 염색체로 삽입된 관심 유전자 옆에 있는 겐타마이신 내성 유전자를 제거합니다.
4. 세포가 1시간 동안 회복된 후(단계 4.9), 100μL의 전기천공된 세포 샘플을 예열된 LB +^{Cb 200} 한천 플레이트(단계 1.4에서 준비)에 퍼뜨립니다. 이러한 선택적 압력은 pFLP2^ab 절제 플라스미드를 보유한 세포만 성장하도록 합니다.
5. 플레이트를 37°C에서 16-18시간 동안 배양합니다.
6. 플레이트에 콜로니가 있는지 확인하십시오. 네거티브 컨트롤 플레이트에는 콜로니가 없어야 합니다. LB + Cb²⁰⁰ 한천 샘플 플레이트에는 뚜렷한 콜로니가 있어야 합니다.
7. 멸균 이쑤시개를 사용하여 LB + Cb²⁰⁰ 한천 플레이트 및 LB + Gm⁵⁰ 한천 플레이트에 최대 20개의 분리된 콜로니를 교차 패치합니다.
8. 플레이트를 37°C에서 16-18시간 동안 배양합니다.
9. 플레이트에 패치가 있는지 확인하십시오. LB + Cb²⁰⁰ 한천 플레이트에서 성장하지만 LB + Gm⁵⁰ 한천 플레이트에서 성장하지 않는 클론은 원래 삽입물에서 겐타마이신 내성 유전자가 제거되었습니다.
10. 박테리아에서 pFLP2^ab 플라스미드를 강제로 배출하는 5%(w/v) sucrose가 보충된 개별 LB 한천 플레이트에 카베니실린 내성 및 겐타마이신이 줄무늬가 생기기 쉬운 패치를 선택합니다. 최대 10개의 식민지를 선택할 수 있습니다.
11. 플레이트를 37°C에서 16-18시간 동안 배양합니다.
12. 플레이트에 콜로니가 있는지 확인하십시오.
13. pFLP2^ab 플라스미드 손실의 최종 확인으로서, 5% 슈크로스 플레이트에서 분리한 콜로니를 LB + Cb²⁰⁰ 한천 플레이트 및 LB 한천 플레이트에 교차 패치합니다.
14. 플레이트를 37°C에서 16-18시간 동안 배양합니다.
15. LB 한천 플레이트에서 성장하고 있는 클론을 선택하고, 이 표시되지 않은 균주를 보존하기 위해 글리세롤 스톡을 준비하기 위해 카르베니실린에 민감한 클론을 선택하십시오.
    1. 표시되지 않은 균주의 유전자 검증은 겐타마이신 내성 유전자를 표적으로 하는 프라이머를 사용하여 콜로니 PCR(6단계: 콜로니 PCR에 의한 염색체 삽입 확인)로 수행할 수 있습니다.
    2. 총 부피 25μL에 1x 중합효소 완충액, 200μM dNTP, 0.18μM Gm_F 순방향 프라이머, 0.18μM Gm_R 역방향 프라이머(표 1), Taq DNA 중합효소 1U 및 준비된 템플릿 DNA 1μL를 포함하는 PCR 반응 혼합물을 준비합니다. 템플릿 DNA를 제외한 모든 것을 포함하는 no-template control(NTC)을 준비하고, 표시된 균주의 DNA를 사용하는 양성 대조군.
    3. 반응 조건을 열 순환기에 입력: 95분 동안 2°C; 95초 동안 30°C, 50초 동안 30°C, 총 72회 주기 동안 40초 동안 35°C; 72분 동안 10°C; 12 °C 유지. 샘플을 실행합니다.
    4. DNA 로딩 염료를 최종 농도 1x에 첨가한 후 각 PCR 반응의 10μL를 1% 아가로스 겔에 로드하고 80V에서 40분 동안 실행합니다. 이 프라이머 쌍의 예상 앰플리콘 크기는 525bp입니다. 양성 대조군에는 단일 밴드가 있어야 합니다. 샘플과 NTC에는 밴드가 없어야 합니다.

Results

염색체 삽입 절차는 선택적 한천 플레이트에서 자라는 결과 콜로니를 확인하는 데 3일 동안 총 2시간밖에 걸리지 않습니다(그림 1A-C). 형질전환 플레이트에서 예상되는 콜로니의 수는 균주에 따라 달라진다: attTn7 부위에 Tn7을 삽입하는 것이 특이적이고 효율적이기 때문에 20-30개 또는 수백 개의 콜로니를 볼 수 있다⁹. 형질전환 플레이트 콜로니를 선택적 배지에 패치하면(그림 4A) 형질전환된 균주를 보존하고 콜로니 PCR 스크리닝을 위한 시작 물질을 제공합니다(그림 1E 및 그림 4B). PCR에 의한 콜로니의 스크리닝은 최소한으로 유지될 수 있습니다-10개 이상의 콜로니를 처리할 필요가 없으며 대부분은 삽입을 위한 긍정적인 결과를 산출해야 합니다. 스크리닝 프라이머용 PCR 산물, ABglmS2_F_New 및 Tn7R(표 1)은 382bp입니다(그림 4B 레인 4). 반응에 대한 음성 대조군에는 야생형 A. baumannii ATCC 17978(그림 4B 레인 2), AB258(그림 4B 레인 3) 및 주형 없음(그림 4B 레인 5)이 포함됩니다. PCR 양성인 콜로니는 보완되고 표시된 균주를 나타냅니다.

겐타마이신 내성 유전자 제거(unmarking)는 3시간 미만이 소요되며, 선택적 도금을 통해 절제 플라스미드로 형질전환된 세포를 선택한 다음 박테리아에서 절제 플라스미드를 경화해야 하기 때문에 6일에 걸쳐 진행됩니다(그림 1F). Flp-FRT 재조합 기반 절제는 정확하고 효과적이며 형질전환 플레이트에 ≥20개의 콜로니가 있어야 합니다. 카베니실린(절제 플라스미드에 의해 부여되는 β-락탐 내성 선택)과 겐타마이신(겐타마이신 내성 손실 선택)에 교차 패치된 콜로니는 모두 각각 카베니실린 내성 및 겐타마이신 민감성이어야 합니다. 절제 플라스미드는 5% 슈크로스 한천 플레이트에서 성장하여 박테리아 밖으로 밀려납니다. 슈크로스상의 성장은 플라스미드 상의 sacB 유전자가 박테리아^12,13에 독성이 있는 다당류인 레반(levan)으로의 슈크로스의 전환을 촉진함에 따라 세포가 pFLP2^ab를 제거하도록 강제한다. 5% 자당 배지에서 자라는 모든 콜로니는 일반 LB 한천 플레이트에서만 성장해야 합니다. 카베니실린 한천 플레이트에 성장이 없어야 합니다. 일반 LB 한천 플레이트에서 자라는 콜로니는 표시되지 않은 균주를 나타냅니다. 겐타마이신 마커의 손실 확인은 Gm_F 및 Gm_R 프라이머를 사용하는 콜로니 PCR을 통해 달성할 수 있습니다(표 1 및 그림 5). 이 프라이머 쌍은 양성 대조군에서만 525bp의 앰플리콘을 생성합니다(처음에 생성된 표시된 변형률, 그림 5 레인 4). 야생형 ATCC 17978(그림 5 레인 2), AB258(그림 5 레인 3), 테스트된 콜로니(그림 5 레인 5) 및 템플릿 없는 대조군(그림 5 레인 6)은 증폭을 나타내지 않아야 합니다.

표시되지 않은 균주가 확인되면 표현형 분석으로 기능 테스트를 시작할 수 있습니다. 여기서 명백한 첫 번째 선택은 다양한 항생제의 최소 억제 농도(MIC)를 결정하는 것입니다: 시프로플록사신은 AdeIJK의 알려진 기질이고, 테트라사이클린은 AdeIJK에 의해 제거될 수 있으며(주요 유출 펌프는 AdeAB임), 카나마이신은 A. baumannii ATCC 17978 ^2,14에 비교적 미미한 영향을 미칩니다. CLSI 가이드라인¹⁵에 따른 브로스 미세 희석 방법을 사용하여, 50μM IPTG의 부재 및 존재 하에서 보완된 표시되지 않은 균주 AB258::adeIJK를 각 항생제로 도전하였다; 야생형 균주 ATCC 17978 및 RND 유출 결핍 균주 AB258을 대조군으로 포함시켰다(표 2). 전반적으로, MIC 값에서 볼 수 있는 경향은 유출 펌프의 발현을 유도한 시프로플록사신 및 테트라사이클린에 대한 AB258::adeIJK의 예상 감수성 감소를 알려주며, adeIJK의 삽입이 성공적이었음을 확인합니다.

그림 1: 절차 개요. (A) 보완할 A. baumannii 균주의 하룻밤 배양액을 준비한다. (B) 하룻밤 배양된 세포를 원심분리를 통해 물로 3회 세척하고 얼음 위에 보관합니다. (C) 전달 및 도우미 플라스미드를 세포에 첨가하고 얼음 위에서 20분 동안 배양합니다. 샘플을 전기 천공하고, LB 배지를 첨가하고, 세포를 37°C에서 1시간 동안 회수합니다. 세포의 100 μL 부분 표본을 LB + Gm⁵⁰ 한천 플레이트에 펴고 37 °C에서 밤새 배양합니다. (D) 형질전환 플레이트로부터의 콜로니를 LB + Gm⁵⁰ 한천 플레이트에 패치하고 37°C에서 밤새 성장시킨다. (E) 패치된 콜로니는 염색체 삽입 부위에 걸쳐 있는 증폭 산물의 존재를 스크리닝하기 위해 PCR을 위해 준비됩니다. PCR 증폭은 아가로스 겔 전기영동에 의해 시각화됩니다. PCR 양성 샘플은 염색체에 관심 유전자를 성공적으로 삽입하고 현저한 균주를 생성했음을 나타냅니다. (F) 겐타마이신에 대한 양성 콜로니를 단계 (A-C)에서와 같이 준비하고, 염색체 삽입으로부터 겐타마이신 카세트를 제거하기 위해 pLFP2^ab 플라스미드의 전기천공법과 함께 제조한다. LB + Cb²⁰⁰ 한천에 대한 선택적 도금은 플라스미드의 흡수를 확인합니다. LB + Cb²⁰⁰ 및 LB + Gm⁵⁰ 한천 플레이트에 대한 중복 패치는 Cb^R 및 Gm^S인 콜로니를 나타내어 삽입에서 겐타마이신 카세트의 손실을 확인합니다. 5% 슈크로스에서 선택된 Cb^R 콜로니의 성장은 세포로부터 pLFP2^ab 플라스미드를 경화시킨다. 5% 슈크로스 플레이트로부터의 콜로니를 LB + Cb²⁰⁰ 한천 및 LB 한천에 패치하여 원하는 Cb^S 및 Gm^S 콜로니를 나타내고 표시되지 않은 균주의 생성을 확인합니다. Gm⁵⁰, 겐타마이신 50μg/mL; Cb²⁰⁰, 200 μg/mL의 카베니실린; ^R, 내성; ^S, 민감. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 이 프로토콜에 사용된 플라스미드. (A) pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm (삽입 플라스미드), (B) pTNS2 (도우미 플라스미드) 및 (C) pFLP2^ab (절제 플라스미드)의 일반 플라스미드 맵. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 삽입 및 마킹 해제의 개략도. (A) 삽입. A. baumannii 염색체의 단일 Tn7 삽입 부위는 glmS2 유전자 말단에서 24bp 떨어진 곳에 있습니다. 삽입 플라스미드와 도우미 플라스미드의 공전기천공법은 나머지 삽입 카세트(마커 절제를 위한 FRT 부위, 노란색; 겐타마이신 내성에 대한 accC1 유전자, 녹색; 유도성 발현을 위한 lacIq 유전자, 파란색)을 염색체로 변환합니다. (B) 표시 해제. pFLP2^ab 절제 플라스미드를 이용한 보완된 표시된 삽입 균주의 전기천공법은 Flp-FRT 재조합(FRT 부위, 노란색)을 통해 겐타마이신 내성 유전자(accC1, 녹색)의 제거를 용이하게 하여 표시되지 않은 균주를 생성합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: colony PCR에 의한 형질전환, 패치 및 삽입 확인. (A) 패치 후 형질전환 콜로니의 성장, (B) ABglmS_F_New(회색) 및 Tn7R(주황색) 프라이머를 사용한 콜로니 PCR 증폭을 통해 염색체 삽입을 확인한 대표적인 결과. 1번 레인: 저분자량 DNA 사다리; 레인 2: ATCC 179798; 3번 레인: AB258; 레인 4: AB258::adeIJK-LAC-Gm; 레인 5: 템플릿 없는 제어. 예상 대역인 382bp가 표시되어 있습니다. 겐타마이신 특이적 프라이머(Gm_F 및 Gm_R, 녹색)는 염색체 삽입을 확인하는 데에도 사용할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 콜로니 PCR에 의한 마커 손실 확인. pFLP^ab 기반 절제를 통해 항생제 마커의 손실을 확인하기 위한 겐타마이신 특이적 프라이머(Gm_F 및 Gm_R)를 사용한 콜로니 PCR 증폭의 대표적인 결과. 1번 레인: 저분자량 DNA 사다리; 레인 2: ATCC 179798; 3번 레인: AB258; 레인 4: AB258::adeIJK-LAC-Gm; 레인 5: AB258::adeIJK; 레인 6: 템플릿 없는 제어. 예상 대역인 525bp가 표시되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

균주, 플라스미드 및 프라이머	관련 특성	참조
얼룩
A. 바우마니 재질 보기 ATCC 17978	유형 변형	(주)에이티씨씨
A. 바우마니 ATCC 17978 AB258	ΔadeAB,Δ adeFGH,Δ adeIJK	11
플라스 미드
pUC18T-미니Tn7T-GM-LAC	GmR, 앰프R	9
pUC18T-miniTn7T-Gm-LAC-adeIJK	GmR, 앰프R, adeIJK	본 연구는
피TNS2	앰프R	9
피플랩2ab	pWH1266 원점 또는 복제, sacB, AmpR	7
뇌관	시퀀스(5′–3′)
ABglmS_F_New	CACAGCATAACTGGACTGATTTC	7
티엔7R	TATGGAAGAAGTTCAGGCTC	7
Gm_F	TGGAGCAGCAACGATGTTAC	본 연구는
Gm_R	TGTTAGGTGGCGGTACTTGG	본 연구는

표 1: 이 프로토콜에 사용된 박테리아 균주, 플라스미드 및 프라이머. GM, 겐타마이신; Amp, 암피실린; ^R, 내성.

	시프로플록사신		테트라사이클린		카나마이신
(주)아이피티지	−	+	−	+	−	+
재질 보기 ATCC 17978	0.250	nd	0.500	nd	1.5	nd
AB258 시리즈	0.031	nd	0.063	nd	4	nd
AB258::에이드IJK	0.016	0.063	0.031	0.125	8	2
변경 내용 접기		4.01		4.03		0.25

표 2: 항생제 감수성을 통해 삽입된 유전자의 기능 테스트. A . baumannii ATCC 17978, AB258, 유도되지 않은 AB258::adeIJK 및 IPTG 유도 AB258::adeIJK 에 대한 최소 억제 농도(MIC) 값을 시프로플록사신, 테트라사이클린 및 카나마이신에 대한 비교. 접힘 변화 = 유도 (+ IPTG) / 유도되지 않음 (− IPTG); nd = 결정되지 않음.

Discussion

A. baumannii에서 유도 가능한 단일 복제 유전자 발현 시스템의 염색체 삽입을 위한 이 절차는 기술적으로 간단하고 노동 집약적이지 않지만 강조해야 할 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 유능한 세포의 준비는 배지를 얼음처럼 차가운 물로 교체하는 동안 세포가 약해지기 때문에 가능한 한 얼음 위에서 수행되어야 합니다. 이상적으로는 원심분리 단계가 4°C에서 수행되지만 실온에서 원심분리가 허용됩니다. 물을 씻는 동안 세포의 취약성이 증가함에 따라 부드러운 피펫팅도 중요합니다. 둘째, 전기천공법은 이온의 존재에 민감합니다. 여러 차례의 펠릿화로 세포를 세척하고 물에 재현탁하면 배지가 완전히 제거됩니다. 또한, 플라스미드는 신선하게 정제해야 하며, 플라스미드 DNA 농도가 충분히 높은 경우 표준 키트 용출 완충액(일반적으로 TE 완충액)에서 용출될 수 있습니다. 최대 10μL까지 허용되어야 하지만 샘플의 이온 강도를 매우 낮게 유지하기 위해 100μL의 세포 현탁액에 <5μL의 플라스미드를 추가하는 것을 목표로 합니다. 셋째, 첨가된 항생제의 효능을 보장하기 위해 필요에 따라 선택적 한천 플레이트를 준비해야 합니다. 카베니실린(carbenicillin)은 절제 플라스미드(excision plasmid)인 pFLP2^ab의 형질전환 과정에서 선택을 위해 일반적인 암피실린 대신 사용되었다. A. baumannii는 아미노페니실린(암피실린)에 본질적으로 내성이 있습니다.¹⁶; 카르복시페니실린(carbenicillin)을 치환하면 플라스미드로 인코딩된 β-락타마제(lactamase)를 계속 선택할 수 있습니다.

실험 프로토콜의 최적화는 더 미묘하며 다른 종의 아시네토박터 (또는 동일한 종 내에서 유전적으로 조작된 균주)와 실험실에서 사용되는 특정 시약에 따라 다를 수 있습니다. 예를 들면, electroporation에 사용된 전압은 1.8와 2.5 kV 사이에서 변화할 수 있고, thermocycling 조건은 PCR를 위해 이용된 DNA 폴리메라이제에 따라서 경미하게 바뀔 필요가 있을지도 모릅니다. 전기천공법 후 세포가 잘 자라지 않는 경우 고려해야 할 유용한 힌트에는 한천 플레이트의 겐타마이신 농도를 50μg/mL에서 30μg/mL로 줄이거나 한천 플레이트의 배양 시간을 ≥24시간으로 연장하는 것이 포함됩니다. 겐타마이신 카세트를 제거하는 단계와 관련하여, 카베니실린 내성이 지속되는 경우 10% 슈크로스가 포함된 LB 한천 플레이트를 사용하거나 30°C에서 ≥24시간 동안 배양하는 것이 더 효과적일 수 있습니다.

전기천공법과 함께 사용하기 위한 수많은 A. baumannii 세포 전처리 방법을 문헌에서 찾을 수 있지만, 초기 야간 배양 후 과배양 단계와 규정된 광학 밀도에 대한 긴 성장 단계를 포함하는 경우가 많습니다. 우리는 단순한 하룻밤 문화가 효과적으로 사용될 수 있다는 것을 발견했습니다. A. baumannii의 전기천공법은 잘 설명되어 있으며, 독자들은 여기에서 프로토콜의 특정 측면에 대한 더 많은 통찰력을 얻을 수 있습니다^17,18. 플라스미드 기반 보완 시스템과 비교했을 때 이 mini-Tn7 염색체 유전자 보완 시스템의 주요 장점은 IPTG 제어 가능한 lacI^q 억제 시스템을 통해 보완된 유전자의 발현 수준을 조절할 수 있는 능력과 다음을 통해 겐타마이신 마커(aacC1 유전자)를 제거할 수 있다는 것입니다. 측면 FRT 사이트. 유출 펌프의 발현에 대한 세포의 내성은 삽입된 펌프에 따라 달라질 수 있음을 관찰했습니다. 예를 들어, 세포는 AdeABC 또는 AdeFGH에 비해 AdeIJK의 발현에 더 민감합니다. 이는 배양 조건에서 IPTG의 농도를 수정하여 해결할 수 있습니다. 항생제 마커를 제거하면 일정한 선택 압력으로 인한 균주에 대한 돌연변이 위험이 감소하고 무제한 항생제 감수성 조사가 가능해진다³.

이 mini-Tn7 시스템은 슈도모나스^9,10, 예르시니아⁹, 버크홀데리아¹⁹, 크산토모나스²⁰ 및 아시네토박터 ^5,6,21,22 종에 성공적으로 사용되어 왔지만 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 예를 들어, A. baumannii의 게놈⁵에는 기능적 attTn7 삽입 부위가 하나뿐이므로 여러 결실로 균주를 만들 수 있지만 한 번에 하나의 유전자만 보완할 수 있습니다. 또한, 이 시스템은 그람 양성 박테리아¹⁰에 대해 아직 효과가 입증되지 않았다.

RND 유출 펌프는 A. baumannii에서 항생제 내성의 중요한 촉진제입니다. 항생제를 매우 강력하게 만드는 것은 내막과 외막을 가로지르는 세 부분으로 구성된 구조로, 세포주위에서 세포 외부로 항생제를 제거할 수 있습니다. 가장 많이 연구되고 유비쿼터스 RND 펌프로 지정된 AdeABC, AdeFGH 및 AdeIJK는 모든 등급을 포괄하는 항생제를 제거하는 것으로 나타났습니다. 유출 펌프 기능을 자세히 설명하면 다제내성 균주에 대한 새로운 치료 옵션을 설계할 수 있는 좋은 출발점이 될 것입니다. AB258 삼중 RND 펌프 결실 균주를 사용하고 한 번에 하나의 펌프를 보완하면 각 펌프를 다른 펌프와 독립적으로 연구할 수 있으며, 각각의 고유한 기질 프로파일과 가장 효과적인 억제제를 식별할 수 있습니다. 물론, 유출 펌프는 박테리아의 정상적인 기능에서 "일상적인" 역할도 합니다. 이러한 역할을 이해하면 펌프가 간접적으로 마비될 수 있으며, 이는 항생제 유출을 방해하여 다제내성 박테리아를 다시 한 번 일반적으로 사용되는 항생제에 취약하게 만들 수 있습니다. 일반적으로, mini-Tn7 시스템은 상세한 연구를 위한 관심 유전자 또는 유용한 마커(예: 현미경 이미징을 위한 형광 단백질)를 도입하는 데 사용할 수 있다⁶.

다제내성 박테리아의 유병률 증가는 우리 모두의 관심사입니다. A. baumannii 와 같은 병원체에서 유출 펌프가 제공하는 보호 메커니즘을 이해하는 것은 심각한 감염을 퇴치하는 데 매우 중요합니다. 이 염색체 단일 복제 유전자 발현 시스템은 기계론적 연구뿐만 아니라 유출 펌프 기능을 방해하는 억제제를 식별하기 위한 강력한 도구입니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL PCR 튜브	VWR	20170-012	콜로니 끓는 준비 및 PCR 반응용
1.5 mL 마이크로분리 튜브	Sarstedt	72-690-301	범용
13-mL 배양 튜브, Pyrex	Fisher	14-957K	액체 배양 용기
6x DNA 로딩 버퍼	Froggabio	LD010	아가로스 젤 전기영동 시료 로딩 염료
아세트산 산, 빙하	Fisher	351271-212	Agarose 젤 실행 버퍼 구성 요소
Agar	Bioshop	AGR003	고체 성장 매체
Agarose	BioBasic	D0012	PCR 반응 생성물의 전기 영동 분리; 0.8&ndash의 농도에서 사용; 2%
아가로스 젤 전기영동 장치	Fisher	29-237-54	아가로스 젤 전기영동; PCR 반응 생성물
분리 카르베니실린	피셔	50841231	선택적 배지
배양 튜브 마개	Fisher	13-684-138	13-mL 배양 튜브용 스테인리스강 마개
데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트(dNTP) 세트	생물염기성	DD0058	PCR 반응 성분; 각각 100mM의 dATP, dCTP, dGTP, dTTP로 공급됩니다. 각 10mM에 대해 혼합 및 희석 dNTP
건식 수조/블록 히터	Fisher	88860023	Isotemp 끓이기 준비용 디지털 건식 수조
전기천공법 큐벳 VWR		89047-208	원형 캡이 있는 2mm 전기천공법 큐벳
전기천공기	Cole Parmer	940000009	110VAC, 60Hz 전기천공기
브롬화 에티듐	Fisher	BP102-1	아가로스 젤의 PCR 반응 생성물 및 DNA 마커의 시각화
에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)	VWR	CA-EM4050	아가로스 젤 실행 완충액 성분
겐타마이신	바이오베이직	GB0217	선택적 매체 제조용
글리세롤	피셔	G33	초저온 냉동고 인큐베이터에 장기 보관을 위한 박테리아 스톡 준비
(진탕)	New Brunswick Scientific	M1352-0000	Excella E24 인큐베이터 액체 배양 성장을 위한 셰이
커 인큐베이터(정적)	Fisher	11-690-550D	Isotemp 인큐베이터 오븐 모델 550D 고체(LB 한천) 배양 성장을 위한
접종 루프	Sarstedt	86.1562.050	한천 플레이트에 줄무늬 식민지
살포기	Sarstedt	86.1569.005	살포 한천 플레이트에 배양
용해 육수(LB) 육수, Lennox	Fisher	BP1427	액체 성장 매체(20 g/L: 5 g/L 염화나트륨, 10 g/L 트립톤, 5 g/L 효모 추출물)
시료	원심분리용 Fisher 75002431 Sorvall Legend Micro 17
원심분리기	Fisher	S67601B	0.2 mL PCR 튜브의 원심분리
페트리 접시	SPL Life Sciences	10090	고체 성장 매체 (한천 플레이트) : 90 x 15 mm
피펫	Mandel	다양한	Gilson 단일 채널 피펫 (P10, P20, P200, P1000)
전원 공급 장치	Biorad	1645050	PowerPac 전기영동 프라이머용 기본 전원 공급 장치
	IDT	NA	PCR 반응 성분; 관심 유전자에 특이적; 100 &mu에서 준비; M 제품 사양 시트에 지시된 바와 같이
Sucrose	BioBasic	SB0498	형질전환된 A. baumannii Taq DNA 중합효소에서 pFLP2ab 플라스미드 제거를 위한 반선택적 배지 제조
	FroggaBio	T-500	PCR 반응 성분; 10x 완충액과 함께 제공되는 중합효소
Thermal cycler	Biorad	1861096	Model T100 for PCR
이쑤시개	Fisher	S24559	한천 플레이트에 콜로니 패치용
Trizma base	Sigma	T1503	아가로스 젤 러닝 버퍼 구성 요소
초순수	Millipore Sigma	ZLXLSD51040	MilliQ 정수 시스템: 배지 및 용액 준비 및 세포 세척을 위한 초순수
광범위한 DNA 마커	Biobasic	M103R-2	아가로스 젤에 대한 PCR 산물의 크기 측정
목재 접종 스틱	Fisher	29-801-02	한천 플레이트의 콜로니로 배양 접종